Cariotipul uman

Genes per chromosomeGenes per chromosome

Cromozomi = elemente esentiale ale nucleului celular, suportul genelor.

Organism Nr. cromozom

OM 46 CIMPANZEU 48 CAINE 78 CAL 64 PUI 78 PISICA 38 SOARECE 40 BOVINE 60 DROSOPHILA 8

Numarul lor intr-un nucleu este fix pentru fiecare specie.

Perechi autozomi Sex cromozomi

Diploid Nr. de Nr. de X Y

(2n) metacentrici acrocentrici

Pisica 38 16 2 M M

Caine 78 0 38 M A

Porc 38 12 6 M M

Capra 60 0 29 A M

Oaie 54 3 23 A M

Vaca 60 0 29 M M

Cal 64 13 18 M A

M – Metacentric; A – Acrocentric

Telomeres

Centromeres

p arm

q arm

Telomeres

Telomeres

TELOMER

Satelit

CENTROMER

CONSTRICTIE SECUNDARA

q

p

morphology of chromosomes.

Satellite

Centromere(primary constriction)

arm

Secondary constriction

telomere

Chromatid

P

q

Criterii de identificare, numerotare si clasificare a cromozomilor.

Talia cromozomilor (1,5-10 microni)L.r.c = p+q/22A+X .1000 Pozitia centromerului si lungimea bratelor.i.c = p/p+q .100r = q/pd = q-p Prezenta constrictiilor secundare si a

satelitilor.

TIPURI DE CROMOZOMI(dupa raportul lungimii bratelor)

cromozomi metacentrici q=p cromozomi submetacentrici (p=1/3L) cromozomi acrocentrici (p=1/10L)

q= (lungimea) bratul(ui) lung al cromozomului

p= (lungimea) bratul(ui) scurt al cromozomului

Cu ocazia conferintei de citogenetica umana de la Denver-California din anul 1960 s-a stabilit un sistem unic de clasificare a cromozomilor omului, numit sistemul Denver.

In conformitate cu acest sistem, cei 46 de cromozomi sunt impartiti in sapte grupe, fiecare dintre ele cuprinzand un numar variabil de cromozomi.

Dupa descoperirea cariotipului uman, cercetarile de citogenetica umana au luat un mare avant, reusind sa stabileasca nu numai aspectele normale ale cariotipului ci si o serie de aberatii cromozomale in cazul unor maladii ereditare, ale tumorilor maligne etc.

Chromosomes in a somatic cell

Sex chromosomes

autosome

Pentru analiza cromozomilor si intocmirea cariotipului este necesara stimularea diviziunii celulelor prin cultura celulara in vitro.

Tehnica intocmirii cariotipului se face pornind de la limfocite stimulate cu phytohemaglutinina, diviziunea e blocata in matafaza cu ajutorul colchicinei ( inhibitorul fusului de diviziune), celulele sunt supuse apoi hipotonizarii ( clorura de potasiu) in vederea eliberarii nucleilor si dispersarii cromozomilor si in final sunt fixate cu solutie de alcool-acid acetic glacial, etalate pe lama si colorate.

Metoda citogenetica de rutină foloseste culturi de limfocite din sângele periferic (produsul cel mai accesibil pentru studiu). O probă de 0.5 ml sânge heparinat (recoltată steril) este incubată 48-

72 ore (la 37o) într-un mediu nutritiv, la care se adaugă ser uman sau de viţel (pentru a îmbogăţi conţinutul în proteine şi factori de creştere) şi fitohemaglutinină (pentru a stimula multiplicarea limfocitelor T).

Cu puţin timp înainte de terminarea culturii, mitozele sunt blocate în metafază cu colchicină, substanţă ce inhibă formarea fusului de diviziune şi trecerea în anafază.

Apoi, mediul este înlocuit cu o soluţie salină hipotonă, care "umflă" celulele şi dispersează cromosomii; Urmează fixarea celulelor, etalarea lor pe o lama microscopică şi colorarea (cu Giemsa). Preparatele sunt examinate la microscop, se numără cromosomii (obişnuit 16 metafaze; 32 în cazul suspiciunii unui mozaic cromosomic) şi se analizează morfologia lor; metafazele selecţionate sunt fotografiate.

Cromosomii, din fotografiile obţinute după mărire, sunt decupaţi, identificaţi şi apoi aranjaţi în cariotip, pe baza criteriilor morfologice, în perechi de omologi şi grupe. Se analizează atent morfologia şi modelul în benzi a fiecărui cromosom.

CITOGENETICA

Chromosomes in a somatic cell under oil objective lens,

The chromosome under high objective lens,

Male karyotype ( 46, XY) female karyotype (46 ,XX)

GRUPELE DE CROMOZOMI LA OM

Grupa A = per 1+ per 2+ per 3 per 1 si 3 - metacentrici per 2 – submetacentrici

Grupa B (submetacentricii) = per 4 + per 5 Grupa C = per 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 +

+ cromozomul/cromozomii X, metacentric(i) per 6– metacentric per 7, 8, 9, 10, 11, 12 - submetacentrici

Grupa D (acrocentricii) = per 13, 14, 15 Grupa E = per 16, 17, 18

per 16 - metacentrici per 17, 18 - submetacentrici

Grupa F (metacentricii) = per 19, 20 Grupa G (acrocentricii) = per 21, 22 + cromozomul Y

Cariotiparea (alcatuirea cariotipului) respecta urmatoarele reguli: cromozomii sunt asezati in ordinea descrescatoare a

marimii; cromozomii omologi formeaza perechi; perechile sunt grupate dupa morfologie.

Pentru a descrie un cariotip normal sau anormal, s-a stabilit un sistem de nomenclatură şi o serie de abrevieri.

Formula de bază cuprinde 3 itemuri, separate prin virgulă: primul precizează numărul de cromosomi, al doilea constituţia (normală / anormală) a cromosomilor sexuali, iar al treilea (prezent în funcţie de situaţie) anomaliile de număr sau structură.

46,XX sau 46,XY - cariotip normal feminin sau masculin; Monosomie X 45,X - 45 cromosomi, un singur

cromosom X; Trisomie 47,XXY - 47 cromosomi cu doi X şi cu un Y; Trisomie 47,XX,+21 - 47 cromosomi, la o persoană cu

un cromosom 21 suplimentar (trisomie 21);

BANDAREA CROMOZOMILOR Dupa 1970 s-au dezvoltat tehnici moderne de citogenetica care

permit prin metode de bandare identificarea precisa a fiecarui cromozom.

Tehnicile de bandare au ca principiu afinitatea pe care o manifesta unii coloranti sau agenti fluorescenti fata de AND.

Astfel clorhidratul de quinacrina manifesta afinitate fata de AND bogat in A-T care maresc intensitatea fluorescentei in timp ce G-C o reduc.

S-a observat ca si gradul de condensare al cromatinei influenteaza intensitate coloratiei benzilor.

Bandarea Q:- benzile Q se obtin prin colorare cu quinacrina care

se fixeaza preferential pe regiuni ADN bogate in A-T- prezinta polimorfism ( variatii individuale ca marime

si fluorescenta a benzilor)

Bandarea G:- a devenit cea mai uzuala tehnica pentru cromozomii

umani- benzile G se obtin prin digestie enzimatica

controlata cu tripsina urmata de colorarea Giemsa

Bandarea GTG Soluţii utilizate: Soluţie de atac enzimatic: tripsină 0,02g cu 50 ml PBS 1X; Soluţie de colorare: Giemsa 2% în apă distilată; Apă distilată. Protocolul utilizat pentru realizarea bandării a fost urmatorul: Preparatele au fost introduse direct de pe placa histologică fierbinte în

soluţie de atac enzimatic (aflat la temperatura camerei) timp de 12-15 secunde;

Timpii optimi se testează pe o primă lamă pentru fiecare caz în parte; Urmează o trecere rapidă prin soluţia de clătire intermediară rece

(+4˚C); Colorare la temperatura camerei timp de 2-3 minute; Clătire cu apă distilată; Uscare la aer.

Bandarea R: se obtine prin denaturare termica controlata ( 85) a preparatelor intr-

o solutie salina inaintea colorarii cu acridin oranje sau Giemsa benzile G negative devin prin aceasta tehnica benzi R pozitive si

invers

Bandarea T: evidentiaza telomerele utilizeaza acridin oranje

Bandarea C: evidentiaza centromerii cu exceptia cromozomului Y, la care banda

intens colorata e localizata in regiunea distala a bratului q utilizeaza Giemsa

Benzi G Benzi R Benzi C

Tip de cromatina

Hetero-cromatina

Eucromatina Heterocro- matina

Localizare Brate cromoz.

Brate cromoz.

Centromere

Compozitie baze

Bogate in A-T

Bogate in

G-C

Bogate in AT, unele in GC