Referat

Biotehnologia de obținere a xanthanului

CUPRINS

Capitolul I

Memoriu descriptiv şi justificativ...................................................................3

Capitolul II

Istoric.............................................................................................................4

Capitolul III

Microorganisme producătoare de xanthan....................................................5

Capitolul IV

Mecanismul de biosinteză a xanthanului.......................................................6

Capitolul V

Biotehnologia de obținere a gumei xanthan ..................................................7

Capitolul VI

Utilizarea xanthanului .................................................................................14

Bibliografie....................................................................................................15

1

2

1.Memoriu descriptiv și justificativ

Prin tema prezentată în acest referat mi-am propus să tratez biotehnologia de obținere a gumei xanthan și să detaliez procesele ce intervin.

Astfel am evidențiat microorganismele producătoare de xanthan, am prezentat mecanismul de biosinteză și aspectele biotehnologiei de obținere a acestui heteropololiglucid microbian. Deasemenea în lucrare am prezentat și schița de principiu a instalației de obținere a xanthanului prin fermentare în cultură discontinuă și schema de recuperarea Xanthanului din mediul de fermentare cu ajutorul izopropanolului.

3

Capitolul I

Istoric

Xanthanul a fost descoperit in 1940 de către Allene Rosalind Jeans și echipa sa de cercetare de la Departamentul de Agricultură a Statelor Unite, care l-au izolat din vegetalele infectate cu Xanthomonas campestris. El a fost primul poliglucid microbian obținut la nivel industrial.

Guma Xanthan este un heteropoliglucid anionic ,extracelular,ramificat, constituit dintr-o unitate pentaglucidică care se repetă și care formează coloana vertebrală a glucanului, constituită din două reziduri de β-D glucozil, două reziduuri de D-manoză și un rest de acid D-glucuronic(figura 1). Din punct de vedere chimic Xanthanul conține, în principal , D-glucoză (40%), D-manoză(22%), acid D-glucuronic(22%), acid piruvic (4%), grupări acetil(2%). Compoziția chimică a gumei xanthan diferă în funcție de tulpina Xanthomonas utilizată în procesul de biosinteză, de copmoziția mediului de cultură (sursa de carbon folosită, prezența și nivelul fosforului din mediu), de parametrii de fermentare și de timpul de cultivare.

Figura 1.Stuctura xanthanului.

4

Capitolul II

Microorganismele producătoare de xanthan

Există în natură peste 100 de specii de bacterii,aparținând genuluiXanthomonas, dintre care se remarcă tulpinile Xanthomonas campestris, X.phaseoli, X.carotae și X.malvacearum, ca buni producători de poliglucid extracelular. Bacteriile din acest gen se prezintă sub formă de bastonașe drepte, scurte, predominant singure. Sunt bacterii G(–), aerobe cu metabolism strict respirator, folosind oxigenul ca acceptor terminal de electroni, sunt mobile, mobilitatea fiind asigurata de un singur cil polar. Nu denitrifică sau nu determinaă reducerea azotatului. Aceste bacterii se dezvoltă pe lactat de Ca, dar nu și pe glutamină, asparagina nefiind folosită ca sursă de carbon. Necesită factori de crestere cum sunt metionina, acidul glutamic, acidul nicotinic sau derivați ai acestora. Bacteriile din acest gen hidrolizează proteinele, iar unele tulpini celuloza și pectina. Temperatura optimă de dezvoltare este cuprinsă între 25-30℃. Nu se dezvoltă la temperaturi peste 40℃. În general sunt bacterii patogene pentru plante, excepție făcând Xanthomonas maltophila care este un patogen pentru om. Xanthomonas campestris, principala bacterie responsbilă pentru biosinteza xanthanului, este un microorganism care se gasește în natură,ea fiind, pentru prima dată izolată de pe varză, la care cauzeză putrezirea neagră. Xanthomonas campestris se dezvoltă la temperaturi cuprinse între 35-39℃ și tolerează niveluri de 2-5% NaCl.

5

Capitolul IIIMecanismul de biosinteză a xanthanului

Biosinteza heteropoliglucidului microbian,de tipul xanthanului, este unproces complex care implică participarea unui sistem multienzimatic, fiecare enzimă având un grad mare de specificitate. Căile de metabolizare a glucozei la Xanthomonas campestris sunt asemănătoare cu acele întâlnite la Pseudomonas aeruginosa care implică două stadii. Primul stadiu în biosinteza acestui polizaharid microbian constă în intoducerea substratului , respectiv a glucozei, în interiorul celulei, care se poate produce prin transport activ, translocare de grup sau prin difuzie facilitată. La Xanthomonas campestris există două sisteme discrete pentru introducerea glucozei, unul periplasmatic și oxidativ, care necesită activitatea glucozo-dehidrogenazeiși al doilea sistem intracelular și fosforilativ, pe calea enzimei hexokinaza,enzimă prezentă la X. Campestris, care utilizează adenozin 5B -trifosfatul (ATP-ul)

Stadiul al doilea de biosinteză a poliglucidului microbian implicătransferarea substratului fosforilat diferitelor glucide ale unor nucleotide, în general nucleotide monoglucidice, necesare pentru asamblarea unităților care se repetă în molecula unui poliglucid.

6

Capitolul IVBiotehnologia de obținere a gumei xanthan

Principalele operații implicate în producerea gumei xanthan sânt: pregătirea microorganismului și a inoculului; pregătirea mediilor de cultură și sterilizarea acestuia; fermentarea propriu-zisă; separarea și purificarea xanthanului.

4.1 Obținerea inoculului

Xanthomonas campestris este un microorganism cu caracteristiciinstabile, mutațiile spontane care pot să apară conduc la schimbarea informației genetice, depozitată în celulă. Schimarile ce pot apărea afectează mecanismele de reglare și nivelurile enzimatice, implicate în unele procese celulare, inclusiv în biosinteza poliglucidului, cu degenerarea tulpinilor cu randament ridicat în biopolimer la tulpini producătoare, mai puțin eficiente. Pentru producția industrială de xanthan se utilizează un mutant de Xanthomonas campestris,menținut în stare liofilizată într-un mediu nutritiv. Prepararea inoculului implică :

transferarea culturii bacteriene și dezvoltarea pe mediu de agar înclinat; transferări în serie și dezvoltarea bacteriei pe mediu de cultură lichid

(temperatura de dezvoltare 28℃ ,pH=7,0, durata incubării 24 h) asociate cu efectuarea testelor de identificare și controlul stabilității genetice a tulpinilor respective.În ultimul timp, se utilizează conținutul în acid piruvic, ca indice de bază

în aprecierea calității și cantității de biopolimer produsă de o tulpină.Nivelurile de inocul pentru stadiile intermediare și de regim sunt de

5- 15% și respectiv de 5%. Prin controlul nivelurilor de Fe, Mn și Zn din cultura de inocul se poate reduce volumul de inocul la numai 0,01-0,5 % din volumul total al mediului de cultură.

7

4.2 Pregătirea mediului de cultură

La nivel industrial, guma xanthan se obține prin cultivarea luiXanthomonas campestris pe medii de cultură cu următoarea compoziție:

Componentul chimic Cantitatea,g% Cantitatea, g%Varianta I IID-glucoză 2,0-3,0 3,50Extratul solubil de la distilare

0,4 -

K2HPO4 0,5 0,5MgSo4* 4 H2O 0,01 0,01Extract de porumb sau extract de drojdie

- 0,8

Apă până la 1000 cm3 1000 cm3

Mediu de cultură steril se obține prin folosirea componentelor sterilizateseparat. Această procedură simplificată determină o mai bună flexibilitate, prin utilizarea proceselor moderne monitorizate și a echipamentelor de control. În cazul producției de gumă xanthan , sterilizarea continuă nu oferă un avantaj mai mare față de sterilizarea discontinuă, datorită volumelor relativ mici de mediu de cultură, care trebuie sterilizate.

4.3 Fermentarea propriu-zisă

Cultura submersă în sistem discontinuuÎn prezent, producția industrială a gumei xanthan se realizează în

fermentatoare cu capacitatea de 50-200 m3, în sistem discontinuu, cu agitare și aerare. Producția de xanthan este afectată de diferiți parametri de fermentație, pH-ul mediului fiind unul dintre acești parametri, care are influență directă asupra producției de biopolimer. Fermentația se realizează la un pH cuprins între 6,0-7,5, valoarea optimă fiind 7,0. Fără control pH-ul înregistreză o descreștere în timpul fermentării, datorită formării acizilor organici și funcțiilor acide, conținute de xanthan. Dacă pH-ul decrește sub 5,0, formarea xanthanului scade drastic, de aceea este necesar controlul pH-ului prin utilizarea unui sistem tampon sau prin adăugare de baze în timpul desfășurării procesului de fermentare. Temperatura de fermentare este alt parametru critic, producția optimă de xanthan realizându-se la temperatura de 28℃,iar temperatura de dezvoltare a bacteriei Xanthomonas campestris se situează în limitele 20-30℃. Creșterea temperaturii determină creșterea vâscozității xanthanului produs.

8

Producția polimerilor microbieni, cum este și cazul xanthanului, este realizată întodeauna în condiții aerobe, oxigenul dizolvat constituind un alt parametru deosebit de important, de aceea se impune controlul permanent al aerării și agitării mediului de fermentare, procedeul adecvat constă în aerarea forțată cu aer steril. Biosinteza polimerului determină creșterea vâscozității mediului care crează probleme, legate de limitarea oxigenului care va afecta cantitatea și calitatea produsului ,din acest motiv se recomandă ca aerarea să crească odată cu mărirea văscozității mediului. O viteză de aerare cuprinsă între 0,75 și 1,5 vol.aer/l/minut determină formarea unui poliglucid cu conținut maxim de piruvat.Agitarea asigură dispersarea aerului în toate direcțiile mediului și creșterea vitezei de transport a nutrienților prin membrană celulară, îmbunătățind viteza de dezvoltare a microorganismului. La temperatura de 28℃ aproximativ 50 % din D-glucoza din mediul de cultură este convertită în gumă xanthan în 72-96 ore.

Cultura continuă La fermentarea continuă, adăugarea mediului proaspăt la cultura de X.campestris se realizează continuu și concomitent cu recoltarea xanthanului biosintetizat. Procesul de fermentare este controlat prin limitarea unui nutrient, în timp ce alți nutrienți sunt prezenți în exces. Producția de xanthan în cultură continuă este condiționată de viteza de diluție. Prin creșterea vitezei de diluție de la 0,15 h-1 la 0,196 h-1, viteza de producere a polimerului scade de la 0,84 g∙h-1 la 0,64 g∙h-1 . Xanthanul sintetizat la viteze de diluție mai scăzute au un index de consistență mai mare și un index de plasticitate mai mic. Randamentul de conversie al D-glucozei în xanthan variază în limitele 81-89% din randamentul teoretic. Compoziția chimică a xanthanului ,obținut, diferă în funcție de tulpina de Xanthomonas utilizată și de nutrientul limitativ. În cultura continuă de X.campestris prin limitarea unor nutrienți se obțin randamente diferite de polimer (xanthan), aceasta având și compoziție chimică mult diferită. Astfel, prin limitarea sursei de carbon scade drastic viteza de creștere a microorganismului și producția de polimer. Prin limitarea azotului crește randamentul de xanthan (7,0 g∙l-1) și gradul de acetilare(6,6%). În cazul limitării sulfului, magneziului și potasiului se obțin randamente mai mari în polimer, decât atunci când este limitată sursa de carbon(6,4; 5,7;5,3 față de 2,7 g∙l-1). Polimerul sintetizat în condițiile limitării sulfului nu conține acetat, dar are un grad mare de piruvare (8,5%) față de cel produs cu limitarea magneziului.Prin limitarea fosforului se influențează negativ gradul de piruvare, polimerul fiind eliberat de grupări acetil. Într-o cultură continuă, în condiții controlate și cu limitarea azotului, concentrația celulelor microbiene rămâne constantă în intervalul de temperatură

9

20-37,5℃, dar cea mai bună conversie a glucozei la xantan și vâscozitate maximă se realizează la 30℃

4.4 Recuperarea Xanthanului din mediul de fermentare

Lichidul de fermentare final conține pe lângă xanthan celule de X.Campestris , material insolubil, substrat glucidic neconsumat și diferite săruri minerale. Pentru a corespunde reglementărilor de toxicitate, xanthanul trebuie să fie liber de celule de X.campestris, de produse de fermentare sau constituenți ai mediului, ca și de reactivii folosiți în procesul de recuperare, mai ales atunci când produsul se utilizează în scop alimentar. Pentru recuperarea biopolimerului din lichidul de fermentare la nivel industrial se folosesc diferite tehnici care realizează:

dezactivarea și îndepărtarea celulelor de Xanthomonas campestris; precipitarea polimerului, prin trecerea xanthanului într-o formă insolubilă; deshidratarea, uscarea și măcinarea biopolimerului obținut până la

granulația dorită.

Metode de prerecuperarePrimul stadiu în procesul de separare a xanthanului este pasteurizarea

lichidului de fermentație la temperatura de 98,9℃, timp de 3 minute, în vederea distrugerii integrale a celulelor bacteriene de Xanthomonas campestris,dar și pentru activarea unor enzime nedorite (celulaze,pctinaze).Procedeul respectiv prezintă dezavantajul că la acest nivel de temperatură crește substanțial vâscozitatea soluției de xanthan. Pentru îndepărtarea celulelor bacteriene din mediul de cultură fermentat se poate utiliza, în afară de filtrare, centrifugarea convențională sau tehnica de floculare. Altă tehnică de prerecuperare presupune adsorbția particulelor din lichidul de fermentație pe particule de clei, urmată de coagulare sau filtrare. Pentru a reduce costul biopolimerilor purificați și pentru simplificarea operațiilor de separare și purificare se folosesc tehnici enzimatice, care utilizează pentru degradarea celulelor de X.campestris proteaze acide, neutre sau alcaline, provenite de la Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Pellicularia filamentosa. O alternativă pentru clarificarea lichidului de fermentație constă în realizarea unei fermentații secundare în condiții acide cu fungul Trichoderma Viridae, care este capabil să consume celulele de X.campestris. Celulele de Trichoderma Viridae, fiind mai mari, se îndepărtează mai ușor prin filtrare.

10

Procedee de precipitare După tratamentul de prerecuperare , xanthanul poate fi precipitat din lichidul de fermentare clarificat, prin diverse procedee, în funcție de scopul urmărit:

Obținerea gumei Xanthan intr-o formă solidă, stabilă microbiologic, ușor de manipulat, transportat, depozitat, redizolvat și diluat la concentrația impusă de unele aplicații;

Purificarea biopolimerului pentru a reduce nivelul solidului nepolimer și pentru a îmbunătăți performanțele sale funcționale, culoarea,mirosul și alte calități ale gumei xanthan;

Modificarea proprietăților chimice ale biopolimerului pentru aplicații speciale.

Cel mai frecvent utilizat procedeu industrial constă în adăugarea unuisolvent organic miscibil în apă,cum ar fi un alcool inferior (etanol, metanol, izopropanol),în concentrație suficientă pentru a realiza precipitarea totală a xanthanului din soluție.Izopropanolul este considerat solventul cel mai potrivit în acest caz .Volumul de alcool izopropilic necesar pentru precipitarea gumei xanthan este dependent de concentrația unor săruri din mediu și independent de concentrația biopolimerului.

11

Figura 2

Procesarea post –precipitare

Centrifugarea sau presarea.După precipitare xanthanul umed conținemari cantități de lichid care pot fi îndepărtate prin centrifugare sau presare.

Uscarea finală a precipitatului de biopolimer se poate realiza în uscătoare cu funcționare continuă sau discontinuă,sub vid, cu circulația forțată a aerului sau în atmosferă de gaz inert,dacă polimerul conține izopropanol,în uscătoare rotative, în uscătoare prin pulverizare. Respectarea condițiilor de uscare este esențială pentru evitarea degradării chimice a xanthanului și modificării excesive a culorii.Uscarea se face până la un conținut final de umiditate de 100% Măcinarea xanthanului uscat se face în scopul reducerii dimensiunilor particulelor până la mărimea necesară tipului de gumă xanthan,care uneori este singura diferență între diferitele produsele comercializate.

În figura 3 este prezentată schița de principiu a instalației de obținere a xanthanului prin fermentare în cultură discontinuă.

12

Figura 3

Compoziția chimică a xanthanului diferă în funcție de tulpina de Xanthomonas utilizată ,chiar în condițiile cultivării pe medii de cultură cu aceeași compoziție și respectării parametrilor de fermentare (tabelul 2).

Tabelul 2.Compoziția chimică a xanthanului produs de diferite tuplini de Xanthomonas

13

Capitolul VUtilizările xanthanului

Proprietățile unice ale xanthanului permit utilizarea acestuia cu precădereîn industria alimentară ,textilă, cosmetică, famaceutică și în industria petrolieră.

În industria alimentară a primit apobare de utilizare din anul 1969,fiindfolosit ca agent de îngroșare, suspendare, emulsionare, stabilizare și pentru controlul vâscozității diferitelor medii. Aceste utilizări au la bază următoarele proprietăți ale gumei xanthan:

Solubilitatea rapidă a xanthanului, atât în apa rece cât și în apă caldă; Formarea unor soluții vâscoase chiar și la concentrații mici de gumă

xanhan; Soluțiile de xanthan sunt pseudoplastice, cu proprietăți de curgere.

În repaus vâscozitatea soluțiilor de xanthan este relativ mare. Prin creșterea vitezei de amestecare, vâscozitatea scade ca o consecință a unei alinieri progresive a moleculelor rigide odată cu creșterea vitezei de agitare. Pseudoplasticitatea soluțiilor favorizează operațiile de pompare și de umplere a dispersiilor pe bază de xanthan, care au proprietăți bune de curgere;

Stabilitatea relativ bună a vâscozității soluțiilor de xanthan la temperaturi ridicate, permite utilizarea xanthanului la obținerea sosurilor ,care își păstreză vâscozitatea în domenii largi de temperatură și pH, precum și în prezența sărurilor. Se folosește la fabricarea conservelor, dressing-urilor, produselor instant, produselor alimentare congelate, băuturilor cu aromă de fructe, cărora le conferă onctuozitate și fluiditate.

Manifestă efect sinergic față de guma guar, determinând creșterea vâscozității soluțiilor la care participă cele două gume, având astfel aplicații la pregătirea furajelor în cutii pentru animale de casă

În SUA, guma xanthan este folosită la obinerea pâinii lipsite de gluten , pentru persoanele care suferă de boala celiacă.

Studiile efectuate cu xanthan au scos în evidență faptul că acesta este hidrolizat în tractusul gastrointestinal, în proporție de circa 15%, fiind absorbit și metabolizat până la CO2, fără acumularea gumei xanthan în țesuturi. Xanthanul neabsorbit este eliminat prin fecale.

14

Bibliografie:

1.Ionescu A., Zara M., Gurău G.,Resmeriță D., Biotehnologia aditivilor alimentari,Editura Academica,Galați 20022.surse din internet:

www.wikipedia.com http://www.answers.com/topic/xanthan-gum http://memoonyourhealth.com/2009/05/17/memo-on- your-

xanthan-gum-is-it-safe-to-eat /

15