CUPRINS

Cuprins................................................................................................1Justificarea alegerii temei de licen...................................................2Introducere..........................................................................................3

Partea nti - PARTEA DOCUMENTAR

Capitolul 1- Micotoxinele.......................................................................41.1- Ce sunt micotoxinele?.......................................................................41.2- Principalele tipuri de micotoxine.....................................................51.2.1- AflatoxinelePartea a doua PARTEA EXPERIMENTALCapitolul 1- Metode specifice de determinare cantitativa a micotoxinelor prin utilizarea testului de afinitate imunoenzimatica competitiva. 1. Determinarea reziduurilor de Dezoxinivalenol (DON).........Determinarea reziduurilor de Zearalenona (ZEA)...............

Determinarea reziduurilor de Aflatoxina Totala (AFT).......

Determinarea reziduurilor de Aflatoxina B1 (AFB1)..........

Determinarea reziduurilor de toxina T2...............................

Determinarea reziduurilor de Ochratoxina (OTA)...............

Capitolul 2- Cercetari asupra continutului de micotoxine din cereale si produse de panificatie, provenite de pe raza judetului Dolj, in anul 2011.

Justificarea alegerii temei de cercetare

In ultima perioada, micotoxinele au devenit un subiect de larg interes, atat pe plan local cat si in Uniunea Europeana. Acest fapt se datoreaza descoperirii micotoxinelor atat in alimentele pentru consumul uman cat si in furajele animalelor, in cantitati peste limitele maxim admise. Micotoxinele existente in mod natural in anumite produse alimentare reprezinta o problema acuta de interes in contextul sigurantei alimentare mai ales in anumite zone ale globului unde stantardele de calitate in agricultura si alimentatie publica se afla la un nivel precar. Acestea au un nivel de toxicitate foarte ridicat si pot provoca pagube insemnate atat in randul populatiei cat si in zootehnie. Organizaia pentru Alimente i Agricultur (FAO) estimeaz c pe plan mondial pn la 25 % din culturile alimentare sunt semnificativ contaminate cu micotoxine, motiv pentru care oamenii ar trebui sa acorde o insemnatate deosebita in cazul contaminarilor. Cele mai importante micotoxine care prezint riscuri semnificative pentru sntatea omului sunt sintetizate de mucegaiurile care cresc pe cereale, n special porumb, dar i gru, orz, ovz i orez.Un studiu numit "Sigurana alimentar", publicat n anul 2002 n colecia francez "tiine i tehnici alimentare", arat c Romania se afl printre rile infectate cu micotoxine. Din produsele autohtone analizate de francezi, jumtate muste au de asemenea substane ucigase. Capitolul "Romnia" din acest document e intitulat "Studiile Dutton - 1996" (adic studiile au fost fcute nc de la acea vreme), iar oamenii de tiin occidentali situeaz ara noastr n zona afectat de ceea ce ei au numit, cu 15 ani n urm, "sindromul balcanic". nc de atunci se tia c populaiile Romniei, Bulgariei i rile fostului spaiu iugoslav consum cereale puternic infectate cu ciuperci productoare de micotoxine, de tip "aflatoxin", n special cele care atac rinichii. De ce? n timp ce rile dezvoltate i-au creat tehnologii avansate pentru depozitarea alimentelor, tocmai pentru a preveni mbolnvirea populaiei cu micotoxine, rile srace, printre care i Romnia, nu au investit nimic n acest domeniu. n ar nu s-au fcut asemenea studii i nu s-a scos un cuvinel despre legtura dintre alimentele de pe piaa romneasc i aflatoxine. Singurele date despre noi nine ne pot da occidentalii, care spun ca cel puin jumtate din hrana pe care o punem zilnic pe mas conine substane cancerigene de tip aflatoxin.Date cu privire la doza de risc pentru oameni au fost obinute cu ocazia unor intoxicaii colective izbucnite, una n India n 1974 n cursul creia au fost afectate aproape 400 de persoane din care o treime au murit i alta n Kenia n 1982, unde au fost spitalizate 20 de persoane dintre care au decedat 12. Investigaiile din care aceste focare de aflatoxicoz au dus la concluzia c ele s-au datorat ingestiei repetate a unei cantiti de 38-55 micrograme de aflatoxin/kg corp mai multe zile la rnd.

Cercetrile fcute de veterinari americani, sugereaz c unii aditivi alimentari cum este BHT (butil-hidroxitoluen, sau E 321) ar putea fi folosii n viitor ca msur de protecie fa de efectele nedorite ale alimentelor contaminate cu aflatoxin. Vivacitatea i viteza de rspndire n condiiile naturale este uimitoare. De exemplu: dintr-un spor de Penicillium aflat pe un mediu nutritiv, must de mal cu agar, dup a doua zi de la germinarea acestuia s-au format 100.000 spori i n urmtoarele 24 ore nc 2OLE-objectspori. Pe un bob de gru mucegit cu Penicillium verrucosum var. Cyclopium s-au numrat 25 milioane spori. O portocal mucegit este purttoare a aproximativ 15 miliarde de spori.Aceasta lucrare are in vedere evidentierea metodelor de analiza si de determinare cantitativa a micotoxinelor la grau, paine, faina si produse de panificatie, precum si a sintezei datelor acumulate in urma analizelor efectuate.

Introducere

Dintotdeauna consumatorul a fost preocupat ca alimentele puse la dispoziia lui s fie sigure din punct de vedere igienico-sanitar, s nu i provoace mbolnviri.Astzi, aceast cerin a devenit tot mai insistent, ntruct consumul de alimente pregtite pe scara industrial a crescut foarte mult i deoarece, tot mai des, consumatorul afl c alimentele sunt cauza multor mbolnviri, uneori a unor decese, consumatorul este aadar vizat c nu n toate cazurile, alimentele consumate sunt de o calitate igienico-sanitar corespunzatoare. Contaminarea produselor cu mucegaiuri, ridic aspecte importante legate de pierderea inocuitii alimentului.Atenia deosebit acordat mucegaiurilor este datorat caracteristicilor anumitor specii de fungi de a elabora i elibera n aliment metabolii secundari numii micotoxine, care au o structur chimic mai mult sau mai puin cunoscut, dar i capacitatea dovedit de a modifica structuri normal biologice. Micotoxinele, ca metabolii ai anumitor tipuri de mucegaiuri au astfel efecte nocive att asupra sntaii omului, ct i asupra animalului care consum alimente contaminate cu acestea.Evoluia tehnicilor de recoltare i transformare a produselor agricole, transportul alimentelor pe distane lungi i prezentarea consumatorilor prin stocarea prelungit constituie condiii care dac sunt realizate necorespunztor, devin favorabile dezvoltrii microorganismelor nedorite i n particular, a mucegaiurilor.Micotoxinele sunt metabolii ai mucegaiurilor cu o structur chimic mai mult sau mai puin cunoscut care au capacitatea de a modifica structuri biologice anormale, cu efecte degradante att la om,ct i la animale. Aceste toxine pot fi coninute n sporii de mucegai sau de cele mai multe ori eliminate n substratul de cretere (aliment).

PARTEA DOCUMENTARCAPITOLUL 1MICOTOXINELE

1.1 Ce sunt Micotoxinele?

Micotoxinele sunt substane chimice produse de anumite specii de mucegaiuri: Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Trichothecium, etc. Ele pot fi puse n eviden i n sporii acestora sau n substratul pe care cresc fungii. Exist o varietate foarte mare de micotoxine, dar nu toate sunt importante din punctul de vedere al siguranei alimentaiei umane. Micotoxinele cele mai importante, cu riscuri semnificative pentru sigurana alimentaiei umane sunt: aflatoxinele, fumonisinele, ochratoxinele, patulina, trichotecina i ergotoxina.Toxicitatea lor este destul de mare i astfel cantiti foarte mici pot influena starea de sntate a organismului. Aproape toate micotoxinele sunt citotoxice putnd provoca spargerea membranelor celulare i s impiedice sau s influeneze sinteza ADN, ARN i a proteinelor.Termenul micotoxine a fost dat in 1961 dupa ce langa Londra (Anglia) aproximativ 100.000 de curcani au murit datorit unei boli misterioase numita "boala X a curcanilor". Ulterior s-a descoperit ca cei 100.000 de curcani au murit datorit arahidelor cu care acetia au fost hrnii. Arahidele erau contaminate cu metabolii secundari ai Aspergillus flavus(aflatoxin).Perioada 1961-1975 a fost denumit perioada de glorie a micotoxicologiei datorita fondurilor mari de care dispuneau oamenii de tiin pentru descoperirea acestor toxine ascunse.

Mai mult, toxina nu poate fi distrus prin fierbere sau prin metabolism. Astfel, un animal care a mncat porumb infectat transmite toxina mai departe la omul care consum carnea animalului sacrificat. Occidentalii au luat imediat msuri, n sensul c au dezvoltat o adevrat industrie a depozitrii, diferit pentru fiecare produs n parte. Un astfel de sistem de protecie n alimentaia public, numit HCCP - de exemplu - a fost preluat de la specialitii NASA, care l inventaser pentru securitatea cosmonauilor. Concomitent au adoptat o serie de msuri legislative care s protejeze piaa alimentar de produsele infectate cu toxina uciga. Fenomenul este n continuare studiat de specialitii occidentali, majoritatea rilor lumii fiind monitorizate din acest punct de vedere, acest lucru producnd efecte economice pentru cei ce ncalc legislaia securitii alimentare. In prezent aproximativ 300-400 de substane au fost catalogate ca micotoxine dar doar 20-30 de micotoxine sunt supravegheate de ctre autoritati, acestea fiind considerate cele mai toxice i cele mai rspandite.

MicotoxineMucegaiuri

Aflatoxina B1, B2,G1,G2 Aspergillus parasiticus,Aspergillus flavus

Ochratoxina A, B, C Aspergillus ochraceus,Aspergillus carbonarius, Penicillium verrucosum

Zearalenon Fusarium roseum, Fusarium sp.

Desoxinivalenol, Fusarenon,Toxina T2Fusarium tricinatum, Fusarium sp.

FumonisineF. moniliforme, F. proliferatum, Fusarium sp.

CitrininaP. citrinum

PatulinaP. patulum

Acidul penicilicA. ochraceus, A. Cyclopium

MoniliforminaA. proliferatum

Tabel 1. Specii fungice productoare de micotoxine

In general, micotoxinele intra in organism prin intermediul alimentelor contaminate dar mai pot intra si pe calea aerului sau prin contact direct cu pielea.Majoritatea micotoxinelor sunt rezistente la temperaturi ridicate (coacere, fierbere si in unele cazuri rezista si la prajire). Multe toxine rezista si la procesarea industriala a alimentelor de aceea pentru a avea alimente libere de micotoxine trebuie analizata materia prima (grau, lapte, legume, carne etc). Datorita faptului ca sunt rezistente la procesare acestea pot fi gasite in paine, cerealele de la micul dejun, vin, bere etc. Prin procesare doar se poate reduce cantitatea de micotoxine nu si eliminarea totala a acestora.

Micotoxinele se pot dezvolta n timpul cultivrii, transportului, depozitrii sau n alte momente pe parcursul produciei. Rezultatul final este ca acestea sunt gasite in foarte multe alimente (in special cele bazate pe cereale). Se considera ca micotoxinele prezinta risc alimentar mai mare decat aditivii, contaminantii sintetici si pesticidele.Mucegaiurile producatoare de micotoxine sunt foarte comune si pot creste pe foarte multe substraturi nutritive si in conditii climatice variate.In agricultura contaminarea recoltelor variaza de la an la an in functie de clima si alti factori de mediu. De exemplu aflatoxina este de obicei in cantitate mai mare in anii de seceta pentru ca atunci plantele sunt slabite si pot fi mai usor atacate de boli si daunatori.Se estimeaza ca un sfert din culturile, prezente la nivel mondial, sunt, intr-o oarecare masura,contaminate cu micotoxine.Consecintele economice al contaminarii cu micotoxine sunt grave. Recoltele cu cantitati mari de micotoxine sunt distruse sau aceste sunt folosite ca furaje pentru animale ceea ce poate duce la o dezvoltare slaba a animalelor sau chiar la deces. Daca recoltele folosite pentru furaje sunt contaminate atunci produse ca laptele si carnea vor contine toxine sau produsi de biotransformare. De exemplu vitele transforma aflatoxina in aflatoxina M1 ce este apoi secretata in lapte. In cazul porcinelor ochratoxina prezenta in hrana se acumuleaza in carnea acestora1.2- Principalele tipuri de micotoxine 1.2.1- Aflatoxina

Aflatoxinele sunt secretate de Aspergillus flavus, dar i de un numr mare de mucegaiuri printre care: Aspergillius ochraceus, Penicillium puberulum, diferii de penicilii i chiar Rizopus sp. Principalul productor rmne ns Aspergillius flavus, care are sporii galben-verzui i este lipsit de ascosporic. Se dezvolt bine pe semine oleaginoase i produse secundare rezultate de la fabricarea uleiului (srot, tre), n special pe arahide, dar i pe cereale. O ngrijorare justificat a aprut n condiiile

extinderii n alimenaia derivatelor proteice din leguminoase ca nlocuitori de lapte i carne, deoarece posibilitatea ngerrii aflatoxinelor de ctre populaie i n special de ctre copii a crescut foarte mult. Astfel s-au descris hepatite acute la copii n alimenaia crora s-au depistat cantiti mari de aflatoxine, ca urmare a folosirii de nlocuitori de lapte obinui din semine oleaginoase atacate de fungi.ntruct producia maxim de aflatoxine are loc la o incubare la 24-25 C, deci la temperaturi relative ridicate, acumularea aflatoxinelor este specific rilor cu clim cald.Aflatoxinele sunt reprezentate de patru fraciuni majore i o serie de fraciuni minore, toate derivai ai furofuranului cu nucleu cumarinic substituit, identificat dup fluorescen n lumina ultraviolet.Principalele fraciuni cunoscute sunt: B1, B2, G1, G2, M1, M2, B2 , P1. Toxicitatea maxim o prezint aflatoxina B1, urmat de G1, B2, i G2. Fraciunea P1, s-a dovedit a fi lipsit de toxicitate, n teste pe embrionii de gin i de asemenea fraciunile B2 i G2.Aflatoxinele au greuti moleculare mici, ceea ce le priveaz de proprietile antigenice. Ele sunt foarte termostabile, n schimb sunt stabile la aer i lumin.Aflatoxinele pot fi considerate ca fiind puternice hepatotoxice, hepatocancerigene i mutagene. De remarcat c toate vertebratele, de la om pn la peti, sunt sensibile la aflatoxine, ns n mod diferenial. La unele specii predomin efectul hepatotoxic, la altele cel hepatocancerigen.Mediul cel mai favorabil pentru formarea aflatoxinelor l reprezint arahidele i porumbul.

1.2.2- Ochratoxina

Ochratoxinele au fost identificate n numeroase produse alimentare de origine vegetal: porumb, gru, orez, ovz, orz, sorg, soia, leguminoase, cafea i pete srat, n concentraii pn la 2800 g/kg.Ochratoxina A se poate acumula n esuturi (rinichi, ficat, muchi) i se elimina prin lapte. Ca productori de ochratoxine au fost identificate specii de Aspergillus i Penicillium, i anume: Aspergillus ochraceus, Aspergillus alliaceus, Aspergillus melleus, Aspergillus ostianus, Aspergillus petrakii, Aspergillus sclerotiorum, Aspergillus sulphureus, Penicillium viridicatum, Penicillium commune, Penicillium Cyclopium, Penicillium palitans, Penicillium purpurescent, Penicillium variabile(19).Tulpinile de Aspergillus ochraceus, cu nalt toxicitate, sunt frecvente prezente n mediul natural. Exist posibilitatea unui sinergism ntre diferii fungi n producerea micotoxinei. Sunt poluate cu ochratoxine, n special, cerealele.Aspergillus ochraceus este un mucegai existent n sol care poate prolifera pe cereale i leguminoase: gru, porumb, orez, orz, secar, soia, arahide, mazare, etc. Necesit condiii de dezvoltare cu temperatur de 20-25 C i umiditate de peste 16%.Mucegaiurile care secret ochratoxina A produc i acid penicilic substan cancerigen cunoscut, efectele micotoxinelor fiind sinergice.

1.2.3- Tricotecene

Tricotecenele reprezint o clas de compui care include circa 40 de substane nrudite avnd ca structurde baz 12,13 - epoxitricotecenul. Ei sunt metabolii ai mai multor genuri de fungi imperfecti: Fusarium, Tricothecium, Mycothecium, Cephalosporium i Stahybotrys. Dintre aceste genuri rolul cel mai important revine lui Fusarium sp., deoarece afecteaz cel mai recent cerealele i seminele de leguminoase, n condiii climatice caracteristice. Aceste micotoxine, n rile din zona temperat, prezint un pericol mai mare dect aflatoxinele.Din cele 40 de tricotecene, numai 6 contamineaz produsele alimentare i furajere: toxina T-2, nivalenolul, dezoxinivalenolul, diacetoxinpenolul, tetraolul i neosolaniolul. Tricotecenele, n concentraii pn la 5000 g/kg, au fost gsite n porumbul i orzul mai multor ri.n intoxicaiile acute, tricotecenele provoac vomismente, slbiciune, diaree, tahicardie, hipotensiune i colaps. La nivelul tractusului intestinal se constata hemoragii, eroziuni i ulcere. Formele subacute se manifest prin leucopenie i anemie.Temperatura optim de producere a toxinelor este cuprins ntre 1,5 i 8C. Fluctuaiile brute la temperatur intensific mult biosinteza toxinelor. Acestea sunt termostabile, resistnd 18 ore la 110C i, ca urmare i manifest efectul i dup operaiile de coacere i fierbere.Tricotecenele afecteaza sistemul nervos, provocnd alterarea reflexelor, hiperestezic, deficien de orientare, dermografism i stri depresive.Toxina T-2 este pricipalul tricotecen care se formeaz pe porumb mucegit, dar poate fi identificat i pe alte cereale. Porumbul care se maturizeaz trziu sau are un coninut mare de apa este predispus la primul nghet alterrii de ctre fusarii i acumulri de toxin.Toxina T-2 provoac dizenterie mortal la mamifere i are un efect de reducere a coagulabilitii sngelui. Se manifest prin vomismente, gastro enterit cu dizenterie, scdere n greutate i moarte1.2.4- Zearalenona

Zearalenonele reprezint contaminani frecveni ai produselor cerealiere. n concentraii mari pn la 50 g/kg, toxinele s-au determinat n porumb, orz i gru n S.U.A., Canada, Australia, Japonia i n multe ri din Europa.Zearalenona F2 este elaborat de Fusarium roseum, respectiv de Giberella zeae, forma perfect a lui Fusarium roseum, dar i de alte fusarii i micei. S-au izolat i fraciunile F3, F1 i F5, dar cu aciune toxic mai redus.Zearalenonele sunt biosintetizate i la temperatur sczut, de 12C; ridicarea temperaturii la 25C sporete producerea de micotoxine. n doze mari au aciune estrogen, producnd avorturi la femelele gestante i sterilitatea.

Partea a doua

METODE SPECIFICE DE ANALIZA A MICOTOXINELOR

A. DETERMINAREA CANTITATIV A REZIDUURILOR DE DEOXINIVALENOL (DON) PRIN METODA ELISA

SCOP

Prezenta procedur stabilete modul n care se efectueaz determinarea reziduurilor de deoxinivalenol din cereale i furaje, prin teste imunoenzimatice competitive ELISA.Pentru cerine legale, rezultatele pozitive imunoenzimatice necesit confirmare printr-o metod de referin acceptat. Testul poate fi folosit n controlul calitii de rutin, n special cnd trebuie dovedit absena deoxinivalenolului.

ECHIPAMENTE DE INCERCARE SI MIJLOACE DE MASURARE- Balan tehnic tip Kern PLJ 4000-2M, utilizat pentru cntrirea (cu precizie de 10-2g) probelor ce vor fi analizate;Cititorul STAT FAX 2100 utilizat pentru citirea plcilor ELISA

Micropipete cu volum variabil 20-200 l i 200-1000 l, cu certificate de etalonare;

Micropipet multicanal cu volum de 300 l;

Pipete, baloane, cilindrii gradai, eprubete i sticlrie uzual de laborator (plnii simple, pahare, baghete);

Centrifuga de mas Hettich, ;

Moar de laborator pentru furaje

Vortex Maxi Mix II utilizat pentru agitarea probelor.

CONDITII SI/SAU ACTIUNI PREALABILE

Determinarea necesit urmtoarele materiale i reactivi:

1. Un test de afinitate imunoenzimatic ELISA; reactivii inclui n kit sunt suficieni pentru 96 de determinri (inclusiv analiza standardelor). Fiecare test conine:- Plac de microtitrare: 96 godeuri (12 stripsuri X 8 godeuri), cptuite cu anticorpi.- Standarde de Deoxinivalenol:5 fiole de sticl, fiecare conine 1,3 ml cu concentraia: 0 ng/ml; 3,7 ng/ml; 11,1 ng/ml; 33,3 ng/ml; 100 ng/ml, preparate n ap. Gata de utilizare (se va agita uor nainte de utilizare).- Conjugat (6ml) cu capac rou.Gata de utilizare.- Anticorpi anti Deoxinivalenol: 1 fiol ce conine 6 ml. Capac negru. Gata de utilizare.- Substrat/Cromogen: 1fiol ce conine 10 ml.Capac maro.Conine tetrametilbenzidin.- Soluie de stopare: 1 fiol ce conine 14 ml. Capac galben. Gata de utilizare.Conine acid sulfuric 1N.- Buffer de splare (sare): 1 plic pentru prepararea a 10 mM fosfat buffer (pH 7,4).Conine 0,05% Tween 20. Coninutul plicului se dizolv intr-un litru de ap distilat .Solutia preparat se pstreaz tip de 4 sptmni la 4 0 C.Alternativ: se dizolv coninutul plicului n 100 ml de ap distilat i se obine o soluie de 10 ori concentrat.Aceast solutie expir dup 8 sptmni de la data preaparrii.Pentru a abtine solutia de utilizare se dizolv o parte din soluia concentrat cu 9 pri ap distilat.

Reactivi:

- Ap distilat.

REGULI DE PROCEDURA

Notiuni generale

Metodele imunochimice se bazeaz pe capacitatea anticorpilor de a se lega de substane specifice. Asocierea reversibil dintre anticorpii antigenii corespondeni este denumit reacie imunologic. Forele de legtur implicate sunt interaciuni moleculare slabe. Reacia antigen-anticorp se bazeaz pe legea aciunii maselor, i cantitatea de antigen sau anticorp prezent n amestecul de reacie poate fi dedus din intensitatea reaciei.Pentru detectarea compuilor cu greutate molecular sczut, care posed numai o zon de legare a anticorpului (epitope), schema de testare competitiv este obligatorie. Pentru a face o distincie ntre compuii care nu au reacionat i cei complexai, majoritatea testelor folosesc att anticorpi (teste de competiie direct) sau antigen (teste de competiie indirect) legai de o faz solid imuno absorbant. n acest fel toi reactivii care nu se leag de anticorpi se pot elimina prin splarea fazei solide.

Pregatirea probelor

Cereale i furaje:

- intr-un pahar se cntresc 5 g de prob mcinat i omogenizat i se adaug 25 ml ap distilat;- se agit puternic timp de trei minute (manual sau la vortex);- se filtreaz pe hrtie de filtru Whatman Nr.1 ;- se utilizeaz 50 l n testul imunoenzimatic.*) se poate folosi i cantitate mai mare de prob dar volumul de ap trebuie adaptat:25 g n 125 ml de ap distilat sau 50 g n 250 ml de ap distilat.

Modul de lucru

Pentru determinare se folosesc mijloace de msurare i/sau ncercare prevzute la capitolul 6.1.- nainte de utilizare se aduc toi reactivii al temperatura camerei, iar dup utilizare se vor refrigera la temperatura de 2-80C.- Nu se va prelungi timpul de incubare.- Se insereaz un numr suficient de godeuri pe plac, numr care s corespund cu standardele i probele, ce vor fi lucrate n dublu.- Se pipeteaz 50 l din standarde si probe n duplicat.- Folosind o pipet multicanal, se adaug 50 l de enzim conjugat n fiecare godeu.- Folosind o pipet multicanal, se adaug 50 l soluie anticorp n fiecare godeu i se agit placa uor cu micri circulare pentru cteva secunde.- Se incubeaz 30 minute la temperatura camerei (20-250C). - Etapa de splare:- La sfritul incubrii se arunc lichidul afar din godeuri;- Se umplu complet toate godeurile cu 250 l buffer de splare de lucru folosind; se ndeprteaz soluia de splare afar din godeuri.- Se ndeprteaz picturile rmase prin taparea microplcii cu faa n jos puternic pe o hrtie de filtru; se repet etapa de splare de 3 ori. - Developarea:- Folosind o pipet multicanal, se adaug 100 l substrat/cromogen n fiecare godeu al microplcii i se agit placa uor pentru cteva secunde prin micri circulare.- Se incubeaz pentru 15 minute la temperatura camerei (20-250C).- Folosind o pipet multicanal, se adaug 100 l soluie de stopare n fiecare godeu i se agit placa uor pentru cteva secunde prin micri circulare.- Se msoar absorbana la 450 nm i se citete ntr-un interval de maxim 10 minute dup ce s-a adugat soluia de stopare.

Exprimarea rezultatelor

- Se calculeaz media absorbanelor pentru fiecare standard i prob;- Se divide valoarea mediei absorbanelor a fiecrui standard i fiecrei probe la media absorbanei Standardului 0 (B0) i se multiplic cu 100; maxima este astfel egal cu 100% i valorile absorbanelor sunt cotate n procente:

OLE-object

- Se introduc valorile calculate pentru fiecare standard ntr-un sistem logaritmic decoordonate funcie de concentraiile standardelor de Deoxinivalenol i se deseneaz curba standard;- Se interpoleaz valorile pentru fiecare prob care corespunde concentraiei din curba de calibrare;- Concentraia de deoxinivalenol prezent n prob n ppb este obinut din concentraia citit pe curba de calibrare multiplicar cu factorul de diluie;- Valorile astfel obinute pentru standarde i pentru probe sunt introduse n sistemul de coodonate al RIDA SOFT Win.

B. DETERMINAREA CANTITATIV A REZIDUURILOR DE ZEARALENONA (ZEA) PRIN METODA ELISA

SCOP

Prezenta procedura stabileste modul in care se efectueaza determinarea continutului zearalenona din cereale si furaje, prin teste imunoenzimatice competitive.Pentru cerinte legale, rezultatele pozitive imunoenzimatice necesita confirmare printr-o metoda de referinta acceptata. Testul poate fi folosit in controlul calitatii de rutina, in special cand trebuie dovedita absenta zearalenonei.

2. REGULI DE PROCEDURA PENTRU DETERMINAREA continutului DE ZEARALENONA PRIN TESTUL DE AFINITATE IMUNOENZIMATIC

Echipamente de incercare si mijloace de masurare

- Balanta analitica KERN ABJ 3070, numar de inventar 3092, numar de serie WBO0450201, utilizata pentru cantarirea probelor ce vor fi analizate- Cititorul STAT FAX 2100 utilizat pentru citirea plcilor ELISA cu numrul de inventar 3126, seria nr. 3200-1730- Micropipete cu capacitate maxima de 50 l, 300 l, 1000 l, cu certificat de etalonare.Micropipeta multicanal cu capacitate de 300 l.

Pipete, baloane, cilindrii gradati, cuve de centrifuga si sticlarie uzuala de laborator (palnii simple, pahare, baghete)

Centrifuga Hettich, nr.inventar 3113, seria 0032578-01-00;

Baie de ap termoreglabil Raypa cu numarul de inventar 1481, seria nr. 28593;

Vortex Maxi Mix II, nr.inventar 3127, serie nr. 1254050350037

Moara de furaje Grindomix GM 200 , numarul de inventar 3115, serie nr.125081224G;

Hirtie de filtru Whatman nr.1 sau echivalent.

Notiuni generale

Metodele imunochimice se bazeaza pe capacitatea anticorpilor de a se lega de substante specifice. Asocierea reversibila dintre anticorpii antigenii corespondenti este denumita reactie imunologica. Fortele de legatura implicate sunt ineractiuni moleculare slabe. Reactia antigen anticorp se bazeaza pe legea actiunii maselor, si cantitatea de antigen sau anticorp prezenta in amestecul de reactie poate fi dedusa din intensitatea reactiei.Pentru detectarea compusilor cu greutate moleculara scazuta, care poseda numai o zona de legare a anticorpului (epitope), schema de testare competitiva este obligatorie. Pentru a face o distinctie intre compusii care nu au reactionat si cei complexati, majoritatea testelor folosesc atat anticorpi (testele de competitie directa) sau antigen (testele de competitie indirecta) legati de o faza solida imunoabsorbanta. In acest fel toti reactivii care nu se leaga de anticorpi se pot elimina prin spalarea fazei solide.

Pregatirea probelor

Se realizeaza de catre personalul executant de incercare sub supravegherea responsabilului de incercare:Cereale si furaje:- 5 g prob bine omogenizat se pune intr-un container;se adaug 25 ml metanol/apa (70/30) si se mixeaz la vortex 3 min;

se centrifugheaza (10 min, 3500 r/min) sau se filtreaza extractul prin hirtie de filtru Whatman nr.1;

se dilueaza supernatantul sau filtratul 1:7 (1+6) cu tampon de dilutie probe

o poriune de 50 l din supernatantul sau filtratul este pipetat in godeul de testare.

MODUL DE LUCRU

Pentru determinare se folosesc mijloacele de masurare si/sau incercare prevazute la capitolul 5.Dupa pregatirea probelor se aduc toti reactivii la temperatura camerei, reactivi care imediat dupa utilizare vor fi adusi la temperatura de refrigerare intre 2 - 80C.

Conjugatul de zearalenona este furnizat in kitul de testare, sub forma concentrata. Acesta va fi diluat, in raport de 1:11 (1+10), cu ajutorul unei micropipette, cu solutia tampon de diluare conjugat.

Se insereaza un numar suficient de godeuri pe placa, numar care sa corespunda cu standardele si probele, ce vor fi lucrate in dublu.

Se adauga 50 l de solutii standard sau probe pregatite.

Se adauga 50 l de conjugat enzimatic diluat in toate godeurile.

Se agita usor si se incubeaza pentru 2 ore la temperatura camerei si la intuneric;

Se varsa lichidul din godeuri, se scutura bine pe o hartie absorbanta, pentru a indeparta complet lichidul din godeuri. Se umplu godeurile cu 250 l cu tampon de splare si se varsa lichidul din nou. Se repeta procedura de spalare de patru ori.

Se adauga 50 l de substrate si 50 l cromogen in fiecare godeu, se agit uor prin rotire citeva secunde, dupa care se incubeaza 30 minute la temperatura camerei la intuneric.

Se adauga 100 l de reactiv de stopare in fiecare godeu. Se agita bine si se masoara absorbanta la 450 nm. Se citeste intr-un interval de 30 minute maxim, dupa ce s-a adaugat solutia de stopare.

Exprimarea rezultatelor

Absorbanta standardului (sau a probei)/absorbanta zero a standardului x 100 = % absorbanta.Aceste calcule sunt efectuate de softul primit de la firma furnizoare a kitului.Valorile astfel obtinute pentru standarde si pentru probe sunt introduse in sistemul de coordonate al softului Tecnalab. Curba de calibrare trebuie sa fie linear virtuala la nivelele de valori 50 4050 ppt. Factorul de dilutie este intodus deja in soft pentru fiecare matrice.

C. DETERMINAREA CANTITATIV A REZIDUURILOR DE AFLATOXINA B1 (AFB1) PRIN METODA ELISA

ECHIPAMENTE DE INCERCARE SI MIJLOACE DE MASURARE

- Balan tehnic utilizat pentru cntrirea (cu precizie de 10-2g) probelor ce vor fi analizate;Cititorul ELISA utilizat pentru citirea plcilor

Micropipete cu volum variabil 20-200 l i 200-1000 l, cu certificate de etalonare;

Micropipet multicanal cu volum de 300 l;

Pipete, baloane, cilindrii gradai, eprubete i sticlrie uzual de laborator (plnii simple, pahare, baghete);

Centrifuga de mas Hettich

Moar de laborator pentru furaje

Vortex Maxi Mix II utilizat pentru agitarea probelor,

Sistem de extractie SPE, utilizat pentru purificarea probelor pe coloane de imunoafinitate,

Determinarea necesit urmtoarele materiale i reactivi:1. Un test de afinitate imunoenzimatic ELISA; reactivii inclui n kit sunt suficieni pentru 96 de determinri (inclusiv analiza standardelor). Fiecare test conine:- Plac de microtitrare: 96 godeuri (12 stripsuri X 8 godeuri), cptuite cu anticorpi anti- aflatoxina.- Std de Aflatoxina B1: 6 fiole de sticl brun, fiecare conine 1,3 ml aflatoxina B1 in metanol/apa cu concentraia: 0 ng/ml; 1 ng/ml; 5 ng/ml; 10 ng/ml; 20 ng/ml; 50 ng/ml. Capac alb. Gata de utilizare (se va agita uor nainte de utilizare).- Anticorpi anti Aflatoxina B1: 1 fiol ce conine 6 ml. Capac negru. Gata de utilizare.- Enzim conjugat: 1 fiol ce conine 6 ml. Capac rosu. Gata de utilizare.- Buffer de splare: 1 plic ce conine 0,05%tween 20 pentru prepararea a 10 mM fosfat buffer (pH 7,4). Se dizolva intreaga cantitate de sare intr-un litru apa distilata.Solutia gata de utilizare este valabil 4-6 saptamni la 2-8 0C.Alternativ: Se dizolv coninutul plicului in 100 ml de apa distilata pentru a obtine o solutie de 10 X concentrata. Aceasta solutie este valabila 8-12 saptamani la temperatura camerei.Se dilueaza 1 parte din solutia concentrata cu 9 parti apa distilata pentru a obtine solutia de utilizare.- Substrat/Cromogen: 1 flacon ce conine 10 ml. Gata de utilizare; aceast soluie este sensibil la lumin: se va ine departe de lumina direct. Capac albastru. Gata de utilizare.- Soluie de stopare: 1 fiol ce conine 14 ml. Capac galben. Gata de utilizare.2.Coloane de imunoafinitate pentru aflatoxineSunt ideale pentru probele dificile precum nucile, condimentele, mirodeniile, frunzele de ceai.Coloanele conin o suspensie gel de care sunt ataati anticorpii monoclonali in mod covalent de care se leaga eventualele urme de aflatoxina din proba.Folosind metanol ca eluent aflatoxinele vor fi eliberate de complexul antigen-anticorp.Metanolul produce o denaturare aanticorpilor, de aceea antigenul este eliberat si poate fi eluat.3. Reactivi: - Metanol.- Solutie Metanol 70%: se obine prin agitarea a 70 ml metanol pur cu 30 ml de apa distilata- Tween 20- Ap distilat.

REGULI DE PROCEDURANotiuni generale

Metodele imunochimice se bazeaz pe capacitatea anticorpilor de a se lega de substane specifice. Asocierea reversibil dintre anticorpii antigenii corespondeni este denumit reacie imunologic. Forele de legtur implicate sunt interaciuni moleculare slabe. Reacia antigen-anticorp se bazeaz pe legea aciunii maselor, i cantitatea de antigen sau anticorp prezent n amestecul de reacie poate fi dedus din intensitatea reaciei.Pentru detectarea compuilor cu greutate molecular sczut, care posed numai o zon de legare a anticorpului (epitope), schema de testare competitiv este obligatorie. Pentru a face o distincie ntre compuii care nu au reacionat i cei complexai, majoritatea testelor folosesc att anticorpi (teste de competiie direct) sau antigen (teste de competiie indirect) legai de o faz solid imuno absorbant. n acest fel toi reactivii care nu se leag de anticorpi se pot elimina prin splarea fazei solide.

Pregatirea probelorMetoda direct (fara purificare pe coloane de imunoafinitate)

Probele trebuie sa fie pastrate in locuri racoroase, protejate de lumin. Pentru ca o proba sa fie reprezentativ, trebuie foarte bine mixata inainte de procedura de extracie.

se cantaresc 5 g de prob mcinat cu 25 ml metanol 70 %

se amestec 10 min

se filtreaza extractul cu ajutorul hartiei de filtru

se dilueaza 1 ml de filtrat cu 1 ml de apa distilata

se utilizeaza 50 l de filtrat diluat per godeu

Factorul de diluie 10 pentru probe este deja considerat.Concentraiile de aflatoxina B1 din probe pot fi citite direct de pe curba standard.

2. Metoda cu purificare pe coloana de imunoafinitate

Cereale, furaje, nuci, arahide, alune, stafide- se amestec 5 g prob macinata cu 25 ml metanol 70%- se amesteca 10 min- se filtraza extractul cu ajutorul hartiei de filtru - se adauga 15 ml apa distilata la 5 ml filtrat- se trece cantitatea prin coloana (20 ml)

Separarea cu coloanele RIDASe aduc coloanele la temperatura camerei inainte de folosire.a. se echilibreaza coloana spaland-o cu 2ml apa distilatab. se umple coloana cu 1 ml extractc. se ataseaza un adaptor la partea superioara a coloanei; se foloseste o seringa ca adaptord. se umple seringa cu filtrat e. se trece extractul incet si continuu prin coloana aplicand o presiunef. se colecteaza solutia.g. se clateste coloana cu 10 ml apa distilatah. se colecteaza solutia.i. se aplica aer pentru a elimina solutia tamponj. se indeparteaza seringa si se aplica o eprubeta sub coloanak. se elueaza cu 0,5 ml metanol 100 % care trebuie sa treaca incet (1picatura/sec) pentru a asigura eluarea completal. daca eluatul trece prea repede, se colecteaza si se trece din nou pe coloanam. se trece aer prin coloana 30 sec.Determinare:- se dilueaza eluatul obtinut din coloana 1:3 (1+2) cu apa distilata - se folosesc 50 l per godeu.Factorul de dilutie este 0,15.Modul de lucruPentru determinare se folosesc mijloace de msurare i/sau ncercare prevzute la capitolul 6.1.- nainte de utilizare se aduc toi reactivii al temperatura camerei, iar dup utilizare se vor refrigera la temperatura de 2-80C.- Nu se va prelungi primul timp de incubare.- Se insereaz un numr suficient de godeuri pe plac, numr care s corespund cu standardele i probele, ce vor fi lucrate n dublu.- Se pipeteaza 50 l din fiecare standard/prob, n godeuri apropiate.- Folosind o pipet multicanal, se adaug 50 l de enzim conjugat n fiecare godeu.- Folosind o pipet multicanal, se adaug 50 l soluie anticorp n fiecare godeu si se agit placa uor cu micri circulare pentru cteva secunde.- Se incubeaz 30 minute la temperatura camerei (20-250C). - Etapa de splare:- La sfritul incubrii se arunc lichidul afar din godeuri;- Se umplu complet toate godeurile cu buffer de splare de lucru folosind pentru colectare o sticl; se ndeprteaz soluia de splare afar din godeuri.- Se ndeprteaz picturile rmase prin taparea microplcii cu faa n jos puternic pe o hrtie de filtru; se repet etapa de splare de 2 ori. - Developarea:- Folosind o pipet multicanal, se adaug 100 l de substrat/cromogen n fiecare godeu al microplcii i se agit placa uor pentru cteva secunde prin micri circulare.- Se incubeaz pentru 15 minute la temperatura camerei (20-250C), la intuneric.- Folosind o pipet multicanal, se adaug 100 l soluie de stopare n fiecare godeu i se agit placa uor pentru cteva secunde prin micri circulare.- Se msoar absorbana la 450 nm i se citete ntr-un interval de maxim 60 minute dup ce s-a adugat soluia de stopare.

Exprimarea rezultatelor

- Se calculeaz media absorbanelor pentru fiecare standard i prob;- Se divide valoarea mediei absorbanelor a fiecrui standard i fiecrei probe la media absorbanei Standardului 0 (B0) i se multiplic cu 100; maxima B0 este astfel egal cu 100% i valorile absorbanelor sunt cotate n procente:

OLE-object

- Se introduc valorile calculate B/B0 pentru fiecare standard ntr-un sistem logaritmic decoordonate funcie de concentraiile standardelor de Aflatoxin B1 i se deseneaz curba standard;- Se interpoleaz valorile B/B0 pentru fiecare prob care corespunde concentraiei din curba de calibrare;- Concentraia de aflatoxin prezent n prob n ppb este obinut din concentraia citit pe curba de calibrare multiplicat cu factorul de diluie;- Aceste calcule sunt efectuate de softul primit de la firma furnizoare a kitului;- Se evalueaza rezultatele cu RIDASOFT Win

D. DETERMINAREA CANTITATIV A REZIDUURILOR DE AFLATOXINA TOTALA (AFT) PRIN METODA ELISA

SCOP

Prezenta procedur stabilete modul n care se efectueaz determinarea reziduurilor de aflatoxina totala din cereale, furaje, nuci, arahide, alune, atafide, condimente, mirodenii i frunze de ceai, prin teste imunoenzimatice competitive ELISA.Pentru cerine legale, rezultatele pozitive imunoenzimatice necesit confirmare printr-o metod de referin acceptat. Testul poate fi folosit n controlul calitii de rutin, n special cnd trebuie dovedit absena aflatoxinei totale.6.1.ECHIPAMENTE DE INCERCARE SI MIJLOACE DE MASURARE

- Balan tehnic tip Kern PLJ 4000-2M, numr de inventar 3165, numr serie WL074233utilizat pentru cntrirea (cu precizie de 10-2g) probelor ce vor fi analizate;

Cititorul STAT FAX 2100 utilizat pentru citirea plcilor ELISA cu numrul de inventar 3126, seria nr. 3200-1730

Micropipete cu volum variabil 20-200 l i 200-1000 l, cu certificate de etalonare;

Micropipet multicanal cu volum de 300 l;

Pipete, baloane, cilindrii gradai, eprubete i sticlrie uzual de laborator (plnii simple, pahare, baghete);

Centrifuga de mas Hettich, nr. inventar 3113, seria 0032578-01-00;

Moar de laborator pentru furaje Grindomix GM 200, nr. de inventar 3115, seria 125081224 G;

Vortex Maxi Mix II utilizat pentru agitarea probelor, cu numrul de inventar 3127, seria nr.1254050350037.

Sistem de extractie SPE, utilizat pentru purificarea probelor pe coloane de imunoafinitate, cu nr. de inventar 3121, seria nr.28000505.

6.2.CONDITII SI/SAU ACTIUNI PREALABILEDeterminarea necesit urmtoarele materiale i reactivi:1. Un test de afinitate imunoenzimatic ELISA; reactivii inclui n kit sunt suficieni pentru 96 de determinri (inclusiv analiza standardelor). Fiecare test conine:- Plac de microtitrare: 96 godeuri (12 stripsuri X 8 godeuri), cptuite cu anticorpi anti- aflatoxina.- Std de Aflatoxina B1: 6 fiole de sticl brun, fiecare conine 1,3 ml aflatoxina B1 in metanol cu concentraia: 0 ng/ml; 0,5 ng/ml; 1,5 ng/ml; 4,5 ng/ml; 13,5 ng/ml; 40,5 ng/ml. Capac alb. Gata de utilizare (se va agita uor nainte de utilizare).- Anticorpi anti Aflatoxina : 1 fiol ce conine 0,7 ml. Solutie concentrata. Capac negru.- Enzim conjugat: 1 fiol ce conine 0,7 ml. Solutie concentrata.Capac rosu.- Buffer pentru dilutie standarde, probe, conjugat si anticorp : - Substrat - 1 flacon ce conine 7 ml. Gata de utilizare; aceast soluie este sensibil la lumin: se va ine departe de lumina direct. Capac verde. Gata de utilizare.- Cromogen - 1 flacon ce conine 7 ml. Gata de utilizare; aceast soluie este sensibil la lumin: se va ine departe de lumina direct. Capac albastru. Gata de utilizare.- Soluie de stopare: 1 fiol ce conine 14 ml. Capac galben. Gata de utilizare.2.Coloane de imunoafinitate pentru aflatoxineSunt ideale pentru probele dificile precum nucile, condimentele, mirodeniile, frunzele de ceai.Coloanele conin o suspensie gel de care sunt ataati anticorpii monoclonali in mod covalent de care se leaga eventualele urme de aflatoxina din proba.Folosind metanol ca eluent aflatoxinele vor fi eliberate de complexul antigen-anticorp.Metanolul produce o denaturare anticorpilor, de aceea antigenul este eliberat si poate fi eluat.3. Reactivi: - Metanol.- Solutie Metanol 70%: se obine prin agitarea a 70 ml metanol pur cu 30 ml de apa distilata- Tween 20- Ap distilat.

6.3.REGULI DE PROCEDURA

6.3.1.Notiuni generale

Metodele imunochimice se bazeaz pe capacitatea anticorpilor de a se lega de substane specifice. Asocierea reversibil dintre anticorpii antigenii corespondeni este denumit reacie imunologic. Forele de legtur implicate sunt interaciuni moleculare slabe. Reacia antigen-anticorp se bazeaz pe legea aciunii maselor, i cantitatea de antigen sau anticorp prezent n amestecul de reacie poate fi dedus din intensitatea reaciei.Pentru detectarea compuilor cu greutate molecular sczut, care posed numai o zon de legare a anticorpului (epitope), schema de testare competitiv este obligatorie. Pentru a face o distincie ntre compuii care nu au reacionat i cei complexai, majoritatea testelor folosesc att anticorpi (teste de competiie direct) sau antigen (teste de competiie indirect) legai de o faz solid imuno absorbant. n acest fel toi reactivii care nu se leag de anticorpi se pot elimina prin splarea fazei solide.

6.3.2.Pregatirea probelor

Se realizeaz de ctre personalul executant de ncercare sub supravegherea responsabilului de ncercare.

Metoda direct (fara purificare pe coloane de imunoafinitate)

Probele trebuie sa fie pastrate in locuri racoroase, protejate de lumin. Pentru ca o proba sa fie reprezentativ, trebuie foarte bine mixata inainte de procedura de extracie.Cereale i furaje:se cantaresc 2 g de prob mcinat cu 10 ml 70 %

se amestec 10 min

se filtreaza extractul cu ajutorul hartiei de filtru

se dilueaza 100 l de filtrat cu 600 l de buffer dilutie

se utilizeaza 50 l de filtrat diluat per godeu

Factorul de diluie este 35.Not: Daca se asteapta o concentratie mai mare de aflatoxina, proba trebuie diluata folosind un amestec de buffer de dilutie/metanol (9 ml buffer dilutie + 1 ml metanol 100% ).In momentul pipetarii in godeu, proba trebuie sa contina 10% metanol.

2. Metoda cu purificare pe coloana de imunoafinitate

Cereale, furaje, nuci, arahide, alune, stafide- se amestec 5 g prob macinata cu 25 ml metanol 70%- se amesteca 10 min- se filtraza extractul cu ajutorul hartiei de filtru - se adauga 15 ml apa distilata la 5 ml filtrat- se trece cantitatea prin coloana (20 ml)

Condimente, mirodenii si frunze de ceai- se amestec 5 g prob macinata cu 25 ml metanol 70%- se amesteca 10 min- se filtraza extractul cu ajutorul hartiei de filtru - se adauga 15 ml apa distilata la 5 ml filtrat- se adauga 0,25 ml tween 20 si se amesteca 2 min- se trece cantitatea prin coloana (20 ml)

Separarea cu coloanele RIDASe aduc coloanele la temperatura camerei inainte de folosire.a. se echilibreaza coloana spaland-o cu 2ml apa distilatab. se umple coloana cu 1 ml extractc. se ataseaza un adaptor la partea superioara a coloanei; se foloseste o seringa ca adaptord. se umple seringa cu filtrat e. se trece extractul incet si continuu prin coloana aplicand o presiunef. se colecteaza solutia.g. se clateste coloana cu 10 ml apa distilatah. se colecteaza solutia.i. se aplica aer pentru a elimina solutia tamponj. se indeparteaza seringa si se aplica o eprubeta sub coloanak. se elueaza cu 0,5 ml metanol 100 % care trebuie sa treaca incet (1picatura/sec) pentru a asigura eluarea completal. daca eluatul trece prea repede, se colecteaza si se trece din nou pe coloanam. se trece aer prin coloana 30 sec.Determinare:- se dilueaza eluatul obtinut din coloana 1:10 (1+9) cu buffer dilutie din test (ex: 50l + 450 l buffer dilutie)- se folosesc 50 l per godeu.Factorul de dilutie este 5.6.3.3. Modul de lucru

Pentru determinare se folosesc mijloace de msurare i/sau ncercare prevzute la capitolul 6.1.Implementarea testului.- nainte de utilizare se aduc toi reactivii al temperatura camerei, iar dup utilizare se vor refrigera la temperatura de 2-80C.- Nu se va prelungi primul timp de incubare.Enzima conjugata (capac rosu) pentru aflatoxina este concentrata.Din momentul diluarii solutia are o stabilitate limitata, de aceea trebuie reconstituita numai cantitatea necesara in momentul utilizarii.Inainte de diluare, enzima conjugata concentrata trebuie agitata usor.Pentru reconstituire, conjugatul concentrat este diluat 1:11 (1+10) in buffer de dilutie (ex. 200 l concentrat + 2 ml buffer dilutie, suficient pentru 4 stripsuri).Anticorpul anti-aflatoxina (capac negru) pentru aflatoxina este concentrat .Din momentul diluarii solutia are o stabilitate limitata, de aceea trebuie reconstituita numai cantitatea necesara in momentul utilizarii.Inainte de diluare, anticorpul anti aflatoxina concentrat trebuie agitat usor.Pentru reconstituire, anticorpul concentrat este diluat 1:11 (1+10) in buffer de dilutie (ex. 200 l concentrat + 2 ml buffer dilutie, suficient pentru 4 stripsuri).Standardele de aflatoxina concentrate au urmatoarele concentratii:Standard 1 .......... 0 ppbStandard 2 ...........0,5 ppbStandard 3 ...........1,5 ppbStandard 4 ...........4,5 ppbStandard 5 ...........13,5 ppbStandard 6 ...........40,5 ppbFiecare standard concentrat va fi diluat (1+9) cu buffer de dilutie si agitat cu grija, conform urmatorului tabel:

Standard gata de utilizarepptStandard ConcentratVolumul de standard concentratVolumul de standard buffer dilutie

Standard 1Standard 2Standard 3Standard 4Standard 5Standard 60501504501350405012345650 l50 l50 l50 l50 l50 l+ 450 l+ 450 l+ 450 l+ 450 l+ 450 l+ 450 l

- Se insereaz un numr suficient de godeuri pe plac, numr care s corespund cu standardele i probele, ce vor fi lucrate n dublu.- Se pipeteaza 50 l din fiecare standard/prob, n godeuri apropiate.- Folosind o pipet multicanal, se adaug 50 l de enzim conjugat n fiecare godeu.- Folosind o pipet multicanal, se adaug 50 l soluie anticorp n fiecare godeu si se agit placa uor cu micri circulare pentru cteva secunde.- Se incubeaz 30 minute la temperatura camerei (20-250C), la ntuneric.- Etapa de splare:- La sfritul incubrii se arunc lichidul afar din godeuri;- Se umplu complet toate godeurile cu apa distilata de lucru folosind pentru colectare o sticl; se ndeprteaz apa distilata din godeuri.- Se ndeprteaz picturile rmase prin taparea microplcii cu faa n jos puternic pe o hrtie de filtru; se repet etapa de splare de 2 ori. - Developarea:- Folosind o pipet multicanal, se adaug 50 l de substrat si 50 l cromogen n fiecare godeu al microplcii i se agit placa uor pentru cteva secunde prin micri circulare.- Se incubeaz pentru 30 minute la temperatura camerei (20-250C), la intuneric.- Folosind o pipet multicanal, se adaug 100 l soluie de stopare n fiecare godeu i se agit placa uor pentru cteva secunde prin micri circulare.- Se msoar absorbana la 450 nm i se citete ntr-un interval de maxim 30 minute dup ce s-a adugat soluia de stopare.

6.3.4.Exprimarea rezultatelor

- Se calculeaz media absorbanelor pentru fiecare standard i prob;- Se divide valoarea mediei absorbanelor a fiecrui standard i fiecrei probe la media absorbanei Standardului 0 (B0) i se multiplic cu 100; maxima B0 este astfel egal cu 100% i valorile absorbanelor sunt cotate n procente:

OLE-object

- Se introduc valorile calculate B/B0 pentru fiecare standard ntr-un sistem logaritmic decoordonate funcie de concentraiile standardelor de Aflatoxin i se deseneaz curba standard;- Se interpoleaz valorile B/B0 pentru fiecare prob care corespunde concentraiei din curba de calibrare;- Concentraia de aflatoxin prezent n prob n ppb este obinut din concentraia citit pe curba de calibrare multiplicat cu factorul de diluie;- Aceste calcule sunt efectuate de softul primit de la firma furnizoare a kitului;- Se evalueaza rezultatele cu RIDASOFT Win

E. DETERMINAREA CONTINUTULUI DE TOXINA T-2/HT-2 prin metoda imunoenzimatica competitiva

SCOP

Procedura stabileste modul n care se efectueaz ncercarea pentru determinarea micotoxinelor T2/HT2 in produse alimentare de origine nonanimala (cereale, preparate pe baza de cereale, produse cerealiere).

Toxina T2/HT2 - apartine grupului trihotecenelor si este formata de fungii din genul Fusarium. Toxina T-2/HT-2 este prezenta in alimente de origine vegetala.Datorita formei citotoxice si imunosupresive este o amenintare pentru sanatatea umana si animalaMetoda imunoenzimatica utilizata Este o metoda cantitativa pentru determinarea contaminarii cu toxina T2/HT2 prin test imunoenzimatic competitiv al probelor de alimente de origine nonanimala(cereale,preparate pe baza de cereale, produse cerealiere) si furaje.

DESCRIEREA PROCEDURII

Echipamente de incercare si mijloace de masurare

- Balanta analitica KERN ABJ 3070, numar de inventar 3092, numar de serie WBO0450201, utilizata pentru cantarirea probelor ce vor fi analizate- Cititorul STAT FAX 2100 utilizat pentru citirea plcilor ELISA cu numrul de inventar 3126, seria nr. 3200-1730- Micropipete cu capacitate maxima de 50 l, 300 l, 1000 l, cu certificat de etalonare.Micropipeta multicanal cu capacitate de 300 l.

Pipete, baloane, cilindrii gradati, cuve de centrifuga si sticlarie uzuala de laborator (palnii simple, pahare, baghete)

Centrifuga Hettich, nr.inventar 3113, seria 0032578-01-00;

Baie de ap termoreglabil Raypa cu numarul de inventar 1481, seria nr. 28593;

Vortex Maxi Mix II, nr.inventar 3127, serie nr. 1254050350037

Moara de furaje Grindomix GM 200 , numarul de inventar 3115, serie nr.125081224G;

Materiale auxiliare:

Pipete gradate (5,10, 25ml) clasa A

Pahare Berzelius 50ml, 100ml, 250ml, clasa A

Pahare Erlenmayer 50, 100, 250, 500ml, clasa A

Baloane cotate de 100,1000ml clasa A

Cilindri gradati (100ml, 200ml), clasa A

Palnii de sticla

Varfuri micropipete( 10-300microlitri, 100-1000 microlitri, 1000-5000microlitri)

Cupe centrifuga de unica folosinta (50ml), Alicote (micronixuri), Eprubete de sticla de 10ml

Hartie filtru,

Spatula , pensa, foarfeca, cutit, lingurite plastic, folie aluminiu, manusi

Vata, tifon, alcool sanitar, hipoclorit de sodiu

REACTIVI SI MATERIALE

Modul de analiza, acceptare si inregistrare a cererilor de incercare (analiza) este conform cu M.C. si P4.4.02Receptia, verificarea, circuitul, inscriptionarea si esantionarea probelor de analizat se face conform M.C. si P4.3.01.Determinarea necesita urmatoarele materiale si reactivi:48 de godeuri captusite cu anticorpi

48 de godeuri de amestecare, marcate cu rosu5 flacoane marcate cu etichete de culoare galbena, continand urmatoarele controale (standarde de) toxina T-2 :0 ppb, 25 ppb, 50 ppb, 100 ppb si 250 ppb (vezi precautiile de manipulare pentru solutia de metanol)1 flacon marcat cu eticheta de culoare albastra, continand solutia de conjugat pentru toxina HT-2 HRP1 flacon marcat cu eticheta de culoare verde, continand solutia de substrat K-Blue. 1 flacon marcat cu eticheta de culoare rosie, continand solutia de stopare Redreactivi:

metanol p.a.

PBS Buffer;

REGULI DE PROCEDURA

Notiuni generale

Kit-ul Toxina T-2/HT-2 are la baza o reactie ELISA directa de competitie care permite utilizatorului sa obtina concentratiile exacte pentru fiecare din toxinele T-2/HT-2, exprimate in parti per billion (ppb), sau o combinatie a celor doua. Toxina T-2 sau HT-2 libera care se afla in proba de analizat, sau in controale (standarde) intra in competitie cu conjugatul imunoenzimatic de toxina HT-2 pentru ocuparea site-urilor de legare aleanticorpilor. Dupa un pas de spalare, se adauga substratul, care reactioneaza cu conjugatul fixat, dezvoltand o reactie de culoare albastra. Cu cat intensitatea culorii albastre este mai mare, cu atat concentratia de toxina T-2/ HT-2 este mai mica. Citirea densitatilor optice se realizeaza cu ajutorul unui cititor de microgodeuri ELISA. Cu ajutorul densitatilor optice ale standardelor se obtine curba de calibrare (standard), si densitatile optice ale probelor sunt proiectate pe curba pentru a calcula concentratia exacta a toxinelor T-2/HT-2.

Pregatirea probelor

Inainte de inceperea extractiei, proba teste macinata si omogenizata utilizand dispozitive mentionate la punctul 6.1.Pana in momentul efectuarii analizei, probele trebuie pastrate la temperatura de 28C. Solutie de extractie pentru proba: se prepara o solutie metanol 70% prin amestecarea a 7 parti metanol cu 3 parti apa distilata sau deionizata, pentru fiecare proba care trebuie testata.Se macina proba. Extrageti o ratie de 1 parte proba cu 5 parti 70% methanol. Exemplu: amestecati 5 grame de proba macinata cu 25 ml de metanol 70% si agitati energic timp de 3 minute (sau 2 minute la blender).Filtrati extractul prin trecerea a cel putin 5 ml printr-un filtru Whatman nr 1 (sau cu ajutorul unei seringi de filtrare Neogen) si colectati filtratul ca proba. Diluati filtratul 1:1 (ex: 1 ml cu 1 ml) cu apa distilata, sau deionizata si amestecati.Proba este acum gata pentru testare.

MODUL DE LUCRU

Inainte de utilizare, lasati reactivii sa ajunga la temperatura camerei ( 1830C).

Desprindeti cate un godeu marcat cu rosu pentru fiecare proba de testat, plus 5 godeuri marcate cu rosu pentru standarde si plasati-le pe suportul pentru godeuri.

Desprindeti un numar egal de godeuri captusite cu anticorpi. Introduceti imediat inapoi in ambalajul cu material desicant, godeurile captusite cu anticorpi ce nu vor fi utilizate. Resigilati ambalajul, pentru a asigura protectia

anticorpilor. Marcati primul strip cu 1 si asezati-l pe suport, cu extremitatea marcata, spre stanga. Nu faceti nici un marcaj pe interiorul sau la baza godeurilor.

Inainte de utilizare, omogenizati flacoanele de reagenti.

Adaugati 100 l de conjugat din flaconul marcat cu eticheta albastra in fiecare godeu de amestecare.

Utilizand de fiecare data un varf nou de pipeta, transferati 100 l din fiecare standard, respectiv din fiecare proba de analizat in godeurile de amestecare, dupa modelul de mai jos:

0 25 50 100 250 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 Strip 1S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 Strip 2

Utilizand o pipeta cu 12 canale, omogenizati lichidul din godeuri prin aspirare si evacuare de 3 ori succesiv.

Transferati 100 l din amestec in godeurile captusite cu anticorpi. Omogenizati prin miscarea inainte inapoi a stripurilor de godeuri pe o suprafata plana, timp de 10 20 secunde, avand grija ca reagentii sa nu iasa din godeuri.

Incubati timp de 5 minute la temperatura camerei (1830C). Goliti godeurile de amestecare marcate cu rosu.

La sfarsitul acestei perioadei, reactia initiala este completa. Indepartati prin scuturare continutul godeurilor captusite cu anticorpi.

Spalati godeurile prin umplere cu apa distilata sau deionizata si golire ulterioara. Repetati acest pas de 5 ori,dupa care uscati godeurile prin intoarcerea si lovirea lor de o suprafata plana pe care este situat hartie de filtru,pana cand este indepartata intreaga cantitate de apa.

Pipetati cantitatea necesara de substrat din flaconul marcat cu eticheta verde. Atasati varfuri noi la pipeta cu 12canale si pipetati 100 l de substrat in godeuri. Omogenizati prin miscarea inainte inapoi a stripurilor de godeuri pe o suprafata plana, timp de 10-20 secunde.

Incubati timp de 5 minute la temperatura camerei (18-30C). Aruncati cantitatea de substrat ramasa in recipientul pentru reagenti si clatiti-l cu apa.

Pipetati solutia de stopare din flaconul marcat cu eticheta rosie (acelasi volum pe care l-ati pregatit si din substrat). Utilizand aceleasi varfuri de pipeta ca si pentru substrat adaugati 100 l de solutie de stopare in fiecare godeu. Omogenizati prin miscarea inainte inapoi a stripurilor de godeuri pe o suprafata plana; aruncati varfurile de pipeta utilizate.

Uscati baza godeurilor prin stergerea cu un prosop de hartie; plasati stripurile de godeuri intr-un cititor de microgodeuri cu filtru de 650 nm. Bulele de aer trebuie eliminate, pentru ca ele pot afecta citirea rezultatelor.

Rezultatele trebuie citite intr-o perioada de 20 de minute imediat urmatoare adaugarii solutiei de stopare.

Cititi absorbantele cu ajutorul unui microcititor. Calculati rezultatele utilizand software-ul Neogen pentru Windows.

Exprimarea rezultatelor

Rezultatul analitic trebuie sa fie inregistrat ca: xUunde: x este rezultatul analitic, iar U este incertitudinea de masurare extinsa.Rezultatul analitic se inregistreaza sub forma corectata pentru recuperare. Se precizeze nivelul de recuperare.U este incertitudinea de masurare extinsa, utilizand un factor de acoperire k=2, pentru un nivel de incredere de 95%.Rezultatele se exprima in g/Kg, cu 2 zecimale.Rezultatele sub limita de detectie se exprima nedetectabilRezultatele sub limita de cuantificare se exprima < LOQRezultatele mai mari decat LOQ se exprima prin rotunjire la a-2- zecimala corectate cu procentul de recuperare

F. DETERMINAREA CONTINUTULUI DE OCHRATOXINA A (OTA) prin metoda imunoenzimatica competitiva

SCOP

Prezenta procedura stabileste modul in care se efectueaza determinarea continutului ochratoxina A din cereale, cafea si vin prin teste imunoenzimatice competitive.Pentru cerinte legale, rezultatele pozitive imunoenzimatice necesita confirmare printr-o metoda de referinta acceptata. Testul poate fi folosit in controlul calitatii de rutina, in special cand trebuie dovedita absenta ochratoxinei.

Echipamente de incercare si mijloace de masurare

- Balanta analitica KERN, utilizata pentru cantarirea probelor ce vor fi analizate- Cititorul STAT FAX 2100 AWARENESS utilizat pentru citirea placilor ELISA;- Micropipete cu capacitate maxima de 50 l, 300 l, 1000 l, cu certificat de etalonare.Micropipeta multicanal cu capacitate de 300 l.

Pipete, baloane, cilindrii gradati, cuve de centrifuga si sticlarie uzuala de laborator (palnii simple, pahare, baghete)

Centrifuga Hattich,;

Baie de ap termoreglabil;

Vortex Maxi Mix II

Moara de furaje Grindomix GM 200 ;

Sistem de extractie SPE, utilizat pentru purificarea probelor pe coloane de

imunoafinitate,.Hirtie de filtru Whatman nr.1 sau echivalent.

Conditii si/ sau actiuni prealabile

Determinarea necesita urmatoarele materiale si reactivi:1 test de afinitate imunoenzimatic ELISA, fiecare test contine materiale suficiente pentru 96 de masuratori (incluzand analiza standardelor), fiecare test continand:

1 placa ce contine 12 stripuri fiecare cu cate 8 godeuri= 96 de godeuri captusite cu anticorpi de ochratoxina A

6 solutii standard de ochratoxina A ( 1,3 ml fiecare) cu urmatoarele concentratii: 0 ppt, 50 ppt, 100 ppt, 300 ppt, 900 ppt, 1800 ppt.

Conjugatul enzimatic concentrat (0,7 ml) adica antigenul marcat sau enzima marcat

Substratul /Cromogen (contine tetrametilbenzidina), o sticlu de 10 ml.

Reactiv de stopare, (14 ml), contine acid sulfuric 1N.

Solutia tampon (7 ml) pentru diluarea conjugatului

Solutia tampon pentru spalare (10mM tampon fosfat, pH 7,4)

reactivi:

HCl 1N

Diclormetan

Tampon de carbonat acid de sodiu 0,13 M (NaHCO3), pH 8,1

Metanol

Tampon fosfat de sodiu 0,4 M, pH 7,5 (60 g Na2HPO4 xH2O, 8,8 g NaH2PO4xH2O se dizolva in 900 ml apa distilata, se ajusteaza pH-ul la 7,5 si se aduce la 1 litru cu apa distilata, solutia este stabila 2 saptamani la tem.camerei)

Notiuni generale

Metodele imunochimice se bazeaza pe capacitatea anticorpilor de a se lega de substante specifice. Asocierea reversibila dintre anticorpii antigenii corespondenti este denumita reactie imunologica. Fortele de legatura implicate sunt ineractiuni moleculare slabe. Reactia antigen anticorp se bazeaza pe legea actiunii maselor, si cantitatea de antigen sau anticorp prezenta in amestecul de reactie poate fi dedusa din intensitatea reactiei.Pentru detectarea compusilor cu greutate moleculara scazuta, care poseda numai o zona de legare a anticorpului (epitope), schema de testare competitiva este obligatorie. Pentru a face o distinctie intre compusii care nu au reactionat si cei complexati, majoritatea testelor folosesc atat anticorpi (testele de competitie directa) sau antigen (testele de competitie indirecta) legati de o faza solida imunoabsorbanta. In acest fel toti reactivii care nu se leaga de anticorpi se pot elimina prin spalarea fazei solide.

Pregatirea probelor

Se realizeaza de catre personalul executant de incercare sub supravegherea responsabilului de incercare:

Cereale si furaje:- 2 g prob bine omogenizat se pune intr-un containerde centrifuga;se adaug 5 ml HCl 1N si se mixeaz la vortex 5 min;

se adaug 10 ml CH2Cl2 si se agita viguros 15 min;

se centrifugheaza 15 min, 3500 r/min;

se indeparteaza complet stratul apos de deasupra si se filtreaza proba cu CH2Cl2 intr-un nou tub de centrifuga;

se adaug un volum echivalent stratului diclormetanic de tampon carbonat 0,13 M, pH 8,1 si se agita viguros 15 min;

se centrifugheaza 15 min, 3500 r/min;

se dilueaza 100 l din faza apoasa de deasupra cu 400 l de tampon carbonat 0,13 M, pH 8,1;

o poriune de 50 l este pipetat in godeul de testare.

Vin:Se folosesc coloane de imunoafinitate pentru Ochratoxina A se dilueaza 1 ml de vin cu solutie tampon fosfat de sodiu 0,4 M, pH 7,5

se echilibreaza coloana cu 1 5 ml PBS,

se aplica proba de vin (2 ml),

se spala coloana cu aprox.10 ml PBS,

se aplica aer 2 min.pentru a indeparta urmele de reziduu,

se elueaza proba incet cu 1 ml metanol 100%,

se evapora eluatul;

se reconstituie cu 4 ml NaHCO3 0,13 M; pH 8,1

se folosesc 50 l pentru pipetare in godeu.

MODUL DE LUCRU

Pentru determinare se folosesc mijloacele de masurare si/sau incercare prevazute la capitolul 5.Dupa pregatirea probelor se aduc toti reactivii la temperatura camerei, reactivi care imediat dupa utilizare vor fi adusi la temperatura de refrigerare intre 2 - 80C.

Conjugatul de ochratoxina A este furnizat in kitul de testare, sub forma concentrata. Acesta va fi diluat, in raport de 1:11 (1+10), cu ajutorul unei micropipette, cu solutia tampon de diluare conjugat.

Se insereaza un numar suficient de godeuri pe placa, numar care sa corespunda cu standardele si probele, ce vor fi lucrate in dublu.

Se adauga 50 l de solutii standard sau probe pregatite.

Se adauga 50 l de conjugat enzimatic diluat in toate godeurile.

Se agita usor si se incubeaza pentru 30 min. la temperatura camerei si la intuneric;

Se varsa lichidul din godeuri, se scutura bine pe o hartie absorbanta, pentru a indeparta complet lichidul din godeuri. Se umplu godeurile cu 250 l cu tampon de splare si se varsa lichidul din nou. Se repeta procedura de spalare de patru ori.

Se adauga 100 l de substrate / cromogen in fiecare godeu, se agit uor prin rotire citeva secunde, dupa care se incubeaza 15 minute la temperatura camerei la intuneric.

Se adauga 100 l de reactiv de stopare in fiecare godeu. Se agita bine si se masoara absorbanta la 450 nm. Se citeste intr-un interval de 30 minute maxim, dupa ce s-a adaugat solutia de stopare.

Exprimarea rezultatelor

Absorbanta standardului (sau a probei)/absorbanta zero a standardului x 100 = % absorbanta.Aceste calcule sunt efectuate de softul primit de la firma furnizoare a kitului.Valorile astfel obtinute pentru standarde si pentru probe sunt introduse in sistemul de coordonate al softului Tecnalab. Curba de calibrare trebuie sa fie linear virtuala la nivelele de valori 50 1800 ppt. Factorul de dilutie este intodus deja in soft pentru fiecare matricile.

Capitolul 2- Cercetari asupra continutului de micotoxine din cereale si produse de panificatie, provenite de pe raza judetului Dolj, in anul 2011.

2.1- Dezoxynivalenol (DON)2.1.a- Gru La analizele efectuate la gru, dintr-un total de 52 probe, rezultatele au iesit cu valori nedetectabile pentru 31 din acestea, iar cele cu valori detectabile s-au situat intre valorile 21g/kg si 467g/kg cu o medie de 95g/kg.2.1.b- Fin La analizele efectuate la fin, dintr-un total de 24 probe, rezultatele au avut valori nedetectabile pentru 14 dintre acestea, iar cele cu valori detectabile s-au situat intre valorile 23 si 964 cu o medie de 274. De asemenea s-a gasit si o valoare de 1215, peste limita maxima admisa, pentru care s-au luat masurile specifice necesare.2.1.c- PineLa analizele efectuate pentru pine, dintr-un total de 21 probe, rezultatele au aratat valori nedetectabile pentru 10 dintre acestea, cele cu valori detectabile situndu-se intre valorile 20 si 847 cu o medie de 238. O valoare 11402.1.d- Produse panificatieLa analizele efectuate pentru produsele din panificatie, dintr-un total de 47 probe, rezultatele au avut valori nedetectabile pentru 13 dintre acestea, iar cele detectabile s-au situat intre valorile 3 si 815 cu o medie de 118.

2.2- Zearalenona