ELISA

PRINCIPIUL METODEI

Această metodă este indicată pentru detecţia anticorpilor din probe de ser individuale

sau în pool-uri.Ea se bazează pe proprietatea antigenelor de a forma după

depunerea pe un support de polistiren transparent, complexe imune cu anticorpii

specifici. Acestea se pot evidenţia după adăugarea unui substrat specific, printr-un

proces care se desfăşoară în mai multe etape :

Fixarea antigenelor specifice pe suportul de polistiren transparent

Adăugarea serului de testat, ale cărui imunoglobuline se vor lega

specific de antigenele fixate pe suportul solid.

Adăugarea de antiimunoglobuline conjugate cu o enzimă

Adăugarea unui substrat capabil să activeze peroxidaza cu care s-a

marcat antianticorpul pentru a dezvolta o reacţie de culoare

Stoparea reacţiei

Citirea reacţiei de culoare la un spectofotometru automat.

Etapele descrise sunt caracteristice tehnicii ELISA indirectă.Acestă metodă permite

testarea anticorpilor pe seruri individuale sau în amestec de 10 seruri. Amestecul se

realizeaza luand aceeasi cantitate de ser din cele 10 probe, formand o proba unica.

Amestecurile găsite pozitize trebuie reluate şi testate pe seruri individuale.

MATERIALE NECESARE

Continutul kitului și modul de depozitare

Este recomandabil să se lucreze cu toți reactivii aduși la temperatura de + 210C

(±50C).Pentru aceasta, este indicat ca reactivii să fie scoși din frigider cu cel puțin o

oră înainte de a începe efectuarea testului (cu excepția conjugatului).

COMPONENTUL CANTITATEA MODUL DE CONSERVARE ȘI ALTE

OBSERVAȚII

Microplăci cu 96

godeuri (12x8)

sensibilizate

10 bucăți +50C(±30C) până la expirarea termenului

de valabilitate.

Dacă o placă nu este folosită în totalitate,

ea se poate utiliza ulterior dacă este

introdusă într-o pungă de plastic închisă

etanș și menținută la +50C(±30C)

Martor pozitiv lichid

(în kit)

Martor negativ lichid

(în kit)

1 flacon de 1 ml

1 flacon de 1 ml

+50C(±30C) până la expirarea termenului

de valabilitate.

conjugat , anticorp

monoclonal anti igG

marcat cu

peroxidază ( HRPO)

1 flacon de 1,5

ml

+50C(±30C) până la expirarea termenului

de valabilitate.

Soluția de conjugat diluată nu poate fi

conservată

Soluție substrat în

diluție de lucru(TMB)

1 flacon de 120

ml

+50C(±30C) până la expirarea termenului

de valabilitate.

Soluția poate avea o tentă ușor bleu la

+50C(±30C),devenind incoloră la

+210C(±50C)

Soluția poate fi lăsată la temperatura

laboratorului la +210C(±50C)timp de o

săptămână dacă este stocată în flacoane

închise etanș

Soluţie stopare

(soluţie H2SO4 0,5 M)

1 flacon de 120

ml

+50C(±30C) până la expirarea termenului

de valabilitate.

Soluția de stopare poate fi ținută la 18 -

250C(±50C) după ce kitul a fost deschis

timp de o lună.

Tampopn de diluție 1 1 flacon de 120

ml

+50C(±30C)

Tampopn de diluție 2 2 flacoane de

120 ml

+50C(±30C)

Soluție spălare

concentrată 20x

2 flacoane de

100ml

+50C(±30C)

Soluția prezintă cristale la +50C(±30C)

care vor dispare la +210C(±50C)iar o

agitare ușoară din când în când va

accelera dizolvarea acestora.

Soluția poate fi lăsată la temperatura

laboratorului la +210C(±50C)timp de o lună

dacă este stocată în flacoane închise

etanș.După diluare poate fi conservată

timp de 3 zile la +50C(±30C).

Serurile de cercetat, cu hemoliză puternică, contaminate cu bacterii sau fungi sau

cele recoltate pe anticoagulant (heparină sau EDTA) nu se testează deoarece pot

furniza rezultate eronate. Sunt necesari 5-7 ml sânge/probă. Serurule de testat se

păstrează la frigider la 20 - 70 C până la 5 zile iar dacă este necesară o perioadă mai

lungă de păstrare vor fi congelate la – 200C.

ECHIPAMENTE DE ÎNCERCARE ŞI MIJLOACE DE MĂSURARE

Etuvă electrică tip BINDER, reglată la 37oC,

Termostat incucell reglat la 37ºC

Agitator vortex

Agitator/incubator placi

Linie ELISA TECAN (monitor, spălător, agitator ,cititor, imprimantă),

Cilindri gradaţi de 100. 250, 1000 ml

Micronixuri pentru probe

Pipete semiautomate, calibrate, monocanal şi multicanal

Cuve din plastic pentru reactivi

Virfuri pentru pipete semiautomate

Frigider cu congelator

Pipete de 5 ml şi 10 ml

Acţiuni şi / sau măsuri preventive

Protecţia personalului

Obligatorie purtarea halatului, a mănuşilor chirurgicale(ecipament de

protecţie).

Materialele supuse examinarii vor fi considerate ca posibil infectate

cu germeni patogeni pentru om si vor fi manipulate cu atentie.

Reactivii nu se pipetează cu gura ;

Reactivii se utilizeaza numai pentru diagnosticul de laborator.

Evitarea contactului substratului(TMB) cu pielea, mucoasele şi ochii.

După utilizare plăcile şi substratul pot fi distruse prin incinerare.

“Soluţia stop“ conţine H2SO4 0,5 M ce poate cauza arsuri grave în

caz de contact cu pielea, mucoasele şi ochii.

Materialele folosite in reactie se strang in vasul pentru deseuri, al

carui continut va fi distrus prin ardere.

Dezinfecţia suprafeţelor de lucru cu soluţii dezinfectante

Sterilizarea încăperii de lucru cu raze U.V.

Protecţia mijloacelor de încercare şi / sau măsurare

Sticlăria curata se păstrează în dulapuri speciale

Executarea periodică a serviciilor de întreţinere şi curăţire zilnică a

aparaturii

Verificarea şi înregistrarea temperaturii din încăperea de lucru

Verificarea stării de funcţionare şi confirmarea metrologică a mijloacelor de

măsurare

Verificarea o dată pe zi a temperaturii termostatelor

MOD DE LUCRU.

Factorii care influenteaza fidelitatea metodei sunt :

● calitatea spalarilor (atentia acordata ultimei spalari este foarte

importanta pentru buna realizare a testului).

● precizia pipetajului

● conditiile de temperatura a reactiei.

Pregătirea trusei de lucru

Se aduc toți reagenții le temperatura camerei (18 – 250C)

Înscrierea în fișa de lucru a probelor de testat și a serurilor martor

Se înregistrează pe fișa de lucru poziția serurilor și martorilor în plăcile căptușite cu

anticorpi

Diluarea serurilor

Se distribuie 190 μl tampon de diluție 2 în fiecare godeu

Se depun 10 μl ser de referință negativ pur în godeul A1

Se depun 10 μl ser de referință pozitiv pur în godeul B1

Se depun 10 μl ser pentru testare în godeurile aferente

Se omogenizează conţinutul cu grijă bătând placa de 10 ori.

Se acoperă placa și se incubează 60 minute(±5 minute) la +370C.

A

B

C

D

E

F

G

H

N

P

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Fig.1:Distribuția probelor și martorilor pe placă

Unde : P = martor pozitiv

N = martor negativ

1 = ser de testat nr.1

2 = ser de testat nr.2.....

Prepararea soluției de spălare și folosirea acesteia

Soluția de spălare concentrată de 20 x trebuie adusă la temperatura camerei

și omogenizată prin agitare ușoară pentru a ne asigura că sărurule

precipitante s-au dizolvat

Soluție de spălare concentrată 20x trebuie diluată în 1900ml apă distilată

Se scot probele din termostat.

Se elimină conţinutul godeurilor prin răsturnare sau cu ajutorul unui aparat

automat într-un container de colectare.

Se distribuie în fiecare godeu 350μl soluţie de spălare şi apoi se elimină din

nou această soluţie

Procedura de spălare se repetă de 2 ori(deci 3 spălări în total).

Daca se foloseste spalatorul automat se respecta instructiunile de folosire ale

acestuia.

Dacă se lucrează cu un număr mare de plăci în acelaşi timp,în scopul

sincronizării operaţiunilor, plăcile se pot lăsa umplute cu soluţia de spălare

până la o oră, fără ca aceasta să influenţeze validarea testului.

Depunerea conjugatului

Se diluează conjugatul 1/100 în tamponul de diliție nr.1(de exemplu

pentru 1 strips se amestecă 1ml TD.1 cu 10 μl conjugat)

Se depun 100μl conjugat diluat în fiecare godeu.

Se omogenizează conţinutul cu grijă bătând placa de 10 ori.

Se acoperă placa și se incubează 30 minute(±3 minute) la +370C

(±3 minute).

Spălarea (pasul al 2-lea de spălare)

Se elimină conţinutul godeurilor prin răsturnare sau cu ajutorul unui

aparat automat într-un container de colectare.

Se distribuie în fiecare godeu 350μl soluţie de spălare şi apoi se

elimină din nou această soluţie

Procedura de spălare se repetă de 2 ori(deci 3 spălări în total).

Atenția acordată ultimei spălări este importantă pentru buna

realizare a testului

Revelarea.

Se depun 100 μl substrat (TMB) în fiecare godeu

Se omogenizează conţinutul cu grijă bătând placa de 10 ori.

Se incubează plăcile timp de 20 minute la temperatura camerei 210C (±50C) la

întuneric.

Se începe cronometrarea de la umplerea primului godeu

Placa nu se acoperă cu folie adezivă.

Stoparea.

Se depun 100μl soluţie stopare în fiecare godeu.

Se agită uşor plăcile până la omogenizarea soluţiei colorate.

Se şterge cu atenţie fundul plăcii si se pune placa la aparatul de citire.

Soluția de stpare se adaugă în aceeași ordine ca și soluția substrat

Citirea.

Citirea plăcilor se face la o densitate optică(DO) de 450 nm.

Criterii de validare a testului.

Testul se consideră valid dacă:

Serul de referință pozitiv dă o valoare a densității optice de minim

0,350

Raportu dintre DO a serului de referință pozitiv și DO a serului de

referință negativ dă o valoare de minm 3

INTERPRETAREA REZULTATELOR

Se calculeaza pentru fiecare probă procentul E/P:

% E/P = (DO probă/DO ser de referință pozitiv )x 100

Orice probă a cărui % E/P≤100% este considerată negativă

Orice probă a cărui % E/P≥100% este considerată pozitivă

IMUNODIFUZIA IN GEL DE AGAR

PRINCIPIUL METODEI

Reacţia de precipitare şi imunodifuzie în gel de agar – este reacţia care se

produce între antigen şi anticorp în urma migrării acestora în gel de agar.

Antigen: agentul patogen ( suspensie microbiana vie, atenuata sau inactivata)

care are capacitatea de a induce formarea de anticorpi în organism.

Anticorp: element specific produs de organism în urma contactului acestuia cu

diferiţi agenţi patogeni.Are rolul de a neutraliza efectele nocive ale agentului patogen.

Metoda se bazează pe proprietatea anticorpilor precipitanţi prezenţi în serul

animalelor bolnave sau potenţial purtătoare de virus şi a antigenului de a migra în

gelul de agar.

Anticorpii precipitanţi apar rapid, ca urmare a infecţiei cu virus , reacţiile

pozitive specifice fiind indicate prin linii de precipitare formate între antigen şi serul de

testat, reacţii confirmate prin identitatea cu reacţia dintre antigen şi serul standard

pozitiv .

MATERIALE NECESARE

Continutul setului și modul de depozitare

Setul de diagnostic pentru este format din următoarele componente :

1 flacon cu antigen– 2 ml

3 flacoane cu ser pozitiv liofilizat – 3 ml

1 flacon cu diluant pentru componentele setului

Pe lângă componentele din setul de diagnostic, pentru desfășurarea

testului se mai folosesc :agar (agaroza)Noble pentru imunodifuzie, apă

distilată, acid boric , clorură de sodiu, hidroxid de sodiu, vată, tifon, alcool

sanitar-pentru degresarea placilor

Componentele setului de diagnostic se conservă la + 20 / + 70 C.

Serurile de cercetat, cu hemoliză puternică, contaminate cu bacterii sau

fungi sau cele recoltate pe anticoagulant (heparină sau EDTA) nu se

testează deoarece pot furniza rezultate eronate. Sunt necesari 5-7 ml

sânge/probă. Serurule de testat se păstrează la frigider la 20 - 70 C până la

5 zile iar dacă este necesară o perioadă mai lungă de păstrare vor fi

congelate la – 200C

ECHIPAMENTE DE ÎNCERCARE ŞI MIJLOACE DE MĂSURARE

Aparatură şi sticlărie

Termostat Friocell reglat la 20-22º C,

Lupa cu putere de marire de 3x

Lampa U.V. – radiatii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului

incaperilor și a suprafetelor de lucru.

Aparat tip ovoscop pentru citire plăci Petri.

Matriţă metalică cu diametrul de 5,0/3,0 mm - de 5,3 / 2,4 mm – pentru

efectuarea godeurilor

Plăci Petri sterile din material plastic cu diametrul de 85 - 90 mm

Pipete semiautomate, calibrate, monocanal

Vârfuri pentru pipete semiautomate

Baloane Erlenmeyer de la 250 la 1000 ml

Eprubete de 16 x 160 mm din sticla neutra sterile cu dopuri din vata.

Cristalizator sau placa Petri din sticla cu diametrul de 20 cm.

Pipete gradate de 5, 10, 25 ml.

Stative pentru eprubete.

Acţiuni şi / sau măsuri preventive

Protecţia personalului

Obligatorie purtarea halatului, a mănuşilor chirurgicale şi a măştii de tifon

(echipament de protecţie).

Flacoanele cu antigen sau cu seruri de referinţă se vor colecta în vase

speciale cu sodă caustică 5%, apoi se vor steriliza la autoclav.

Dezinfecţia suprafeţelor de lucru cu soluţii dezinfectante

Sterilizarea încăperii de lucru cu raze U.V.

Manipularea soluţiilor oxidante folosite pentru decontaminarea materialelor se

va face cu precuţie.

Protecţia mijloacelor de încercare şi / sau măsurare

Sticlăria sterilă se păstrează în dulapuri speciale

Executarea periodică a serviciilor de întreţinere şi curăţire zilnică a

aparaturii.

Verificarea şi înregistrarea temperaturii din încăperea de lucru

Verificarea stării de funcţionare şi confirmarea metrologică a mijloacelor de

măsurare

Verificarea zilnică a temperaturii termostatului

MOD DE LUCRU

Factorii care influenteaza fidelitatea metodei sunt urmatorii :

Reactivii să se încadreze în termenul de valabilitate

Serul să fie fără urme de hemoliză

Reactivii să fie adusi la temperatura camerei

Plăcile Petri să fie curate (de unică folosinţă) şi agarul să fie preparat

corespunzător.

Sa nu existe condens in interiorul godeurilor( poate dilua reagentii).

Vârfurile pentru pipetele semiautomate să fie de unică folosinţă

Pregătirea materialului supus examinarii

Probele se pregătesc conform metodei omologate pentru care se solicită

examenul.După recepţionare, se face identificarea probelor( se verifica daca nr. de

pe eticheta sticlutelor corespund cu cele din tabelul insotitor).Se verifica daca probele

sunt corespunzatoare( sa fie proaspete, exprimate, sa nu fie hemolizate, infectate

bcterian sau fungic. Probele la care serul este exprimat se introduc la frigider,

probele cu serul neexprimat se decolează şi se menţin 3-6 ore la temperatura

camerei (21º C), apoi se pun la frigider până se lucrează.

Este necesar un volum de 5-7ml singe/proba.

Prepararea tamponului borat şi a gelului de agar

● Tamponul borat (pH 7,2) se prepară după formula :

acid boric…………………..9,0 g

hidroxid de sodiu………….2,0 g sau 50 ml 1n

clorura de sodiu……….70,0 g

apă distilată……… ad 1000 ml

La 1l de tampon borat preparat după formula de mai sus, se adaugă0,8 g de agar

Noble Difco (agaroză), se lasă 12 ore la temperatura camerei la macerat, după

care amestecul se fierbe la baie marină până la dizolvarea completă a agarului.

Filtrarea se face prin tifon sau vată.

Gelul de agar se aduce la temperatura de 600 C, apoi se toarnă îneprubete de

16/160 câte 15 ml în fiecare.

În ziua efectuarii testului, gelul din eprubete se topeşte în baia marină, apoi se

toarnă în plăci Petri cu diametrul de 85 mm.

Pregătirea plăcilor pentru reacţie

Nu se folosesc placile deformate, fisurate, mate sau zgariate.

Placile vor fi degresate cu alcool sanitar inainte de a se turna agarul in ele.

Plăcile din plastic în care s-a turnat agarul se lasă la temperatura camerei cu

capacul putin intredeschis, pe o suprafata perfect plana, intr-un loc ferit de curenti

de aer si praf, timp de 10 minute pentru solidificarea acestuia, se introduc în

frigider la temperatura de 2-80 C pentru 2 ore, timp necesar pentru răcirea

completă a agarului. Agarul trebuie să aibă o grosime de aproximativ 2,8mm.

Cu matriţa cu diametrul de 6,5/3,0 mm sau de 5,3/2,4 mm se taie în agarul din

placa Petri un numar de 7 grupuri de godeuri ; fiecare grup este format din 7

godeuri ( 6 godeuri periferice si 1 central) asezate sub forma de rozeta.

Cu un ac de seringa se scoate gelul de agar din godeuri.

Plăcile nefolosite pot fi depozitate la frigider la 2 7 0C în pungi închise etanş până

la o săptămînă, iar înainte de utilizare agarul trebuie verificat pentru a ne asigura

că nu este uscat .Godeurile trebuie sa aiba marginile regulate si peretii perfect

verticali.

Repartizarea reagenţilor în godeuri şi incubarea plăcilor

Componentele setului de diagnostic se dizolvă în lichidul de diluţie, în cantităţile

menţionate de producator pentru fiecare flacon în parte, după care se pun la frigider

timp de 10 minute pentru stabilizare(în funcţie de furnizor) iar cele neliofilizate se

folosesc ca atare. Se verifică dacă agarul nu s-a desprins de pe fundul plăcii, dacă

godeurile sunt corect taiate ( sa aiba marginile regulate si peretii verticali), se

apreciază distanţa dintre ele şi se verifică să nu conţină apă. Dacă există apă

aceasta se aspiră cu pipeta Pasteur, apoi se numerotează grupurile de godeuri cu

marker-ul pe marginea fiecărei plăci.

Adăugarea reagenţilor din setul de diagnostic în godeuri are în vedere

introducerea lor uniformă fără bule de aer, până la apariţia meniscurilor (se pun 40 -

50 μl/ godeu).

În cazul în care serurile martor, antigenul sau serurile de cercetat depăşesc

nivelul superior al godeurilor, lucrarea se va reface în grupul următor de godeuri,

pentru evitarea erorilor de diagnostic.

Distribuirea în placă este următoarea :

în godeul central se pune antigenul solubilizat

in godeurile 2, 4 , 6 se pune serul pozitiv solubilizat

în godeurile 1 , 3 , 5 se pun serurile de testat conform figurii nr. 1

Fig.1

SP AG = antigen

S3 S5 SP = ser pozitiv

AG S1,3.5 = ser de testat

SP SP

S1

Plăcile sunt lăsate 10 minute pe masa de lucru acoperite cu capac,pentru

eliminarea riscului de amestec sau scurgere, cât şi pentru aşezarea reagenţilor,

înainte de a începe migrarea antigenelor şi anticorpilor. Plăcile se incubează la 20-

220 C într-o cutie din plastic în care s-a asigurat o atmosferă umedă.

Durata operatiilor

30 minute

INTERPRETAREA SI EXPRIMAREA REZULTATULUI

Interpretarea rezultatului

Citirea reacţiei se face la lumina ovoscopului, la 24, 48, şi 72 ore pentru a

urmări apariţia martorilor şi interpretarea rezultatelor. Tipul de reacţie va depinde de

calitatea antigenului, concentraţia anticorpilor din serurile de cercetat şi va putea fi

apreciat după compararea acestora cu cea a serurilor martor pozitive. Dacă între

serul martor pozitiv şi antigen linia de precipitare este bine evidentiata, situata la

jumatatea distantei dintre ele si apare la 24 de ore, reacţia se consideră validă.

Exprimarea rezultatelor

Se pot întâlni următoarela tipuri de reacţie :

Reacţia negativă – serul de cercetat nu conţine anticorpi detectabili prin acest test.

Între godeurile cu ser şi cel cu antigen (A) nu apare linia de precipitare. Linia de

precipitare dintre godeul cu antigen si serul martor pozitiv merge pana la marginea

godeului cu serul de testat.(fig 2 S1-proba negativa).

Reacţia pozitivă – serul de cercetat conţine anticorpi. Linia de precipitare este clară,

continuă, situată la jumătatea distanţei între godeul cu antigen (A)şi cel cu serul de

cercetat(S2). La ambele capete linia se uneşte sub forma unui cot cu linia de

precipitare a serului martor pozitiv alăturat. .(fig 2 S2-proba pozitiva)

Reacţia slab pozitivă – linia de precipitare este foarte slab vizibilă, este mai aproape

de godeul ce conţine serul de cercetat (S3)si curbeaza usor linia de precipitare a

serului martor pozitiv.Nu formeaza o linie completa intre antigen (A) si serul de

testat (S3) (fig 2 S3-proba slab pozitiva) Deoarece reacţiile slab pozitive pot fi

interpretate eronat, pentru confirmare se impune repetarea testului .

Fig. 2 Fig. 3

Reacţia intens pozitivă – serurile puternic pozitive formează o bandă mai lată de

precipitare între godeurile cu ser (S1) şi cele cu antigen (A), adesea dizolvă linia de

precipitare a serului de referinţă din partea sa, acesta rămânând la jumătate.

Diagnosticul se stabileşte după retestarea serurilor respective în diluţii seriate (1/2,

1/4, 1/8) până se obţine o linie de precipitare distinctă.Linia de precipitare este foarte

aproape de godeul cu antigen (A)(fig. 3 S1- proba intens pozitivă).

Reacţia nespecifică – se produce în cazul unor reacţii antigen – anticorp de altă

natură. Se ia în considerare atunci când serurile de cercetat formează o linie slabă,

difuză, alte ori clară, care se suprapune sau întretaie linia serului martor pozitiv. (fig.

3 S2 – reactie nespecifica)

Reacţia mascată - serurile de cercetat formează un halou albicios în jurul godeurilor

în care au fost repartizate. Poate masca liniile de precipitare care pot apărea. Testul

se repetă folosind seruri diluate 1/2. Dacă modificările persistă serurile cu reacţie

mascată se vor examina din din nou după 30 de zile. Stabilirea diagnosticului se face

la 48, 72 de ore. (fig. 3 S3 – reactie mascata)

Stabilirea diagnosticului se face la 72 de ore.