Biotehnologia Obtinerii Preparatelor Enzimatice - Culturi Starter de Microorganisme

Capitolul 1. Definiia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi starter de microorganisme.

17Capitolul 1. Definiia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi starter de microorganisme.

1.1 Biotehnologii alimentare definiie. obiectul biotehnologiei

Biotehnologia este o tiin complex, ce se caracterizeaz prin utilizarea integrat a biochimiei, microbiologiei, biologiei celulare i a ingineriei genetice. (fig. 1.1).

Figura 1.1. Biotehnologia o tiin complexDenumirea de biotehnologie provine de la cuvintele greceti:

-Bios care nseamn via, -Tehnikos care nseamn tehnici i -Logos care nsemn studiu al. Biotehnologia este aplicat in diverse domenii, cum ar fi: agricultur, industria alimentar, producie industrial, mediu i medicin.Biotehnologia alimentar se refer la prelucrarea industrial a diferitelor materii prime cu ajutorul microorganismelor i enzimelor proprii sau a unor ageni biologici (microorganime, enzime) adugai n scopul realizrii unor produse sau a ameliorrii unor procese tehnologice. Rolul biotehnologiei este covritor n industria alimentar. n fapt, industria alimentar este o biotehnologie, deoarece materiile prime agroalimentare sunt produse biologice i prin urmare conservarea lor pn la consum, n stare proaspt (cazul fructelor i legumelor) sau pn la industrializare (cazul tuturor produselor agroalimentare) implic controlul activitii enzimatice proprii esuturilor vegetale i animale sau a celor elaborate de microflora de contaminare.

Enzimele proprii esuturilor vegetale i animale sunt eseniale n transformrile pe care le ofer produsele agroalimentare: maturarea fructelor i legumelor, cerealelor i finurilor sau diferitelor produse alimentare pe baz de cereale germinate, maturarea brnzeturilor, maturarea crnii.

Enzimele pot avea ns i rol deteriorativ cu implicaii n modificarea caracteristicilor senzoriale i a valorii nutritive a materiilor prime agroalimentare pn la prelucrarea termic a acestora.

De asemenea, rolul microorganismelor este hotrtor, unele dintre ele avnd aciune duntoare, altele avnd rol esenial n obinerea unor produse alimentare datorit aciunii lor fermentative: produse lactate acide, brnzeturi, bere, vin, spirt, pine, salamuri crude, alimente fermentate din cereale i leguminoase.

Microorganismele intervin i n fermentarea unor produse vegetale: varza, murturi, msline, castravei, cacao, etc.

Biotehnologiile n industria alimentar s-au dezvoltat impresionant prin folosirea enzimelor exogene (industria laptelui, berii, spirtului, amidonului, crnii, sucurilor de fructe, zahrului, panificaiei, etc.) i a culturilor starter (industria berii, laptelui, crnii, panificaiei, etc.) La toate acestea trebuie s avem n vedere obinerea de metabolii secundari (alcool etilic, aceton, acizi organici, aminoacizi, etc.) prin folosirea de microorganisme precum i de biomas alimentar i furajer, etc.

Cu ajutorul enzimelor microorganismelor se pot accelera procesele biochimice, se pot perfeciona procesele de producie, se poate mbunti calitatea produselor alimentare i se poate mri gradul de diversificare a produciei alimentare.

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________1.2. Preparate enzimatice1.2.1. Aspecte generale

Enzimele sunt din punct de vedere structural proteine constituite din aminoacizi, iar din punct de vedere funcional acioneaz ca nite biocatalizatori biologici care au rolul de a permite realizarea unor reacii cu o vitez mrit.

Enzimele sunt utilizate drept catalizatori n condiiile n care exist i catalizatori chimici, deoarece prezint urmtoarele avantaje:

1. Au capacitatea de a cataliza reaciile chimice n condiii blnde de temperatur, pH, presiune. Aceasta permite un consum mai redus de energie i nu necesit echipamente scumpe rezistente la coroziune.

2. Enzimele sunt catalizatori specifici, deseori stereoselective, care nu conduc la obinerea de produi de reacie secundari nedorii. n aceste condiii nu sunt necesare cheltuieli mari privind rafinarea i purificarea produsului ce urmeaz a fi fabricat.

3. Comparativ cu procesele chimice, enzimele sunt din punctul de vedere al mediului compui biodegradabili care nu necesit costuri semnificative de epurare.4. Anumite enzime nu sunt limitate numai la aciunea n mediul apos, putnd aciona i la interfaa dintre dou faze, ap: solvent organic sau ap:ulei etc.

Totui exist i o serie de dezavantaje: au stabilitate limitat;

de cele mai multe ori sunt utilizate industrial o singur dat.

Clasificarea enzimelor. Enzimele se clasific conform sistemului stabilit de Comisia de Enzime a Uniunii Internaionale de Biochimie (1979). Conform acestei clasificri exist 6 clase principale grupate conform cu reaciile pe care le catalizeaz astfel:1. Oxidoreductaze care catalizeaz reacii de oxidoreducere, transfer de atomi de hidrogen, oxigen sau electroni;

2. Transferaze care catalizeaz transferul unei grupri de pe o molecul pe alta;3. Hidrolaze ce catalizeaz scindarea hidrolitic (implic apa) a legturilor chimice covalente;

4. Liaze, care catalizeaz scindarea legrutilor chimice altfel dect prin hidroliz sau oxidare;

5. Izomeraze ce catalizeaz rearanjarea structural a moleculelor;

6. Ligaze sau sintetaze care catalizeaz formarea de noi legturi te tip C-N, C-O, C-C, C-S, cu consumare de ATP.

Utilizri ale enzimelor n industrie:

Principalele domenii n care enzimele i-au gsit utilizri sunt:

Fabricarea unor produse prin transformarea enzimatic a amidonului;

La fabricarea altor produse alimentare : produse lactate, bere, sucuri, vin, panificaie; n compoziia detergenilor;

Industria textil, hrtiei i a furajelor pentru animale;

Sinteza catalitic a unor substane chimice;

Analiza alimentelor, diagnoz chimic i terapie;

Inginerie genetic;

Biotehnologia preparatelor enzimatice este un domeniu de baz al biotehnologiei, avnd drept scop studierea tehnicilor de obinere a preparatelor enzimatice folosind materii prime de origine animal, vegetal i microbian, sub form liber sau imobilizat pentru a fi folosite ca ageni biologici n industria alimentar, industria furajelor, industria textil, detergenilor, farmaceutic, cosmetic, chimic, etc. Prin utilizarea preparatelor enzimatice, tehnologiile tradiionale se transform n biotehnologii, devenind mai eficiente i mai puin poluante. n figura 1.2. este prezentat ponderea de utilizarea a preparatelor enzimatice n diferite ramuri.

Figura 1.2. Poderea utilizrii preparatelor enzimatice

Aa cum se observ din datele de mai sus, cea mai mare pondere o are utilizarea n industria alimentar, urmat de industria detergenilor.

n figura 1.3. sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice produse pe plan mondial. Cea mai mare pondere o au preparatele de proteaze urmate de amilaze.

Figura 1.3. Principalele tipuri de preparate enzimatice.

1.2.2. Tipuri de preparate enzimatice. Preparatele enzimatice se comercializeaz sub diverse forme i grade de purificare:

Preparate enzimatice solide:

1. Preparate enzimatice brute, sub form de pulbere, obinute prin uscarea i mcinarea mediului fermentat;

2. Preparate sub form cristalizat, enzime pure utilizate preponderent n chimia analitic i ingineria genetic;

3. Preparate liofilizate, care sunt enzime purificate n amestec cu substane crioprotectoare, care sunt urcate n vacum la temperaturi de -20......-50(C.

Preparate enzimatice lichide

1. Preparate enzimatice brute, form sub care se livreaz enzimele extracelulare (eliberate de ctre microorganisme n mediul de cultur n timpul fermentaiei).

2. Preparate parial purificate, n care se adaug conservani pentru a le mri stabilitatea n timp.

In tabelul de mai jos sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice, sursele din care se obin i aplicaile n industria alimentar.

1.2.3. Surse de enzime

Preparatele fabricate la scar industrial folosesc trei tipuri de surse: esuturi animale i vegetale sau microorganisme.

Sursele animale sunt reprezentate de subprodusele din industria crnii (ficat, pancreas, inim, rinichi, creier, mucoas stomacal i intestinal). Utilizarea acestr surse este pe scar din ce n ce mai redus, fiind nlocuite de sursele microbiene, deoarece sursele animate prezint o serie de dezavantaje, cum ar fi: producia limitat, apariia unor boli cum ar fi encefalopatia spongiform la bovine.

Principalele enzime de origine animal care se obin sub form de preparate sunt chimozin (renina) care se extrage din stomacul de miel sau viei care se utilizeaz pentru coagularea laptelui la fabricarea brnzeturilor. O alt enzim este (-amilaza pancreatic care are utilizri n industria farmaceutic.

Sursele vegetale sunt reprezentate de semine(germinate sau negerminate), rdcini, fructe, sev, latexuri, frunze. Utilizarea surselor vegetale pentru obinerea preparatelor enzimatice ridic o serie de probleme, cum ar fi: prezena unor substane potenial duntoare sntii omului (ex. Compuii fenolici) sau a unor compui toxici de comtaminare. Aceste dezavantaje face ca sursele de origine vegetal s fie destul de puin utilizate. Principalele enzime obinute din surse vegetale sunt.

- papaina, proteaz obinut din latexul fructelor de Caryca Papaia. Enzima este utilizat pentru tenderiyarea crnii sau n industria berii;

- ficina, proteaz obinut din latexul fructului de smochin (Ficus carica), utilizat pentru degradarea proteinelor miofibrilare.

- bromelina, proteaz obinut din sucul de ananas ( Ananas comosus ), folosit pentru hidroliya proteinelor colagenice.

Alte enzime de origine vegetal sunt lipoxigenaza din soia i complexul enzimatic din mal ( amilaze, proteaze, glucanaze). Preparatele enzimatice ale acestor enzime nu sunt purificate, fiind sub form de fin de soia sau de mal.

Microorganismele reprezint principala surs pentru obinerea de preparate enzimatice. Avantajele utilizrii microorganimelor constau n:

- microorganismele se pot obine n cantiti mari (biomas) prin cultivare n instalaii speciale pe medii de cultur ieftine (tr de gru, extract de porumb, melas, roturi de soia sau floarea soarelui, zer),

- ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt fa de cel al plantelor sau animalelor;

- producia de enzime de ctre microorganisme poate fi mrit prin selectarea i utilizarea de tulpini mutante, nalt performante (productive) i prin stabilirea condiiilor optime fizice i chimice pentru producerea de enzime;

- proprietile enzimelor i specificitatea de aciune difer cu natura microorganismelor productoare, astfel industrial se pot obine preparate care corespund ntocmai scopului dorit.

- preparatele enzimatice obinute pot avea activiti diferite cu predominana unei activiti.

1.2.4. Tehnologii de obinere a preparatelor enzimatice

Schema tehnologic general de obinere a preparatelor enzimatice este prezentat n figura Tehnologia de obinere a preparatelor enzimatice implic operaiile indicate n schema prezentat n fig. 1.4. din care rezult ca preparatele enzimatice pot fi obinute sub form de:

- preparate enzimatice brute-uscate;

- preparate enzimatice brute lichide concentrate;

- preparate enzimatice purificate concentrate, respectiv i uscate.

Figura 1.4. Schema tehnologic general de obinere a preparatelor enzimaticeProcesele biotehnologice de obinere a preparatelor microbiene sunt complexe, realizarea lor presupune parcurgerea a trei etape:

1. Pregtirea mediului de cultur, prin prelucrarea mecanic i fizico chimic a materiilor prime ce intr n compoziia mediului de cultur (fermentativ). Aceast etap presupune operaii de dozare, mrunire, solubilizare, sterilizare etc.

2 Etapa biologic care const n obinerea culturilor starter intermediare i a culturii de producie, urmat de etapa fermentativ prorpiu-zis. 3. Etapa de separare, purificare i standardizare a enzimelor.

A. Pregtirea mediului de culturMaterii prime utilizate pentru fabricarea mediilor de cultur.Materiile prime trebuie s asigure principalii nutrieni microorganismelor n vederea dezvoltrii lor n timpul fermentaiei.

Surse de carbon. Principala surs de carbon (surs de energie) pentru microorganisme o constituie glucidele, sub form de glucoz, fructoz, galactoz care sunt uor asimilabile, n timp ce maltoz, zaharoza i lactoza sunt asimilate doar dac microorganismele posed enzime capabile s le transforme n monoglucide. Poliglucidele pot fi utilizate doar de ctre microorganismele apte s sitetizeze enzimele care s le hidrolizeze extracelular n monoglucide capabili s difuzeze prin membrana celular.

Ca surse de carbon n reetele mediilor industriale se folosesc urmatoarele:

- Melasele care provin de la rafinarea zahrului.- Extractul de porumb, este reprezentat de extractul obinut din industria amidonului dup ce sufer o concentrare pn la 50% S.U. - Leiile sulfitice provin din industria hrtiei ca urmate a transformrii masei lemnoase n pulp celulozic sub aciunea bisulfitului de calciu.

Surse de azot. Azotul din mediul de cultur are rol anabolic, participnd la biosinteza proteinelor structurale, a enzimelor i acizilor nucleici. Principalele surse de azot sunt:

- azot anorganic: amoniac, sruri de amoniu, sulfatul de amoniu, forfatul acid de diamoniu,

- azot organic: hidrolizate proteice de cazein, soia, carne etc.

Surse de ioni anorganici. Pentru dezvoltarea microorganimelor n timpul procesului de fermentaie este necesar prezena ionilor anorganici, acetia reprezint circa 8% din substana urcat a a celulelor microbiene. Principalii ioni anorganici care trebuie s fie prezeni n mediul de cultur sunt: macronutrienii (azot, fosfor, sulf, potasiu, i magneziu) i micronutrienii (sodiu, calciu, clor, fier, cobalt, zinc, molibden, cupru, mangan, nichel i seleniu). Surse de factori de cretere. Factorii de cretere sunt compui organici a cror prezen n mediul de cultur este necesar n cantiti mici, avnd un rol catalitic sau structural pentru microorganisme. Factorii de cretere includ vitaminele, purine, pirimidine, nucleotide i nucleozide, aminoacizi, acizi grai, steroli i poliamide.

Principalele vitamine necesare ca factori de cretere sunt: biotina, acid pantotenic, acidul nicotinic, tiamina.

Tratementul termic al mediilor de cultur. Pentru buna desfurare a procesului de fermentaie este necesar cultivarea microorgnimelor pe un mediu de cultur steril pentru a preveni contaminarea. Sterilizarea mediului de cultur se poate realiza direct n bioreatorul n care se realizeaz fermentaia sau ntr-un vas sub presiune separat, ulterior fiind transferat n bioreactor.

B. Etapa biologic.

Obinerea culturilor starter de producie

Pentru producerea enzimelor, fermentaiile industriale se desfoar n volume de 150 250 de mc de mediu, motiv pentru care trebuie pregtit o cantitate suficient de inocul. Cultura folosit drept inocul trebuie s fie n faza exponenial de cretere. La microorganismele care au vitez de cretere redus, se recomand s se foloseasc o cantitate mai mare de inocul, pentru a se reduce durata iniieirii fermentaiei. Cultura starter de producie trebuie s conin celule active, adaptate la mediul industrial pentru ca fermentaia s se declaneze rapid. n cazul fermentaiilor desfurate pe mediul solid, pentru care se utilizeaz inocule sporifere se recomand s se asigure prin inoculare concentraii de 105-106 spori pe g mediu, iar n cazul celor submerse cultura starter de producie s fie de circa 10% din mediul de cultur.

Figura 1.5. Schema bloc pe operaii de obinere a preparatelor enzimatice microbiene bruteTehnici de fermentaiePentru producia de preparate enzimatice de origine microbian se poate aplica dou tehnici de baz :

Fermentaia de suprafa n care se utilizeaz un mediu solid pe care se cultiv microorganismul (de regul un mucegai filamentos). Aceast tehnic are avantajul c mediul de cultur va deveni un mediu bogat n activitate enzimatic ;

Fermentaia de submers, n care mediul este lichid ce se afl ntr-un reactor unde toi parametrii fermentaiei sunt perfect controlai. Aceast ultim tehnic este superioar primei metode din punct de vedere tehnologic i biochimic.

Dintre speciile de microorganisme ce se folosesc menionm urmtoarele : Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Saccharomyces cerevisiae, Endothia parasitica, Penicillium emersonii, Kluyveromyces lactis, Bacillus amylolichefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Actinoplanes missouriens, Klebsiella planicola.

La sfritul fermentaiei microorganismul trebuie distrus cu condiia pstrrii intacte a activitii enzimatice.

Microorganismele cultivate pot produce enzime extracelular sau intracelular. n funcie de tipul acestora variaz i procedeul de extracie. n ceea ce privete tipurile de culturi submerse, ne putem situa n unul din urmtoarele cazuri:

Procedeul nealimentat, n care caz toate ingredientele mediului de fermentare sunt pregtite n fermentator la pH-ul i temperatura dorit nainte de a introduce inoculum. Dup introducerea inoculum, fermentaia principal ncepe i finalizarea ei se urmrete prin prelevarea de probe, n mod steril, care arat :

- creterea microorganismelor (biomas, vscozitatea mediului) ;

- concentraia n enzim (activitatea enzimatic a mediului) ;

- consumul de glucide ;

- nivelul de proteine.

La procedeul nealimentat se pot monta diferii senzori care arat :

- pH-ul care se poate regla prin adaus de baze sau acid ;

- temperatura care se poate regla prin debitul de circulaie al apei reci n mantaua fermentatorului sau n serpentina din interiorul fermentatorului ;

- nivelul de spum care se poate combate cu un antispumant aflat ntr-un rezervor ataat fermentatorului;

- presiunea care se regleaz prin supape care se deschid la presiuni de 1 pn la 3 bar ;

- coeficientul respirator QR care se msoar prin cantitatea de CO2 produs fa de cantitatea de oxigen consumat ;

- nivelul de oxigen consumat, pornind de la analiza efluenilor.

Procedeul alimentat, n care se ncepe cu un volum de 10 30% de substrat n care se introduce inoculum, dup care fermentatorul se alimenteaz cu restul de mediu, dup care oprirea fermentaiei se face dup un anumit timp fixat experimental. Acest procedeu se aplic n cazul n care sinteza enzimelor ar fi reprimat de concentraiile ridicate ntr-unul din nutrienii mediului de cultur sau n cazul cnd creterea microorganismelor, n funcie de concentraia n unul din componenii mediului, ar provoca creterea vscozitii, care trebuie s fie reglat n timp. Alimentarea fermentatorului poate fi repetat de mai multe ori efectundu-se sutiraje (evacuri) programate, dar ntotdeauna trebuie lsat n fermentator un volum de ( 30%, care servete n acest caz drept cultur de producie.

Fig. 1.8. Cultivarea submers a microorganismelor.

Procedeul continuu necesit alimentarea continu a fermentatorului cu mediu i folosirea unei culturi concentrate de microorganisme. n acest caz, bioreactorul (fermentatorul) de dezvoltare a celulelor este cuplat cu o unitate de micro sau ultrafiltrare. n figura 1.9. se arat schia unei astfel de instalaii format dintr-un bioreactor cuplat cu o unitate de ultrafiltrare la care exist i posibilitatea de a recicla biomasa.

Procedeul continuuAvantajele unui astfel de procedeu sunt urmtoarele :

-se poate detoxifica mediul de cultur prin eliminarea produsului de inhibare ;

-celulele reciclate devin perfuzate ;

-cantitatea de mediu de cultur care se introduce n bioreactor este controlat de cantitatea de permeat care traverseaz membrana de ultrafiltrare ;

-celulele au posibilitatea de a se dezvolta pn la concentraii relativ mari (( 300 g substan uscat/l, n cazul drojdiilor) ;

-aceste concentraii mari de celule se constituie ca o barier eficace fa de contaminarea exterioar ;

-retenatul poate fi evacuat i el periodic, fiind constituit din biomas care conine enzime intracelulare, dup care este trecut la prelucrare ulterioar (extracie) ;

-permeatul de la ultrafiltrare, care conine enzime nu mai are celule microbiene i poate fi, deci, stocat sau dirijat direct la o operaie n aval de purificare sau concentrare.

Neajunsurile acestui procedeu de obinere a biomasei i enzimelor sunt urmtoarele :

-membranele trebuie s fie rezistente la sterilizarea cu vapori de ap i la igienizare cu substane chimice ;

-costurile energetice sunt destul de ridicate;

-mediul de cultur poate fi colmatant pentru membrana de ultrafiltrare;

-chiar la densiti mari de celule, la sfritul ciclului de dezvoltare este posibil o oarecare liz a celulelor, ceea ce face necesar o purjare a bioreactorului prin unitatea de ultrafiltrare, fapt care conduce la micorarea vrstei medii a celulelor care rmn n sistem.

O variant a procedeului continuu de obinere a biomasei/ enzimelor const n folosirea bioreactorului cu membran.

C. Etapa de separare a enzimelor

Extracia. La procedeul discontinuu (nealimentat) i cel alimentat, dup terminarea fermentaiei se separ partea solid insolubil (celule i produse insolubile) de partea lichid care conine enzimele, separare care se poate face prin centrifugare, filtrare frontal sau microfiltrare. Soluia steril obinut este apoi ultrafiltrat pentru a concentra enzimele. n cazul n care enzimele sunt destinate a intra n compoziia unui preparat comercial lichid, ultrafiltratul se stabilizeaz cu polioli (sorbitol, glicerol) i/sau sruri (NaCl, MgSO4), respectiv se adaug bacteriostatici alimentari (benzoat, sorbat, ascorbat).

n cazul n care enzima (enzimele) intr n compoziia unui preparat comercial pulbere, ultrafiltratul se suplimenteaz cu un suport i se usuc prin atomizare (suplimentarea se face cu amidon, dextrine). nainte de atomizare mai poate fi realizat o filtrare steril.

Pentru a obine i enzimele intracelulare, biomasa din fermentator, separat de partea lichid, este supus lizei. Liza poate fi realizat chiar de enzimele proprii microorganismelor ce alctuiesc biomasa, fie prin folosirea de preparate exogene, cum ar fi lizozimul din albuul de ou, preparate enzimatice exogene complexe de natur bacterian care conin chitinaz, mananaz, (-1,6glucanaz, proteaze, cteodat n combinaie cu adaosul de metabisulfit.

n cazul n care enzima este periplasmic, un oc osmotic este suficient pentru a elibera enzimele. Se poate realiza i o liz mecanic (folosire de presiuni mari de 600 1000 bar, urmat de detenta brutal) Se pot folosi i ultrasunetele cu frecvene mai mari de 20 MHz pentru liza celulelor i deci pentru eliberarea enzimelor intracelulare. Odat eliberate, enzimele intracelulare sunt supuse operaiilor aplicate i enzimelor extracelulare.

Preparatele enzimatice se comercializeaz de regul sub form de pulbere, de microgranule, precum i sub form lichid.

Preparatele enzimatice sub form de pulbere sunt formulate cu un suport cum ar fi amidonul, maltodextrinele, zahrul, sarea. La aceste preparate se controleaz granulometria, umiditatea (( 6%). Suportul trebuie s nu fie higroscopic pentru a se evita formarea de cocoloae. n preparatele comerciale pulbere sau lichide, coninutul de enzim este redus raportat la suport i de aceea cantitatea de preparat comercial este mult mai mare, n comparaie cu nivelul de enzim coninut.

n ceea ce privete preparatele comerciale microgranulate, acestea se obin dintr-un ultrafiltrat care se amestec cu un suport (sare, amidon solubil, maltodextrine etc.). Cantitatea de substrat este astfel calculat nct s se obin titrul enzimatic dorit n microgranule. Amestecul respectiv este pulverizat mpreun cu un agent liant care reprezint 0,1% pn la 0,5% fa de masa suportului. Picturile pulverizate sunt uscate ntr-un turn de uscare, cu aer la 70 - 90(C.

Preparatele comerciale lichide sunt formulate n general cu polioli (gliceroli, sorbitol) care se utilizeaz n proporie de 20 50% fa de preparatul lichid. La aceste formulri se adaog o substan bacteriostatic (de exemplu benzoat de sodiu n proporie de 0,1 0,2%).

1.2.5. Enzime imobilizate

Imobilizarea unei enzime (sau a unui sistem multifuncional) nseamn legarea sau fixarea acesteia de un suport care trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii :

-s fie insolubil n ap ;

-s asigure pstrarea proprietilor catalitice ale enzimelor, respectiv specificitatea de aciune ;

-s asigure aciunea enzimei la un pH i temperatur optime, apropiate de cele ale enzimelor libere (neimobilizate).

Avantajele imobilizrii enzimelor sunt urmtoarele :

creterea stabilitii enzimei, ca protein i ca activitate catalitic. Aceast stabilitate este n legtur cu diminuarea gradului de libertate al macromoleculei, ceea ce are consecin asupra variaiilor de conformaie a enzimei (se diminueaz aceste variaii). Imobilizarea conduce i la cretere a concentraiei locale a protein-enzimei care are un efect stabilizant;

se poate lucra n flux continuu din punct de vedere al catalizei enzimatice, dar i din punct de vedere al reglrii automate a parametrilor de lucru;

enzima nu ptrunde n substratul ce se trateaz n cursul catalizei enzimatice;

se poate modula micromediul n care acioneaz enzima imobilizat (concentraie substrat, ncrcarea suportului cu enzim, gruprile hidrofile);

refolosirea treptat a enzimei, deci cu aceeai cantitate de enzim se poate transforma o cantitate mai mare de substrat;

se poate lucra n sistem semicontinuu sau continuu, putndu-se automatiza procesul, ceea ce asigur un control riguros al parametrilor de lucru;

are loc o cretere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de substrat i al concentraiei acestuia;

se poate stopa reacia enzimatic la momentul dorit i se evit trecerea enzimei n produsul transformat;

costurile globale de producie sunt mai mici n comparaie cu procedeele n care se folosesc enzime libere;

se pot folosi i enzime care nu sunt trecute n liste GRAS (Generally Reconized as Safe);

Exist i dezavantaje, cum ar fi:

costuri privind imobilizarea;

pierderi ale activitii enzimatice,

o investiie iniial n utilaje mai mare,

un proces mai complex din punct de vedere tehnic i o supraveghere mai atent;

utilizarea numai a unor substraturi solubile.

Aspecte teoretice privind enzimele imobilizate.

n cazul enzimelor imobilizate se observ un comportament cinetic diferit fa de cel al enzimelor libere, solubile. Activitatea enzimatic scade ca urmare a imobilizrii. Acest lucru se datoreaz schimbrilor conformaionale ale enzimei dup imobilizare. O astfel de modificare apare n primul rnd n cazul legrii covalente a enzimelor de suport. Un alt aspect este influena mediului, n cazul enzimelor imobilizate acesta este diferit de cel apos. Astfel, gruprile funcionale acide

La imobilizare, n funcie de enzim i catalizator se poate vorbi de :

- randament de fixare care reprezint cantitatea efectiv de enzim imobilizat n raport cu cantitatea de enzim introdus n procesul de imobilizare :

enzim fixat pe suport

( = (((((((((((( 100

enzim utilizat

- randament de activitate care reprezint activitatea rezidual a enzimei imobilizate:

Activitatea (E0) dup fixare

((((((((((((((( 100

Activitatea (E0) nainte de fixare

Factorii critici care trebuie luai n consideraie la folosirea enzimelor imobilizate

Aceti factori se refer la :

eficiena economic a imobilizrii determinate de : costul enzimei, costul suportului, costul tehnicii de imobilizare ;

activitatea enzimei imobilizate care este influenat de : tehnica de imobilizare; caracteristicile materialului suport, viteza de difuzie a substratului la enzim i a produsului (lor) de transformare ;

caracteristicile substratului ce trebuie transformat ;

stabilitatea enzimei care trebuie meninut activ un timp ct mai ndelungat ;

contaminarea microbiologic a sistemului enzim/suport n timpul utilizrii reactorului respectiv.

Figura 1.10. Metode de imobilizare a enzimelor

Metode de imobilizare a enzimelor

a) Metode fizice, la care enzima se leag de un suport prin intermediul legturilor slabe sau relativ puternice (legturi Van der Waals, legturi de hidrogen, interaciuni protein protein, legturi ionice).

Imobilizarea n cadrul metodelor fizice poate fi :

- prin adsorbie pe suporturi organice : amidon, colagen, Sepharoz modificat, polistiren modificat, rini schimbtoare de ioni (DEAE celuloz, DEAE Sephadex, carboximetil-celuloz, Amberlit, Dowex 50 etc.) ;

- prin adsorbie pe suporturi minerale : alumin, argil (bentonit, montmonirolit etc.), ceramic, hidroxiapatit, sticl poroas sau silice poroas, titanit (puni metalice cu TiCl4). Adsorbia se realizeaz prin contactul dintre o soluie apoas de enzim cu suportul solid i va fi influenat de : pH, tipul de solvent utilizat pentru solubilizarea enzimei, puterea ionic, calitatea enzimei, temperatura i durata de contact a enzimei cu suportul. Practic imobilizarea se face prin amestecul dintre soluia de enzim i suport ntr-un reactor cu agitator sau prin trecerea soluiei de enzim ntr-o coloan n care suportul este meninut sub forma unui pat. Adsorbia enzimei de suport poate fi mbuntit prin ataarea de suport a unor cofactori, cum ar fi piridoxal-fosfatul sau lanuri cu grupri hidrofile.

Adsorbia este influenat de raportul dintre suprafaa i volumul suportului, mrimea particulelor, raportul dintre gruprile hidrofile i hidrofobe.Avantajele i dezavantajele imobilizrii prin adsorbie

Avantaje

Simplicitate n execuie (incubarea enzimei cu suportul, agitare cteva minute, enzima care rmne n soluie fiind eliminat prin splare). Absena reaciilor chimice (numai dac nu se formeaz puni metalice). Posibilitatea de regenerare a complexului enzim/suport.

Dezavantaje

Stabilizare slab. Riscul de desorbie a enzimei de ctre : fluxul de substrat, variaie lejer de pH, fora ionic, temperatur

-prin includere ntr-un suport, n care caz se pot include i microorganisme. Includerea poate fi fcut n gel, microincapsulare, includere n fibre.

Avantaje

Reaciile de polimerizare sau gelificare sunt bine cunoscute

Reaciile chimice dintre suport i enzim sunt limitate (enzima este inclus n geluri naturale)

Se poate aplica la toate enzimele (chiar i la amestec de enzime)

Se pot folosi suporturi cu forme diferite : filme, fibre, bile.

Riscul de evadare a enzimei este redus prin reticularea suportului dup imobilizare

Dezavantaje

Anumite polimerizri necesit ageni denaturani sau radicalici

Se pun probleme de transfer de mas (inaccesibilitatea unor substraturi la enzim)

Riscul de evadare al enzimei prin micropori

Proprietile mecanice ale gelurilor sunt nesatisfctoare

Avantajele i dezavantajele imobilizrii enzimelor prin incluziune

b) Metode chimice de imobilizare, n care caz imobilizarea se face prin intermediul legturilor covalente de suporturi insolubile, care posed grupri reactive sau care pot fi activate prin diferite reacii chimice. Se poate realiza imobilizarea i prin copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv i legarea ncruciat (Cross-linking) sau reticular intra i intermolecular a enzimelor de un suport prin intermediul unui reactiv multifuncional.

La legarea prin legturi covalente, imobilizarea poate fi fcut : prin fixare de un suport insolubil, dar trebuie s se in seama de gruparea funcional care poate reaciona cu protein-enzima i de caracteristicile fizico-chimice ale suportului. Adesea este necesar s se creeze, pe cale chimic, funcii reactive pe suport; prin coreticulare utiliznd ageni bi- sau polifuncionali. Cel mai mult utilizat pentru reticulare este glutaraldehida.

Avantajele i dezavantajele legrii enzimelor de suport prin legturi covalente

Avantaje

Stabilitate mrit datorit faptului c legturile covalente sunt cele mai puternice dintre toate legturile menionate anterior

Varietatea mare a suporturilor : sticl, silice, ceramic, celuloz, polimeri sintetici etc.

Posibilitatea de a efectua imobilizarea n prezena unui substrat pentru a se evita inactivarea (protecia situsului activ).

Dezavantaje

Trebuie realizate reacii chimice, adesea complexe

Etapa de activare a suportului este lung

Randamentul de fixare este ( 100%

Exist riscul modificrii chimice a enzimei (pierdere de activitate)

Este necesar ca enzima s fie purificat n prealabil

Investiia (costul) este important

Suporturi de imobilizare comerciale

Suporturile comerciale cele mai des utilizate pentru imobilizarea enzimelor sunt :

polizaharide : agaroz, celuloz i derivai, alginai, carageenani, dextrani ;

poliacrilamide utilizate sub form de bile ;

polistiren (bile i tuburi) ;

silicea i sticla poroas.

1.2.6. Condiiile de inocuitate pe care trebuie s le ndeplineasc preparatele enzimaticeNumr total de germeni (NTG), maximum 5.104/g ;

Coliformi, maximum 30/g ;

Escherichia coli absent/ 25 g ;

Salmonella absent/ 25 g ;

Activitate antibiotic de origine microbian absent ;

Aflatoxina B1, ochratoxin A, sterigmatocistin, toxina T 2 (zearalenona) n cazul preparatelor de origine microbian absente ;Metale grele :

-arseniu

( 3 mg/Kg ;

-plumb

( 10 mg/Kg ;

-alte metale grele ( 40 mg/Kg (exprimat la Pb).

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________1.3. CULTURI STARTER DE MICROORGANISME

Microorganismele sunt utilizate n industria alimentar pentru:

Obinerea de celule (culturi starter = culturi pure) care la rndul lor sunt folosite pentru fermentarea produselor lactate acide sau brnzeturi, la fabricarea produselor de carne (salamuri crude uscate), produse tradiionale vegetale, produse lactate acide, pine etc. n acest produsele se consum fie mpreun cu celulele respective fie dup ndeprtarea celulelor cum este cazul buturilor de tipul berii, vinului. Obinerea de biomas care poate fi utilizat ca ingredient de fermentare (drojdia de panificaie ) sau de mbogire a unor produse alimentare cu proteine, respectiv ca furaje proteice pentru psri, pete, porcine. n ceea ce privete metodele de cultivare ale microorganismelor se folosesc metode periodice (discontinui) i metode continui, n ambele cazuri fiind necesar optimizarea procesului. Metoda periodic de cultivare a microorganismelor prevede alimentarea continu a aparatului de cultivare cu substane nutritive i nlturarea culturii de microorganisme. n acest fel, se creeaz condiii optime de acumulare a cantitii necesare de biomas sau a metaboliilor. La cultivarea periodic concentraia substanelor nutritive scade, iar cea a celulelor i metaboliilor crete, fapt care conduce la modificarea cineticii creterii microorganismelor.

La metoda periodic trebuie s avem n vedere dou situaii i anume:

cnd substratul este inhibitor pentru producia de biomas i metabolii;

cnd produsul este inhibitor.

Prima situaie se ntlnete la obinerea biomasei de drojdie de panificaie, represiunea catabolic de ctre glucide antreneaz i o producie de alcool etilic, producie ce trebuie evitat prin dou soluii i anume: evitarea excesului de substrat i lucru cu cultura n pat i respectiv plasarea unui detector de alcool n efluentul de gaz (CO2) care permite s se cunoasc ce aport de substrat trebuie furnizat.

A doua situaie se ntlnete la producia de culturi lactice a cror dezvoltare este nsoit de acumularea de acid lactic (bacterii lactice homofermentative) sau acid lactic i acetic (bacterii lactice heterofermentative).

Soluia care se impune n acest caz este o dializ a culturii sau centrifugarea substratului cu celule, celulele fiind apoi reciclate.

Dac dezvoltarea culturii are loc fr acumularea de metabolii, alimentarea cu substrat se poate face la un debit constant, dar la o concentraie cresctoare a acestuia, respectiv la o concentraie constant a substratului dar la un debit programat exponenial.

Metoda continu, n care caz are loc alimentarea constant a aparatului de cultivare a microorganismelor cu substane nutritive i eliminarea nentrerupt a biomasei sau metaboliilor. Aceast metod poate fi realizat prin cultivarea de suprafa sau de adncime a microorganismelor.

La fermentarea continu se are n vedere natura catalizatorului (imobilizat sau nu; sistem eterogen sau nu; celule incluse, adsorbite, grefate prin covalen); gradul de reciclare al celulelor microbiene; gradul de amestecare a fluidelor n reactorul cu funcionare continu.

Creterea concentraiei de celule se poate realiza prin: folosirea tehnicilor de membran sau centrifugarea; folosirea de celule imobilizate; reciclarea celulelor.

1.3.1. Microorganisme utilizate n industria alimentarBACTERIILE utilizate n industria alimentar aparin urmtoarelor genuri:

Genul Streptococcus Acest gen cuprinde specii de bacterii sub form de coci sferici sau ovali cu ( ( 2(, grupate n diplo sau form de lanuri. Sunt Gram pozitive, facultativ anaerobe, neciliate, nesporulate, unele specii fiind capsulate.

Importani pentru industria alimentar sunt:

Streptococii mezofili : Streptococcus lactis (Lactococcus lactis subsp. lactis), Str. cremoris (Lactococcus lactis subsp. cremoris), Str. diacetilactis (Lactococcus lactis subsp. diacetilactis);

Streptococii termofili: Str. thermophilus.Aceti streptococi lactici sunt homofermentativi, produc acid lactic L(+) i prezint urmtoarele activiti:

- activitate fermentativ: fermenteaz lactoza i glucoza;- activitate proteolitic;- produc diacetil i acetoin din acid citric ( n principal Str. diacetilactis).

Fermentarea lactozei de ctre streptococii lactici se face prin transformarea iniial a acesteia n glucoz i galactoz 6P prin intermediul fosfo-(-galactozidazei. n continuare, glucoza este apoi fermentat pe calea hexozo difosfatului n acid lactic, iar galactoza 6P este utilizat pe calea tagatozei n vederea producerii unei cantiti suplimentare de acid lactic (fig. 1.11.).

Figura 1.11. Calea tagatozei de degradare a lactozei de ctre streptococii lactici

Fermentarea glucozei de ctre streptococii lactici poate fi fcut pe cale homofermentativ cu producerea n principal de acid lactic i pe cale heterofermentativ, n condiile n care glucoza este limitat, calea heterofermentativ fiind calea ribulozei 5P cu formare de acid acetic, etanol i acid lactic (fig. 1.12.).

Figura 1.12. Calea homo i heterofermentativ de degradare a glucozei de ctre bacteriile lactice

Fermentarea acidului citric cu formare de diacetil, acetoin i 2,3 butilenglicol este artat n figura 1.13. Acelai mecanism l folosesc i leuconostocii.

Figura 1.13. Transformarea citratului de ctre Str. lactis subsp. diacetilactis i LeuconostocGenul Leuconostoc Acest gen cuprinde bacterii cu form sferic, lenticular, grupate n perechi sau lanuri, imobile, asporogene, Gram negative, facultativ anaerobe.

Pentru dezvoltare, leuconostocii au nevoie de vitamine (acid nicotinic, tiamin, biotin) i zaharuri fermentescibile. Nu sunt proteolitici i nu reduc azotaii. Specii de Leuconostoc formeaz polimeri (dextran). Se dezvolt bine la 20-30(C.

Genul Leuconostoc cuprinde speciile: Leuconostoc cremoris (citrovorum); Leuconostoc lactis; Leuconostoc dextranicum; Leuconostoc mezenteroides.

Aceste specii sunt heterofermentative i se dezvolt greu n laptele fr adaos de stimulatori. n produsele lactate, leuconostocii au dou funcii de baz: - produc compui de arom (diacetil, acetoin); - produc ochiuri de fermentare prin formare de CO2 n unele tipuri de brnzeturi (Edam, Goude, Tilsit). Ambele funcii sunt realizate prin metabolismul citratului, dar leuconostocii produc CO2 i din lactoz. Leuconostocii intervin deci n metabolismul glucidelor i al citratului.

Metabolismul glucidelor Fermentarea glucidelor de ctre leuconostoci se face pe calea fosfocetohexozelor, dintr-un mol de hexoz regenerndu-se cte un mol de ATP. Genele care codific etapele iniiale ale fermentrii lactozei (ca de altfel i ale metabolizrii citratului, producerii de proteaze) sunt localizate n plasmide.

Metabolismul citratului Metabolismul citratului de ctre leuconostoci este acelai ca i la streptococi cu meniunea c leuconostocii produc diacetil i acetoin la pH sczut. Acetoina se poate forma pe dou ci:

- prin decarboxilarea acetolactatului;

- din diacetil prin intermediul diacetil reductazei, ntr-o reacie care necesit NADH sau NADPH. Aceast ultim cale este redus sau chiar lipsete n cazul lui Str. diacetilactis, din cauza capacitii limitate a acestuia de a produce acetil- CoA, unul din precursorii diacetilului.

Leuconostocii (ca de altfel i lactobacilii) pot produce la unele brnzeturi unele defecte i anume:

crparea pastei la brnza Cheddar ( defect numit Blit opennes);

apariia timpurie de gaze la brnza Goude (Str. diacetilactis poate produce i el defectul de plutire a coagulului, la brnza Cottage).

Aceste defecte se datoreaz formrii de CO2. Pentru a se preveni defectul de plutire a coagulului, brnza Cottage se fabric cu o cultur care nu conine Str. diacetilactis, adugndu-se apoi n brnza obinut o cultur de Leuconostoc citrovorum cultivat pe lapte cu adaos de citrat sau o cultur concentrat de Leuconostoc citrovorum.

n afar de industria laptelui, leuconostocii se utilizeaz i pentru:

fermentarea unor produse vegetale (varz, castravei, msline) intervenind n cadrul microflorei spontane sau sub form de culturi concentrate;

fermentarea malolactic a vinurilor;

producia de dextran.

n industria laptelui se folosesc culturi lactice care conin streptococi acidifiani (Str. lactis i Str. cremoris), precum i bacterii productoare de arom i unele specii de Leuconostoc i Str. diacetilactis, ultimul fiind aromatizant i acidifiant.

Genul Pediococcus. Acest gen aparine familiei Streptococaceae i cuprinde bacterii sub form de coci perechi sau tetrade. Metabolismul acestor bacterii este predominant fermentativ, homolactic. Se produce acid lactic racemic (DL) din glucoz, fructoz, manoz. Sorbitolul i amidonul nu sunt fermentai. Multe specii sunt catalaz-negative, dar se ntlnesc i specii care au activitate catalazic independent de hem. Principalele criterii de difereniere ntre diferitele specii de pediococi sunt menionate n tabelul 3.8

P. acidilacti, n culturi starter, este utilizat pentru obinerea de produse din carne fermentate la temperaturi mai ridicate, deoarece are o dezvoltare bun la 42-52(C, producnd rapid acidul lactic i deci scade efectiv pH-ul, produsul obinut avnd gust acrior. Atunci cnd se utilizeaz la fermentarea unor produse de carne la temperatura de 16-27(C, producia de acid lactic este mai lent i implicit se pot dezvolta i microorganismele care contamineaz carnea, durata de fermentaie fiind mai mare.

P. pentosaceus produce o fermentaie rapid cnd substratul conine un glucid fermentescibil, temperatura de fermentare fiind cuprins ntre 15-27(C.Culturi starterTemperatura de incubare, (CDurata, orepH-ul

P. pentosaceus

P. acidilacti

P. pentosaceus

P. pentosaceus26,7

26,7

29,4

29,420

38

13

285,005,65

5,00

5,40

Din tabelul de mai sus rezult c P. pentosaceus este mai eficace n ceea ce privete producia de acid lactic att la 26,7(C ct i 29,4(C n comparaie cu P. acidilactici.

Avnd n vedere c pediococii produc acid lactic i bacteriocine, ei exercit o aciune inhibitoare fa de microorganismele patogene i cele de alterare (stafilocici, salmonele, Cl. botulinum, bacili, enterobacterii gram negative, drojdii).

n produsele de carne fermentate, pediococii pot scade pH-ul de la 5,6 la 4,5-5,2 ceea ce face ca proteinele s fie aduse aproape de punctul izoelectric fapt ce favorizeaz sinereza i deci uscarea produsului.

Acidul lactic produs contribuie la denaturarea proteinelor din carne ceea ce contribuie la realizarea unei texturi ferme a produsului finit.

Genul Lactobacillus. Acest gen aparine familiei Lactobacillaceae. Aceast familie cuprinde bacterii sub form de bastonae de lungimi i grosimi variabile, precum i cocobacili scuri, aezai obinuit n lanuri n faza de nmulire logaritmic. Sunt asporogene, imobile, Gram pozitive, anaerobe sau facultativ anaerobe. n general sunt catalaz negative citocrom-oxidaz negative, nu reduc azotaii, nu lichefiaz gelatina. Au activitate proteolitic i lipolitic redus. Glucidele cele mai bine fermentate sunt: lactoza, maltoza, zaharoza (mai ales n faza de dezvoltare), apoi hexozele (glucoza, fructoza, galactoza).

Pentru dezvoltare necesit substane minerale i toate vitaminele din grupul B. Se dezvolt bine n mediu cu pH 5,5-5,8, dar i la pH ( 5 . Se pot dezvolta n limite largi de temperatur (5-53(C), dar temperatura optim este cuprins ntre 30 i 45(C.

n funcie de temperatura optim de dezvoltare lactobacilii pot fi:

termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, temperatura optim fiind 37-45(C;

mezofili: L. casei, L. plantarum, L. brevis etc.; temperatura optim de dezvoltare fiind 26-30(C.

Orla Jensen a mprit genul Lactobacillus n urmtoarele grupe:

1. grupa Thermobacterium care cuprinde lactobacili homofermentativi termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, L. delbrueckii; L. leichmanii;

2. grupa Streptobacterium care cuprinde lactobacilii homofermentativi mezofili: L. casei, L, plantarum;

3. grupa: Betabacterium care cuprinde lactobacili heterofermentativi, ce contamineaz frecvent brnzeturile: L fermenti, L. buchneri, L. brevis, L. viridiscens.

Streptobacteriile la rndul lor, au fost clasificate de ctre unii autori n neacidorezistente i acidorezistente.

Lactobacilii neacidorezisteni produc compui aromatici (diacetil, acetoin). Se prezint sub form de bastonae de lungimi variabile i rar formeaz lanuri .

Se pot dezvolta la 2-15(C. Nu se dezvolt la pH ( 5,6. Se utilizeaz n culturi starter la fermentarea salamurilor crude cu pH = 5,6 6,1, produsele avnd o durat mare de maturare, iar gustul final fiind slab acrior dulceag.

Lactobacilii acidorezisteni au form de bastonae scurte care formeaz lanuri. Se dezvolt bine la pH ( 5,0.

Activitatea metabolic a lactobacililor n produsele alimentare fermentate se refer la metabolismul lactozei, galactozei i glucozei. Zaharoza este fermentat numai dup hidroliza acesteia n glucoz i fructoz.

Metabolismul lactozei Pentru a se dezvolta n lapte, lactobacilii homofermentativi hidrolizeaz lactoza cu ajutorul (-galactozidazei i/sau (-Dfosfogalactozid galactohidrolazei, aa cum arat n schema din figura 1.14.

Figura 1.14. Transformarea lactozei n glucoz i galactoz respectiv glucoza i galactoza 6P de ctre lactobacilii homofermentativi

(-D-galactozidgalactohidrolaza este utilizat de Lb. casei iar (-galactozidaza este utilizat de majoritatea lactobacililor (L. bulgaricus, L. lactis, L. helveticus etc.), dei acetia din urm au i activitate (-Dfosfogalactozidgalactohidrolazic, ns mai redus.

L. bulgaricus are (-galactozidaz activ la pH = 7,0 i este activat de Mg2+, Mn2+ i Fe2+. n cele mai multe cazuri, lactobacilii folosesc mai mult glucoza ca surs de energie n comparaie cu lactoza i galactoza. Unii lactobacili elibereaz n mediu galactoz care se acumuleaz.

Metabolismul hexozelor Dup hidroliza lactozei n celulele lactobacililor homofermentativi, hexozele rezultate sunt metabolizate pe calea Embden Meyerhof.

Lactobacilii heterofermentativi fermenteaz hexozele pe calea hexozomonofosfatului, aceti lactobacili neavnd aldolaz i triozofosfat izomeraz care sunt enzime cheie n calea Embden Meyerhof. Aceasta este de fapt i diferena dintre cele dou grupe de microorganisme, adic lactobacilii homofermentativi posed att aldolaz ct i triozofosfatizomeraz, n timp ce lactobacilii heterofermentativi nu posed aceste enzime.

Galactoza, rezultat din lactoz, pentru a fi fermentat trebuie mai nti s fie transformat ntr-un derivat fosforilat al glucozei (glucozo-6P), care apoi sufer transformri pe calea Embden Meyerhof (fig. 1.15.).

Figura 1.15. Transformarea galactozei n glucoz-6P de ctre lactobacili

Activitatea proteolitic. Activitatea proteolitic a lactobacililor contribuie att la textura ct i la aroma unor produse alimentare (produse lactate, produse vegetale fermentate, produse din carne fermentate etc.), dar i la eliberarea unor aminoacizi care stimuleaz creterea i activitatea altor bacterii lactice folosite n culturile starter n amestec cu lactobacilii. Se consider c activitatea endoproteinazic a lactobacililor este asociat cu membrana celulelor, iar activitatea exopeptidazic este localizat intracelular. Enzimele din membrana celulelor produc hidroliza parial a macromoleculelor proteice, din care se formeaz peptide suficient de mici pentru a fi transportate n interiorul celulelor unde se continu degradarea lor pn la aminoacizi, necesari creterii (figura 1.16.).

Activitatea proteolitic a lactobacililor este optim la pH 5,2- 5,8 i temperatura de 45-50(C. La temperaturi mai mari de 55(C activitatea proteolitic este mult redus datorit termodenaturrii enzimei iar la 70(C/1min enzimele sunt complet inactivate.

n cazul laptelui, proteinazele extracelulare ale L. bulgaricus sunt active fa de (-cazein, apoi n ordine descresctoare i fa de i ( cazein.

Figura 1.16. Aciunea endoproteinazelor extracelulare i a exopetidazelor intracelulare n cazul lactobacililor

Producerea de compui de arom i H2O2 Principala contribuie a lactobacililor este producia de acid lactic. n cazul produselor lactate acide, dei speciile de lactobacili implicate sunt homofermentative, acestea ns produc i ali metabolii, printre care produi volatili ca: acetaldehida, diacetil i alcool. In cantitate mai mare fiind produs acetaldehida. n plus, L. casei produce diacetil din citrat, mai ales atunci cnd laptele se suplimenteaz cu citrat (L. casei nu este ns un productor major de diacetil). Anumii lactobacili produc H2O2 care se acumuleaz n mediul i jeneaz dezvoltarea altora. Acumularea H2O2 n mediul de cultur este posibil pentru ca lactobacilii sunt catalaz negativi. Incapacitatea lactobacililor de a distruge metabolic H2O2 explic de ce acetia nu se dezvolt bine n condiii puternic aerobe, oxigenul fiind toxic pentru lactobacili care nu posed superoxiddismutaz, enzim care se constituie ca un sistem de protecie fa de toxicitatea oxigenului, cum este cazul altor bacterii.

Aciunea lactobacililor este mbuntit prin interaciuni cu alte bacterii lactice. De exemplu, cultura mixt format din L. bulgaricus i Str. thermophilus este adecvat pentru fabricarea iaurtului, deoarece cultura mixt produce mai rapid acid lactic.

Interaciunea dintre cele dou bacterii lactice este benefic din urmtoarele motive:

L. bulgaricus produce aminoacizi liberi, n particular histidin, care stimuleaz producia de acid lactic a lui Str. thermophilus;

Str. thermophilus, pe de alt parte, produce acid formic, care stimuleaz activitatea lui L. bulgaricus;

Str. thermophilus, dei produce o cantitate suficient i de CO2 care stimuleaz dezvoltarea lui L. bulgaricus, totui dezvoltarea acestuia este mai redus, deoarece Str. thermophilus utilizeaz mai rapid anumite substane nutritive eseniale pentru dezvoltarea lui L. bulgaricus. n plus, lactobacilii, n general, sunt sensibili chiar la niveluri foarte reduse de antibiotice, n comparaie cu Str. thermophilus ( de aici i necesitatea ca laptele s nu conin urme de antibiotice).

Utilizarea culturilor de lactobacili: n industria laptelui se utilizeaz Lactobacillus lactis i Lactobacillus bulgaricus, singuri sau n amestec la fabricarea iaurtului, chefirului, cumsului, brnzei Ementhal, brnzeturilor italiene. Lactobacillus helveticus este i el implicat n unele din aceste produse. Lactobacillus acidophilus este folosit la fabricarea laptelui acidofil, laptelui acidofil nefermentat i a altor produse acidofile. Lactobacillus casei se utilizeaz pentru obinerea produsului yakult.

n industria crnii intereseaz Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus i n special Lactobacillus plantarum care se caracterizeaz prin faptul c nu produce CO2 la fermentarea glucozei dar produce CO2 din gluconat. Riboza este fermentat la acid lactic i acid acetic. Posed activitate aldolazic, glucozo 6P dehidrogenazic. Prin fermentaie lactic se produce acid lactic racemic (DL). Lactobacillus plantarum este facultativ anaerob, nu produce NH3 din arginin. Poate acidifica laptele i are temperatura optim de dezvoltare la 30-35(C. Nu necesit pantotenat, tiamin, niacin pentru dezvoltare.

Lactobacillus plantarum ca i Lactobacillus sake pot descompune acidul gluconic cu formare de acid acetic ceea ce este dezavantajos n cazul salamurilor la care se folosete glucono delta lactona ca acidifiant chimic. Lactobacillus plantarum poate reduce NaNO3 dac pH-ul mediului este mai mare de 6,0 i nu exist zaharuri fermentescibile n mediul de cultur. Lactobacillus sake i Lactobacillus curvatus produc H2O2 n prezena O2 atmosferic. Cei doi lactobacili se ntlnesc frecvent n salamurile crude fr adaos de culturi starter (sunt componeni ai microflorei spontane a compoziiei de carne).

Alte utilizri Lactobacilii intereseaz i n fermentarea mslinelor, verzii, castraveilor, gogonelelor, n producerea spirtului i drojdiei presate n vederea acidifierii plmezilor, la fermentarea unor produse fermentate din cereale (brag, cvas), la fabricarea acidului lactic prin fermentare etc.

Genul Micrococcus i Staphylococcus Microorganismele din genurile Micrococcus i Staphylococcus aparin familiei Micrococaceae care cuprinde bacterii sub form de coci. Se pot dezvolta n medii care conin 15% NaCl. Pentru industria crnii intereseaz anumite specii de micrococi i stafilococi care sunt folosite pentru:

capacitatea lor de a reduce azotaii la azotii (contribuie la formarea culorii crnii srate n prezen de azotai);

activitatea lor catalazic;

activitatea de acidificare, proteolitic i lipolitic.

Dintre speciile de micrococci intereseaz Micrococcus aurantiacus i Micrococcus varians.

Pentru industria laptelui, micrococii formeaz partea principal a populaiei nelactice din laptele crud i respectiv brnzeturile fabricate din laptele crud. Din brnza Cheddar fabricat din lapte crud a fost izolat Micrococcus freundenreichii, care a fost ulterior utilizat sub form de cultur pur n scopul accelerrii formrii aromei brnzei fabricate din lapte pasteurizat datorit activitii proteolitice i lipolitice. Tot n scopul maturrii unor brnzeturi cu past presat s-a utilizat un preparat enzimatic i anume Rulactina ce conine o metal-proteaz cu activitate strict endoproteinazic obinut din Micrococcus caseolyticus.

Din genul Staphylococcus intereseaz speciile de stafilococi coagulaz-negativi, nepatogeni cum ar fi: Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xilosus, Staphylococcus simulans.

Combinaiile de micrococi i stafilococi sunt eficace pentru activitatea azotat-reductazic i catalazic. n aceste combinaii, Staphylococcus carnosus acioneaz mai bine dect micrococii n formarea culorii, reducnd azotaii la azotii i respectiv azotiii la oxid de azot, chiar n condiii de aciditate ridicat a substratului. Aroma produselor la care este utilizat cultura starter de Staphylococcus carnosus este superioar.

Genul Streptomyces. Specii din genul Streptomyces pot altera alimentele, producnd mirosuri i gusturi dezagreabile, altele (puine la numr) sunt patogene.

Streptomyces griseus senso Htter este ns inofensiv i a fost folosit pentru capacitatea sa de a reduce azotatul la azotit, putndu-se dezvolta bine n substraturi care conin ~ 8% NaCl i care au pH = 5,8-8,5. Temperatura optim de dezvoltare este la 30(C. Este catalaz pozitiv avnd capacitate proteolitic dar nu i lipolitic. Poate fi asociat cu micrococii i/sau lactobacilii. n salamurile crude se inoculeaz la nivel de 5103 /g compoziie.

Genul Propionibacterium. Bacterile din genul Propionibacterium fac parte din familia Propionibacteriaceae. Bacteriile propionice fermenteaz carbohidraii, piruvatul/lactatul. Bacteriile propionice tip lapte sunt: Propionibacterium freundreichii (cu subspeciile freundreichii, globosum i shermani), Propionibacterium theonii, acidipropionici i jensenii.

Principalii produi de fermentaie a bacteriilor propionice sunt CO2, cantiti mari de acid propionic i acetic i cantiti mici de acid izovalerianic, formic, succinic, lactic. Toate speciile produc acid lactic din glucoz. Se dezvolt foarte bine la 30-37(C i la pH = 7,0.Producerea de propionat, acetat i CO2 Lactatul (respectiv piruvatul) este transformat n propionat prin reacia:

3CH3-CHOH-COOH

2CH3-CH2-COOH + CH3-COOH + CO2 + H2O

Propionatul, acetatul i CO2 se formeaz n proporie de 2/1/1. Diferitele tulpini de bacterii propionice se deosebesc ntre ele prin raportul acid propionic /acid acetic format, o influen n acest sens avnd i aciditatea substratului, cantitatea de lactat i adaosul de carbonat i succinat.Producerea de prolin Prolina este considerat ca principalul component care confer arom dulceag brnzeturilor de tip vaier, prezena prolinei fiind asociat cu dezvoltarea bacteriilor propionice la maturarea brnzeturilor de tip vaier. Se consider c exist trei ci pentru producerea de prolin:

proteoliza general;

hidroliza peptidelor care conin prolin;

biosinteza prolinei.

La prima cale se ia n considerare producerea de prolin prin hidroliza cazeinei.

La a doua cale se ia n considerare formarea de prolin din hidrolizatul cazeinic prin aciunea peptidazelor (Propionibacterium shermanii posed imidopeptidaz i proliniminopeptidaz intracelulare cu optim de pH la 5,5-6,0).

La a treia cale se are n vedere biosinteza prolinei din arginin i mai puin din acid glutamic, dar calea de biosintez este nesemnificativ n raport cu cea de-a doua cale menionat.

n orice caz, concentraia de prolin din interiorul celulelor este mai mic dect cea a prolinei din mediul de cultur .

Eliberarea prolinei din peptide coincide cu eliberarea enzimelor celulare n mediu. Bacteriile propionice singure hidrolizeaz ncet cazeina, dar producerea de prolin n brnzeturi este sporit prin dezvoltarea anterioar sau concomitent a bacteriilor lactice. Viteza formrii prolinei la valorile pH i concentraia de NaCl atins n brnza vaier este temporar ncetinit, dar maturarea prelungit anuleaz efectele de inhibare ale pH-ului i concentraia de NaCl. Se consider c ionii de cupru ar inhiba producerea de prolin pe unele ci, aceast inhibare parial fiind benefic, deoarece permite evoluarea altor procese de aromatizare.

Producerea de diacetil i acetoin Bacteriile propionice pot produce diacetil i acetoin, cantitile formate fiind mai mari la 21(C dect la 32-37(C. Producia de diacetil este urmat de reducerea acestuia la acetoin i 2,3 butilenglicol. Cantitatea de diacetil crete prin adaos de citrat, piruvat sau glucoz n mediu de cultur. n culturile mixte de Str. lactis i bacterii propionice, producia de diacetil se intensific ca o consecin a scderii pH-ului de ctre streptococi. Bacteriile propionice produc i alte substane care contribuie la aroma brnzeturilor: aldehid acetic, aldehid propionic, alcool etilic, alcool propilic, dimetilsulfur, acid izovalerianic.

Alte activiti metabolice Bacteriile propionice pot avea i activitate proteolitic i lipolitic.

Bacteriile propionice pot contribui ntr-o msur mai mic la activitatea proteolitic din brnza vaier prin enzimele proteinazice (~12 enzime) i peptidazice (~ 7 enzime), dar activitatea proteolitic a bacteriilor propionice este inferioar bacteriilor lactice (L. bulgaricus, L. helveticus, Str. thermophilus).

Bacteriile propionice pot contribui i la lipoliza trigliceridelor, elibernd acizi grai cu lan lung, dar aceast activitate lipolitic este nesemnificativ.

DROJDIILE, ciuperci unicelulare care se nmulesc prin nmugurire, mai rar prin sciziparitate i care formeaz ascospori (sunt i drojdii care nu formeaz spori, acestea denumindu-se drojdii/false torule i micoderme), sunt ageni tipici ai fermentaiei alcoolice.

Se prezint sub form de celule rotunde sau ovoide (Saccharomyces cerevisiae), eliptice (Saccharomyces elipsoideus), foarte alungite (Saccharomyces pasteurianus), de forma unei lmi (Saccharomyces apiculans), de forma unei sticle (Saccharomyces ludwigii) sau sub form de cilindru (Pichia).

Dintre drojdii intereseaz (n sens util) cele aparinnd familiei Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces care cuprinde drojdii alcooligene folosite n industria berii, vinului, pinii, spirtului, genul Kluyveromices care fermenteaz lactoza, genul Debaryomices care se utilizeaz n industria crnii.

Mai intereseaz drojdiile familiei Cryptococcaceae (genurile Candida, Torulopsis) care se folosesc ca ageni de fermentare i productori de biomas.

Utilizri ale drojdiilor

1. Utilizarea pentru fermentarea alcoolic Pentru fermentaia alcoolic se folosesc drojdiile adevrate care aparin genului Saccharomyces (Meyen) Ress i care se caracterizeaz prin aceea c nu formeaz micelii tipic, produc 1-4 spori, iar puterea de fermentare depete puterea de respiraie. Sunt adaptate la condiii de anaerobioz i prin urmare nu formeaz voaluri la suprafa.

Dup modul de comportare n timpul fermentaiei drojdiile pot fi:

de fermentaie superioar care se ridic n cantiti mari la suprafaa lichidului de fermentare sub forma unui strat gros de spum care se pstreaz astfel pn la sfritul fermentrii. Dup sedimentare aceste drojdii rar dau un precipitat dens. Au optim de temperatur la 2830(C i fermenteaz 1/3 din rafinoz. n categoria drojdiilor de fermentare superioar se ncadreaz cele care produc fermentarea alcoolic n cazul obinerii alcoolului etilic, pinii i unele sue pentru bere (Saccharomyces cerevisiae);

de fermentaie inferioar care se dezvolt n lichidul fermentat, nu se ridic la suprafa n spum, dar formeaz flocoane i se sedimenteaz repede. Au optim la temperatura de 812(C i fermenteaz complet rafinoza. Drojdiile de fermentare inferioar se folosesc la obinerea berii, vinului, cidrului (Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces vini, Saccharomyces uvarum).

Fermentaia alcoolic produs de drojdii este influenat de:

concentraia zahrului fermentescibil din mediu;

temperatur ;

coninutul n alcool din substrat;

felul drojdiei.

Concentraia favorabil de zahr fermentescibil este de 10-15%. Fermentaia alcoolic se desfoar lent la pH 4-4,5, n mediu alcalin sensul fermentaiei fiind schimbat.

Viteza maxim de fermentare este la 30(C, dar n practic se realizeaz la 428(C. Alcoolul pe msura acumulrii n mediu devine toxic pentru drojdii. Exist drojdii care se dezvolt la 16-18% alcool (Saccharomyces chevalieri Guilliermond, Saccharomyces oviformis), ns n cele mai multe cazuri fermentaia se oprete la 12-14% (Saccharomyces uvarum, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces vini, Saccharomyces cerevisiae).

Odat cu creterea temperaturii de fermentare se mrete toxicitatea alcoolului. Fermentaia alcoolic este un proces anaerob. Prin trecerea la aerobioz, drojdiile se nmulesc rapid i produc biomas.

Fermentarea alcoolic nu este o fermentaie pur. Se mai formeaz glicerin ( 8% din totalul zaharurilor existente n mediu), acid lactic, acid acetic, substane acetoinice (acetil metil carbinol = acetoin i diacetil), acid malic, acid succinic, acid propionic, acid citramalic, acid dimetilgliceric, alcooli superiori: izobutilic, izoamilic, amilic, care provin din aminoacizii rezultai la degradarea substanelor pectice din musturi i plmezi.

Aceti alcooli superiori se formeaz prin reacii de dezaminare i decarboxilare ale aminoacizilor leucin, izoleucin i valin.

Fermentaia alcoolic se aplic la:

obinerea alcoolului din produse amidonoase (cartofi, porumb, secar), produse care conin zaharoz (sfecl, melas), produse care conin lactoz (zer), produse care conin glucoz (hidrolizate celulozice, leii sulfitice);

obinerea berii i vinului, cidrului inclusiv cvas din pine, rom, whisky;

obinerea de buturi fermentate pe baz de cereale i leguminoase;

obinerea unor tipuri de produse lactate (chefir);

obinerea de buturi fermentate pe baz de zer.

2. Utilizarea pentru obinerea de biomas (s-a menionat anterior);

3. Utilizarea n industria crnii, n care caz se folosete drojdia Debaromyces hansenii care este tolerant la NaCl, nu reduce NaNO3 i necesit oxigen atmosferic pentru dezvoltare.

Se dezvolt bine n straturile periferice ale salamurilor neafumate sau puin afumate. Aceast drojdie are capacitatea de a consuma oxigenul din past i de a distruge peroxizii produi de bacteriile lactice. De regul, Debaromyces hansenii se folosete n combinaie cu Staphylococcus carnosus i Lactobacillus plantarum sau Staphylococcus xilosus i Lactobacillus sake. Se consider c prin folosirea drojdiei menionate produsele capt o arom cu totul deosebit.

4. Utilizarea n industria laptelui La fabricarea brnzeturilor, drojdiile se dezvolt la suprafaa brnzeturilor dar i n interiorul brnzeturilor cu past moale sau cu mucegai n past n timpul presrii, zvntrii i maturrii, avnd urmtoarele aciuni pozitive:

consum lactatul i n acest fel contribuie la neutralizarea pastei, mbuntind prin aceasta consistena i favoriznd implantarea bacteriilor;

produc factori de cretere pentru dezvoltarea bacteriilor;

produc o pelicul de acoperire la anumite tipuri de brnzeturi;

produc proteoliz i lipoliz i prin urmare contribuie la consistena i aroma brnzei respective;

produc compui volatili de arom.

Dintre drojdii, Candida hansei a fost cultivat n asociaie cu lactobacili i Str. thermophilus, favoriznd oxidarea lactatului, scderea potenialului de oxidoreducere i producerea de factori de cretere, precum i dezvoltarea culturilor starter n care este asociat. Drojdia Candida lipolitica este uneori folosit la fabricarea brnzeturilor cu mucegai n past, datorit faptului c prin lipazele coninute realizeaz o hidroliz a lipidelor din brnz, fapt ce favorizeaz utilizarea acizilor grai de ctre Penicillium n reaciile de (-oxidare. Drojdia Torulopsis candida gsit pe brnzeturi se dezvolt bine n medii acide i suport concentraii de NaCl pn la 10%. Drojdia Candida kefir i alte drojdii din granula de chefir realizeaz fermentaia alcoolic n produsul lactat acid dietetic chefir.

Kluyveromices lactis i Kluyveromices fragilis se utilizeaz la obinerea de lactaz care are multe utilizri. Kluyveromices lactis i Kluyveromices fragilis se utilizeaz la obinerea de biomas prin cultivare aerob pe zer (procedeul Bell Frana).

Kluyveromices fragilis i Candida pseudotropicalis se utilizeaz pentru obinerea alcoolului etilic din zer (procedeul Carbery Irlanda).

MUCEGAIURILE Pentru industria alimentar intereseaz clasa Phycomycetes cu urmtoarele genuri:

Genul Mucor i Rhizopus aparinnd familiei Mucoraceae. Aceste mucegaiuri care se ntlnesc pentru diferite produse vegetale i alimentare, sub form de colonii pufoase, au o aciune fermentativ net.Specii de Mucor i Rhizopus se folosesc pentru:

obinerea unor produse alimentare fermentate n Orientul ndeprtat, pe baz de cereale i leguminoase;

n producia de spirt prin zaharificarea amidonului (procedeul Amilo care folosete Amylomyces rouxi Mucor rouxianus);

n producia de enzime, n principal amilolitice i proteolitice.Din clasa Ascomycetes intereseaz ordinul Plectascales cu genurile Aspergillus i Penicillium.

Mucegaiurile din genul Aspergillus se utilizeaz n: producia de unc n SUA i Spania (mai puin);

obinerea de produse fermentate tradiionale n Orientul ndeprtat (ceva mai mult);

obinerea de enzime: amilaze, proteaze, enzime pectolitice.

Mucegaiurile din genul Penicillium se utilizeaz n:

industria brnzeturilor cu mucegai la suprafa i n past (Penicillium camemberti i Penicillium roqueforti);

industria crnii cu mucegaiuri de acoperire (Penicillium nalgiovensis i Penicillium exposus);

obinerea de enzime amilolitice, proteolitice, pectolitice.

n industria crnii, culturile de spori de mucegai se utilizeaz pentru maturarea unor unci, care se nsmneaz cu spori de Penicillium netoxicogen, n special P. nalgiovensis, P. exposum, i P. chrysogenum, respectiv Country curred ham i Jambon Serano, care se nsmneaz cu spori de Aspergillus glaucus i a unor tipuri de salamuri crude fabricate n Romnia , Italia, Ungaria, Elveia, Spania, Frana, Bulgaria; Austria, Belgia, Germania (i mai puin n SUA, Israel, Iugoslavia, Polonia).

n cazul salamurilor crude afumate/neafumate, mucegaiurile de acoperire contribuie la:

reglarea eliminrii apei din produs i a schimbului de gaze;

formarea aromei;

mbuntirea aspectului comercial al produsului.

Aroma este mai evident la salamurile cu diametru mai mic. Produsele pot fi livrate cu mucegaiul de acoperire intact sau dup periere. Culoarea miceliului rmas este dependent de varietatea mucegaiului folosit: alb-ivorie (preferabil n Italia); gri (preferabil n Ungaria); alb-mat (preferabil n Romnia).

Prin utilizarea culturilor pure de mucegai se suprim apariia la suprafaa salamurilor a mucegaiurilor toxicogene, n special a celor productoare de aflatoxine precum i a mucegaiurilor de ptare care produc spoturi de culoare verde sau neagr.

Penicillium nalgiovensis Se utilizeaz spori de Penicillium nalgiovensis pentru salamurile crude cu miceliu alb la suprafa. Sporii, n suspensie, se pulverizeaz la suprafaa produselor. Dup 3-4 zile de la nsmnare se formeaz micelii, iar dup 5-6 zile de la nsmnare apar corpii de fructificaie purttori de conidii. Temperatura optim de dezvoltare a mucegaiului este de 22-23(C.

Penicillium nalgiovensis folosete ca substrat nutritiv glucidele dar are i activitate proteolitic i lipolitic. Nu are activitate celulazic i nu produce micotoxine.

Penicillium expansum se dezvolt bine la 22(C i umiditatea relativ a aerului este de ~ 82% pentru sporulare i ~ 88% pentru germinare. Dezvoltarea bun este la ( = 92-95%. Sporii pulverizai la suprafaa batoanelor formeaz un miceliu pufos n circa 8 zile de la nsmnare, maturizarea deplin avnd loc dup 30 zile de la nsmnare. Penicillum expansum nu produce micotoxine dac substratul conine proteine cu sulf (cazul pastei salamurilor crude).n industria laptelui culturile de spori de mucegai se utilizeaz, aa cum deja s-a menionat, la fabricarea brnzeturilor cu mucegai n past ct i cu mucegai la suprafa (brnzeturi cu past moale).

Pentru brnzeturile cu mucegai n past (Brnza Roquefort, Gorgonzola, Stilton, Gammelost) se utilizeaz spori de Penicillium roquefort. Pentru brnzeturile de tip Camembert se utilizeaz sporii de la dou specii de Penicillium: P. camemberti i P. caseicolum.

Mucegaiurile dezvoltate n/pe aceste brnzeturi au rol fundamental n:

formarea aromei i gustului;

formarea consistenei;

definitivarea aspectului, procesele care intervin n formarea aromei i consistenei fiind proteoliza, lipoliza i (-oxidarea acizilor grai.

Suspensiile de spori se pot aduga/folosi:

n laptele destinat brnzeturilor sau amestecarea cu coagulul obinut n cazul brnzei cu mucegai n past;

n laptele destinat fabricrii brnzei, sau pulverizare la suprafaa brnzei formate n cazul brnzeturilor cu mucegai la suprafa. Mucegaiurile mai importante pentru industria laptelui sunt:

Penicillium roqueforti Thom se dezvolt bine la 20-25(C i pH 4,5-7,5. Tolereaz concentraii de 5-8% NaCl. Are activitate proteolitic, lipolitic i de (-oxidare a acizilor grai. Activitatea mucegaiului este stnjenit de prezena acidului propionic n brnz, la concentraii mari de 30% CO2 n aerul depozitului. Pentru intensificarea formrii aromei se recomand ca lipidele din lapte s fie n prealabil lipolizate cu esteraz pregastric, astfel ca pe msur ce mucegaiul sporuleaz, acizii grai liberi s fie (-oxidai pn la metilcetone. P. roqueforti se dezvolt n canalele i golurile practicate n pasta brnzei, sporii formai avnd culoare verde nchis care confer brnzei un aspect marmorat.

Penicillium camemberti i Penicillium caseicolum Sporii acestor mucegaiuri se utilizeaz n producia brnzeturilor de tip Camembert incluznd Camembert, Brie, Neufchatel, Coulommier, Garr de lEst, Olivet.

Penicillium camemberti Thom (Penicillium album) se utilizeaz la brnzeturile tip Camembert cu past mai untoas, mai parfumat, de culoare gri alburie.

Penicillium caseicolum Bainer (Penicillium candidum) se utilizeaz la brnzeturile de tip Camembert cu pasta mai compact, o arom mai delicat, mai discret i de culoare alb imaculat.

La nsmnare prin pulverizare de spori la suprafa a brnzeturilor cu umiditate ~ 55-60% se formeaz miceliile de mucegai care consum din aciditatea pastei, consecina fiind creterea pH-ului ncepnd cu a 12 a zi, iar dup 27 de zile pH-ul rmne constant.

Mucegaiurile din genul Penicillium au activitate endoproteinazic fa de (- i ( cazein, dar au i activitate exopeptidazic important, fiind demonstrat faptul c att P. roqueforti ct i P. camemberti sintetizeaz 2 endopeptidaze (o metal proteinaz i o aspartil proteinaz) precum i dou exopeptidaze cu aciune carboxi- i aminopeptidazic, activitatea celor dou grupe de enzime fiind relativ echivalent n stratul de suprafa al brnzeturilor.

Unele specii de Penicillium camemberti pot produce o micotoxin (acidul ciclopiazonic, dar activitatea toxicogen a mucegaiului este aproape nul la temperatura tehnologic de maturare a brnzei (14-16(C).

La brnza Camembert se pot utiliza i spori de Geotricum candidum care se introduc n lapte. Geotricum reduce pericolul formrii peptidelor amare, inhib dezvoltarea lui Penicillium, consum acidul lactic i deci contribuie la neutralizarea pastei, avnd i aciune protolitic i lipolitic. Brnza Camembert obinut din lapte pasteurizat cu adaos de Geotricum candidum are o arom asemntoare cu cea a brnzei Camembert tradiionale, adic fabricat din lapte crud. 1.3.2. Culturi starterCulturile starter sunt definite ca acele culturi care se obin plecnd de la o cultur pur stoc i care prin trecere prin culturi intermediare (pasaje) devin apte de a fi folosite pentru producia unor alimente fermentate. Culturile starter pot fi formate numai dintr-un singur microorganism sau din mai multe microorganisme.

Culturile starter de microorganisme sunt utilizate n vederea:

dirijrii unor procese biochimice prin care se asigur produsului un anumit grad de inocuitate (inclusiv capacitatea de conservare);

asigurrii unor nsuiri senzoriale;

asigurrii, n unele cazuri, i a unor nsuiri nutritive.

La folosirea culturilor starter n industria alimentar trebuie s se aib n vedere urmtoarele:

s conin un anumit numr de microorganisme viabile (g/ml) i un numr ct mai redus de germeni nedorii;

produii metabolici, primari i secundari, s nu prezinte pericol pentru sntatea oamenilor;

s nu conin i s nu produc antibiotice care se utilizeaz n scop terapeutic la oameni;

s aib o anumit (anumite) activiti specifice: de producere a acidului lactic, de reducere a azotului etc;

microorganismele existente n cultur s fie declarate cu numele tiinific ntreg;

speciile (suele) noi care se introduc n producie, trebuie s fie nregistrate la MS i s fie depozitate n colecii cu nomenclator; nainte de utilizare n producie s fie testate din punct de vedere al inocuitii n conformitate cu legislaia n vigoare;

suele declarate a fi sigure trebuie controlate la intervale regulate de ctre institute specializate, n ceea ce privete puritatea lor;

speciile, care pe baza noilor cunotine tiinifice au fost recunoscute ca avnd potenial patogen sau toxicogen, trebuie s fie supuse unui control riguros pentru fiecare su, realizndu-se studii de toxicitate pe termen lung, de carcinogenitate i mutagenitate.

Toate cele menionate trebuie s se constituie ca o obligativitate absolut deoarece:

culturile starter se pot consuma n stare vie, odat cu produsul alimentar, aa cum este cazul produselor lactate acide, brnzeturilor, salamurilor i crnailor cruzi, a unor sortimente de bere, a unor produse vegetale: varz murat, castravei murai, gogonele murate, msline verzi;

culturile starter se pot consuma dup distrugerea lor, rmnnd n produsul alimentar att ele ct i produii lor de metabolism, aa cum este cazul brnzei proaspete de vaci i a iaurtului care au fost pasteurizate, brnzeturilor topite, produselor de panificaie etc.;

produii de metabolism ai culturilor starter se consum odat cu produsele alimentare, ns microorganismele sunt eliminate n cea mai mare parte, aa cum este cazul berii, vinului, alcoolului, oetului, acidului citric, acidului lactic etc.

Culturi starter de bacterii lacticeCulturile starter de bacterii lactice sunt folosite n diferite domenii: industria laptelui, crnii, produselor vegetale murate, industria vinului, industria panificaiei, industria sucurilor de fructe i legume fermentate etc.

Folosirea culturilor starter de bacterii lactice asigur produselor alimentare n care se introduc un anumit grad de inocuitate. Aceast asigurare este realizat deoarece bacteriile lactice produc:

acizi organici, n principal acid lactic, dar i acid acetic, alcool, CO2;

substane bacteriocine eliberate n mediul de cultur;

peroxizi organici (H2O2).

n plus, bacteriile lactice intr n competiie cu microorganismele patogene i cele de alterare n ceea ce privete consumul de substane nutritive, iar datorit i acidifierii mediului, consecin a acumulrii acizilor organici, bacteriile patogene i de alterare sunt inhibate n dezvoltarea lor. Dintre bacteriile patogene sunt inhibate stafilococii, salmonelele, Listeria monocytogenes, Cl. botulinum etc.

Datorit aciditii se inhib i dezvoltarea microflorei cu activitate proteolitic i decarboxilazic, deci se formeaz cantiti mai reduse de amine biogene, iar n cazul crnurilor srate n prezen de azotii, datorit aciditii se favorizeaz descompunerea mai complet a azotiilor, deci scade producia de nitrozamine, mai ales la produsele care se supun coacerii i prjirii.

Culturile starter de bacterii lactice folosite ca atare sau sub form de produse lactate dietetice acide sunt benefice pentru sntatea oamenilor deoarece:

aciditatea lactic favorizeaz aciunea pepsinei ce produce hidroliza proteinelor, respectiv coagularea cazeinei laptelui care este n continuare degradat de tripsina pancreatic;

aciditatea mediului intestinal blocheaz dezvoltarea microflorei cu activitate patogen i favorizeaz implantarea bifidobacteriilor cu consecine pozitive pentru organismul uman (vezi capitolul probiotice).

n legtur cu bacteriocinele, n continuare se fac urmtoarele precizri:

bacteriocinele sunt secretate de bacteriile Gram negative;

bacteriocinele sunt proteine i activitatea lor dispare prin hidroliza lor de ctre proteaze;

bacteriocinele au aciune bactericid, dar nizina este i bacteriostatic. Multe bacteriocine sunt bacteriostatice la aplicarea lor n produsele alimentare;

bacteriocinele sunt excretate n mediu n cea mai mare parte; o mic parte rmn n celulele bacteriene;

bacteriocinele difer de antibiotice prin natura speciilor i suelor productoare, modalitile de producere i natura lor chimic;

bacteriocinele secretate de bacteriile lactice din culturile starter sau de protecie au un spectru de aciune relativ limitat n raport cu mai multe specii sau mai multe sue ale aceleiai specii. bacteriocinele sunt sensibile la aciunea enzimelor proteolitice metabolice, ceea ce nseamn c ingerarea de produse ce conin bacteriocine nu modific microbiota tractului intestinal i nu va conduce la riscuri n ceea ce privete folosirea de antibiotice comune;

bacteriocinele sunt stabile la cldur, deci rezist n laptele pasteurizat la 63(C/30s minimum sau la 72(C/15 s; rezistena lor termic se datoreaz structurii moleculare simple (excepie face helveticina J care are o structur proteic mai elaborat);

bacteriocinele sunt stabile la pH neutru sau acid, ceea ce nseamn c sunt adaptate la condiiile de mediu ale bacteriilor productoare;

eficacitatea bacteriocinelor n produsele fermentate este limitat de condiiile de conducere a fermentaiei (temperatur, pH, aw)

Culturi starter utilizate in industria lapteluiLa obinerea culturilor starter trebuie s avem n vedere n mod deosebit urmtoarele:

mediul de cultur (laptele);

tratamentul termic aplicat laptelui;

condiiile de incubare;

interaciunile dintre speciile/tulpinile din cultura starter;

eventualele infectri cu bacteriofagi;

instabilitatea culturilor starter de bacterii lactice.De la nceput, facem precizarea c prin cultur starter nelegem culturile obinute din cultura pur stoc (inoculum) prin diferite pasaje. Culturile starter sunt folosite la fabricarea unor produse lactate acide, smntn, unt, brnzeturi.

Culturile starter de bacterii lactice utilizate n industria laptelui pot fi clasificate n mezofile i termofile.

Culturile starter mezofile, care la rndul lor, pot fi clasificate n:

a) Culturi starter singulare (single strain starter) care conin numai Str. lactis subsp. lactis i respectiv Str. lactis subsp. cremoris (Lactococcus lactis i Lactococcus cremoris) ambii homofermentaticvi care produc acid lactic (L+) n proporie de 0,8%. Folosirea acestor culturi starter singulare a aprut ca o necesitate de a se evita formarea ochiurilor de fermentare la unele brnzeturi, ochiuri formate n urma producerii de CO2 de ctre bacteriile aromatizante.

Culturile starter singulare mezofile prezint urmtoarele avantaje:

se poate utiliza continuu aceeai cultur cu activitate relativ constant i previzibil;

nu este necesar alternarea culturilor, eliminndu-se riscul deprecierii acestora de ctre fagi,

se folosesc cantiti mai mici de inoculum pentru obinerea de cultur primar i secundar;

influenele compoziionale sezoniere ale laptelui sunt mai reduse;

se creeaz condiii de realizare a unei producii standardizate de produse lactate de calitate superioar;

cultura poate fi controlat i supravegheat din punct de vedere al caracteristicilor sale (sensibilitate la fagi, producerea de acid lactic, compatibilitatea ei, aglutinarea i eventual lisogenia).

Culturile starter singulare mezofile prezint ns urmtoarele dezavantaje:

pot fi depreciate de tulpinile productoare de bacteriocine;

pot fi depreciate de fagi, deci sunt predispuse la liz fagic;

pot suferi pierderi de plasmide i deci pot pierde una sau mai multe din funciile lor.

b) Culturi starter multiple mezofile sunt acele culturi care se bazeaz pe folosirea a 5-6 tulpini selecionate, nenrudite pe plan fagic i cultivate separat pn la stadiul de cultur primar sau chiar pn la stadiul de cultur starter de producie cnd se amestec ntre ele. n aceste condiii, tulpinile nu se dezvolt mpreun dect cel mult timp de 10 generaii, ceea ce face ca nici o tulpin s nu devin dominant. Asemenea culturi pot fi folosite mai multe luni n ir fr a-i pierde capacitatea de acidifiere.

c) Culturi starter mezofile mixte Aceste culturi sunt formate, de regul, din dou tipuri de bacterii lactice:

bacterii lactice acidifiante: Str. lactis sau Str. cremoris;

bacterii lactice productoare de arom: Str. diacetilactis (Lactococcus lactis var. diacetilactis) sau specii de leuconostoci.

Dup tipul bacteriilor aromatizante culturile starter mixte mezofile pot fi clasificate n urmtoarele grupe:

culturi starter mixte tip L care conin numai specii din genul Leuconostoc: Leuconostoc cremoris (citrovorum), Leuconostoc dextranicum i/sau Leuconostoc lactis care sunt toi heterofermentativi i produc acid lactic D(-);

culturi starter mixte de tip D care conin Str. lactis biov. diacetilactis ca singur specie productoare de arom;

culturi starter mixte tip LD care conin att specii de leuconostoci ct i Str. lactis subsp. diacetilactis ca productori de arom.

La folosirea culturilor starter mixte trebuie s avem n vedere c:

streptococii acidifiani mezofili homofermentativi produc acid lactic din lactoz;

leuconostocii, cei heterofermentativi, i Str. lactis subsp. diacetilactis (homofermentativ) produc diacetil i acetoin din citrat, dar produc i acid lactic, acetic prin fermentarea lactozei i glucozei;

Culturi starter termofile

Culturile starter termofile pot fi:

acidifiante: Lactobacillus acidophilus;

acidifiante/aromatizante care la rndul lor pot fi constituite din unul sau mai multe specii de lactobacili i dintr-o specie de streptococi. n aceast direcie amintim:

cultura starter termofil pentru iaurt: Lactobacillus bulgaricus i Str. therrmophilus;

cultura starter termofil pentru brnzeturi: Lactobacillus bulgaricus + Lactobacillus lactis + Lactobacillus helveticus + Str. thermophilus. Aceast cultur starter se folosete la fabricarea brnzeturilor cu past tare i semitare, deci la care se practic nclzirea a doua a bobului de coagul.

Utilizarea culturilor starter termofile este benefic deoarece:

produc acid lactic deci scad pH-ul laptelui i determin coagularea acestuia (cazul iaurtului); la brnzeturi acidifierea favorizeaz eliminarea zerului din coagul;

au activitate proteolitic i prin urmare contribuie la ameliorarea proprietilor reologice i la aroma produselor fermentate; ca urmare a activitii proteolitice rezult i aminoacizi din proteine care stimuleaz dezvoltarea celorlalte bacterii din culturile starter termofile;

produc i compui de arom, dar n principal aldehid acetic, aceton, precum i urme de acetoin;

produc i substane cu caracter filant care influeneaz vscozitatea produsului (Str. thermophilus n cultura pentru iaurt);

produc o serie de bacteriocine (Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei etc.);

produc H2O2 (Lactobacillus bulgaricus).

Avnd n vedere cantitile mari de iaurt ce se fabric pe plan mondial, este necesar s cunoatem fac