1

Prefa

n plan tiinific, progresele din ultimele decenii n descoperirea i utilizarea unor metode moderne de investigare n domeniul biologiei (microscopia electronic, utilizarea anticorpilor monoclonali, difracia cu raze X, tehnici de secveniere i amplificare a ADN, utilizarea culturilor de celule, imunoelectroforeze, etc.) a determinat diversificarea cunotinelor de biologie molecular i apariia unor noi ramuri noi: genomica, proteomica, transcriptomica, bioinformatica. Astfel, biologia din tiin fundamental se divide, dobndind noi discipline. Scopul prezentei lucrri intitulat Biologie celular i molecular este acela ca bazndu-se pe aspectele fundamentale ale biologiei s integreze, armonios, noile descoperiri tiinifice din diversele domenii, astfel nct nelegerea diverselor procese biologice care se desfoar n structurile celulare i subcelulare s fie pe de o parte facil, iar pe de alta s permit corelarea interrelaiilor: structur celular-subcelular, funcie, interaciune cu mediul. Lucrarea prezent se plaseaz la grania manual universitar-tratat deoarece se adreseaz att studenilor ct i medicilor, biologilor i chimitilor preocupai de cunoaterea i nelegerea unor aspecte moderne precum: structura molecular i funciile componentelor celulare, aspectele semnalizrii i diferenierii celulare, ciclul celular, senescena i apoptoza celular, sau proliferarea tumoral. Editarea unei astfel de cri care prezint noiuni de fiziologie, dar i de patologie celular, poate fi dublu justificat: vine n sprijinul ideii c viitorul va aparine unui nou concept-medicina molecular, iar prin coninutul su este furnizor de reale competene, deoarece prezint unele date recente referitoare la importana diagnosticului molecular i implicarea biologiei moleculare n etio-patogenia i terapia unor afeciuni. Manualul-tratat, dei cu caracterul cercetrilor fundamentale, dobndete i un specific de multidisciplinaritate i intersectorialitate, secant altor discipline. Aceast ultim particularitate este susinut inclusiv de materialul ilustrativ inclus, bogat reprezentat, dei poate prea dens, dar de real folos n realizarea obiectivului propus: nelegerea biologiei celulare i moleculare ca tiin fundamental, n continu dinamic, cu profunde i multiple implicaii n domeniul altor discipline medicale precum genetica, fiziologia, fiziopatologia, farmacologia, medicina intern etc., de la care utilizeaz achiziii tiinifice, dar pe care le ajut. Sursele bibliografice utilizate sunt atent selecionate, incluznd att date tiinifice considerate deja clasice, ct i achiziiile de dat recent, ceea ce situeaz acest curs n zona de noutate n domeniu. Importana editorial a unei astfel de apariii este pe deplin atins, ntruct ca manual universitar, prin parcurgerea acestor pagini, deschide pentru studeni porile unui univers pasionant, denumit ,,celul, nc plin de necunoscute ce se ateapt descoperite i nelese. Pentru practicieni, tratatul reamintete datele fundamentale de biologie celular i permite fundamentarea tiinific a unora dintre activitiile medicale, fr a omite necunoscutele de moment din domeniu.

Prof.dr. Elena Lucia Moldoveanu

2

Cuprins

Capitolul1. Noiuni introductive.8 Capitolul 2. Constituienii chimici ai celulei..11

Capitolul 3. Membrana celular. Structura molecular i funciile membranelor celulare.15

3.1.Structura molecular a memmbranelor biologice......... 15

3.1.1. Dublul strat lipidic al membranelor biologice... 15

3.1.2. Lipidele majore ale membranelor celulare. 16

3.1.2.1. Fosfolipidele membranare.. 16

3.1.2.2. Colesterolul..18

3.1.2.3. Glicolipidele membranare....18

3.1.3. Proteinele membranelor celulare..20

3.1.3.1.Proteinele integrale.........20

3.1.4. Carbohidraii membranelor celulare.22

3.1.5. Mobilitatea proteinelor i lipidelor..................................................... 22

3.1.6. Asimetria distribuiei componentelor membranare.........22

3.2. Funcia de transport a membranelor celulare........23

3.2.1. Transportul pasiv..................................................................................23 3.2.1.1. Difuzia simpl...23

3.2.1.2. Difuzia facilitat a moleculelor i ionilor.......... ...24

3.2.2. Transportul activ29

3.2.2.1. Transportul activ propriu-zis29

3.2.2.2. Sistemele de cotransport32 3.2.3. Transportul macromoleculelor i particulelor ...35

3

3.3.Funcia de adeziune celular...42

3.3.1. Jonciunile de ancorare. 42

3.3.1.1. Jonciunile de adeziune intercelular..43

3.3.1.2. Jonciunile de adeziune celul-matrice extracelular.44

3.3.1.3.Dezmosomii.45

3.3.1.4. Hemidesmozomii45

3.3.2. Jonciunile de ocluzie.47

3.3.3. Jonciunile de comunicare.48

3.3.4. Adeziunea mediat de selectine... 49

3.3.5.Matricea extracelular....52

3.3.5.1. Componentele matricii extracelulare...52

3.3.5.1.1. Glicozaminoglicanii 52

3.3.5.1.2. Proteinele fibrilare 53

Capitolul 4. Organizarea structural a citoplasmei.

Hialoplasma i citoscheletul..56

4.1. Hialoplasma, matricea citoplasmatic,

substana fundamental sau citosolul56

4.2.Microtubulii.. 57

4.2.1. Funciile microtubulilor .. 59

4.2.1.1. Micarea organitelor i transportul axonal 59

4.2.1.2. Micarea flagelar (ciliar).60

4.2.1.3. Fusul mitotic din diviziunea celular 61

4.3 Microfilamentele... 63

4.3.1. Mecanismul molecular al contraciei musculare66

4.3.2. Particulariti de reglare a contraciei n

celulele musculare netede68

4.3.3. Actina i miozina n celulele nemusculare... 68

4

4.4. Filamentele intermediare.. 71

4.4.1. Tipuri de filament intermediare

i semnificaia lor funcional.71

Capitolul 5. Nucleul celular.73

5.1. nveliul nuclear...73

5.2. Nucleolul......75

5.3. Nucleoplasma...76

5.4. Cromatina nuclear........77

5.4.1. Structura cromatinei... 77

5.4.2. Replicarea ADN...79

5.4.3. Genele..82

5.4.4. Sinteza ARN83

5.4.5. Procesarea ARN.89

Capitolul 6. Ribosomii. Translaia proteinelor. ..92

6.1. Caracteristicile ribosomilor..92

6.2. Funcia ribosomilor...93

6.2.1. Iniierea sintezei proteice.. 93

6.2.2. Elongarea lanului polipeptidic. 94

6.2.3. Terminarea sintezei lanului polipeptidic.. 95

6.2.4. Reglarea translaiei.96

Capitolul 7. Reticulul endoplasmic. 97

7.1. Structura reticulului endoplasmic.. .97

7.2. Reticulul endoplasmic rugos... 97

7.2.1. Funciile RER..100

7.2.2. Sortarea proteinelor specifice n RER..102

7.3. Reticulul endoplasmic neted.102

7.4. Reticulul sarcoplasmic..104

5

Capitolul 8. Aparatul Golgi 106

8.1. Caracteristici generale..106

8.2.Funciile aparatului Golgi.106

8.2.1. Rolul aparatului Golgi n transportul vesicular al proteinelor...106

8.2.2. Modificrile macromoleculelor la nivelul aparatului Golgi.......108 8.2.2.1. Glicozilarea la azot a proteinelor108 8.2.2.2. Glicozilarea la oxigen i asamblarea proteoglicanilor. ..109

8.2.2.3. Sulfatarea proteoglicanilor, glicoproteinelor

i glicolipidelor.110

8.2.2.4. Modificri proteolitice..110

8.2.2.5. Agregarea proteinelor n TGN..110

8.2.2.6. Sinteza glicolipidelor i sfingomielinei.111

Capitolul 9. Lizosomii. .112

9.1. Structura lizosomilor..112 9.2. Biogeneza lizosomilor.113

Capitolul 10. Peroxisomii..115

10.1. Structura i caracteristicile generale ale peroxisomilor...115

10.2. Funciile peroxisomilor115

10.3. Importul proteinelor n peroxisomi. .118

10.3.1. Mecanismul importului peroxisomal... 119

10.4. Biogeneza peroxisomilor 120

10.5. Proliferarea peroxisomal.... ...120

10.5.1. Efectele biologice ale PPAR n celulele umane...... 122

Capitolul 11. Mitocondria. ....124

11.1. Caracteristici generale i structur. . 124

11.2. Funciile mitocondriilor.125

11.2.1. Sinteza ATP.125

11.2.1.1. Transportorii de electroni....127

6

11.2.1.2. Structura lanului transportor de electroni..128

11.2.2. Producerea de cldur... 130

11.2.3. Funcia de depozitare a calciului... 130

11.3. Replicarea mitocondriilor. 130

11.4. Relaia cu procesul de mbtrnire... 130

Capitolul 12. Semnalizarea celular.. 131

12.1. Tipuri de semnalizare celular..... 131

12.2. Semnalizarea prin receptori de suprafa celular 131

12.2.1. Receptori cuplai cu proteine G... 131

12.2.1.1. Receptori cuplai cu proteine G

care au ca efector adenililciclaza........ 132

12.2.1.2. Receptori cuplai cu proteine G

care regleaz canale ionice. 134

12.2.1.3. Receptori cuplai cu proteina G

care au ca efector fosfolipaza C 135

12.2.2. Receptori cu activitate enzimatic asociat

sau intrinsec. 136

12.2.3. Ci care implic clivare proteolitic indus de semnal.. 140

Capitolul 13. Ciclul celular... 143

13.1. Etapele ciclului celular. 143

13.2. Reglarea ciclului celular... 144

13.3. Moleculele specifice implicate n reglarea ciclului celular...... 145

13.4. Puncte de control n reglarea ciclului celular... 146

Capitolul 14. Apoptoza. 147

14.1. Caracteristici i cauze.. 147

14.2. Importana apoptozei... 147

14.3. Mecanismul apoptozei. 147

7

14.3.1. Reglarea apoptozei prin mecanism mitochondrial.. 148

14.3.2. Transducia direct a semnalelor proapoptotice

( mecanisme directe de iniiere a apoptozei)... 148

14.4. Ci apoptotice defective.. 149

Capitolul 15. Proliferarea i diferenierea celular 151

15.1. Celulele-stem.151

15.2. Diferenierea celular... 152

15.3. Mecanismele diferenierii celulare... 153

15.3.1. Metilarea ADN 154

15.3.2. Modificrile chimice ale histonelor 155

15.3.3. Interferena ARN 157

15.4. Ci particulare de reglare a diferenierii celulare....... 157

15.5. Proliferarea tumoral160

List de abrevieri.. 163

Bibliografie165

8

1. Introducere

Biologia celular i molecular este disciplina care studiaz structurile celulare i proprietile fiziologice ale celulelor, interaciunea cu mediul, ciclul celular, diviziunea i moartea celular, la nivel microscopic i molecular. Celula este cea mai mic unitate structural i funcional a organismelor vii. Unele organisme sunt unicelulare, altele sunt multicelulare cum este organismul uman care cuprinde 100 trilioane sau 1014 celule. Teoria celular elaborat n 1839 de Matthias Jakob Schleiden i Theodor Schwann se bazeaz pe conceptul c toate organismele sunt formate din una sau mai multe celule vii; n 1855, Rudolf Virchow completeaz teoria celular cu conceptul conform cruia toate celulele organismelor vii provin din celule preexistente: "Omnis cellula e celula". Deci, nu exist creaie spontan a celulelor din materie nevie. Aceast idee a fost demonstrat experimental de Louis Pasteur n 1862. Teoria celular postuleaz c funciile vitale ale unui organism au sediul n interiorul celulelor i c toate celulele conin informaia ereditar necesar pentru a controla funciile celulare i pentru transmiterea acestor funcii n urmtoarea generaie de celule. n 1880 August Weissman impune ideea c toate celulele vii existente provin dintr-o celul ancestral, un strmo comun. Cuvntul ,,celul" provine din latinescul ,,cellulae", care este diminutivul cuvntului ,,cella", care semnific ,,cmru". Termenul descriptiv al celei mai mici structuri biologice viabile a fost atribuit de medicul englez Robert Hooke n cartea sa ,,Micrographia" publicat n 1665, ns n mod eronat, el a considerat celule cmruele delimitate de pereii celulozici observai la microscop ntr-o seciune fin prin esut vegetal. "These pores or cells, were not very deep, but consisted of a great many little boxes, separated out of one continued long pore, by certain diaphragms." Biologia celular i molecular este tiina care s-a desprins din citologia clasic, atunci cnd instrumentele i tehnicile achiziionate au permis acumularea de date experimentale privind arhitectura molecular i fiziologia celulei. Aceste acumulri de date noi continu intens, fiind susinute de metode de cercetare bazate pe o tehnologie a crei dezvoltare este uimitoare. Ca tiin, biologia celular i molecular pornete de la ideea c nu poi nelege ntregul nainte de a-i descifra prile, de la ideea c minunile i misterul vieii conduc la curiozitatea dar pn la urm i la necesitatea de a descifra mecanismele de funcionare ale viului. Ce este viaa? Progresele actuale din biologia molecular ne dau speran c ne vom apropia de unele rspunsuri i ne vor oferi soluii mcar pentru mbuntirea vieii. Diagnosticul molecular este deja de actualitate, mecanismele moleculare ale multor maladii sunt descifrate, genomica i proteomica sunt domenii n plin expansiune. Dei universul nostru pare a fi format pe principiul ,,lumi n interiorul altor lumi, spiritul uman are caliti care ne dau sperana c le vom cunoate i nelege. Prin parcurgerea celor scrise n paginile de mai jos, sper ca studenii i nu numai ei s gseasc informaii care s i ajute s treac de prima poart a cunoaterii n domeniul biologiei celulei i moleculare i s doreasc s deschid urmtoarele pori. Exist dou clase fundamentale de celule: celulele procariote i celulele eucariote.

9

Caracteristicile celulelor sunt prezentate n tabelul de mai jos:

Procariote Eucariote

Organisme specifice bacterii, archaea protiste, fungi, plante, animale

Dimensiuni specifice

~ 110 m ~ 10100 m

Tipul de nucleu Regiunea nucleoidului; fr nucleu tipic

Nucleu tipic cu dubl membran

DNA Mai ales circular Molecule liniare (cromozomi) cu proteine histonice

Sinteza ARN/Proteinelor

Cuplate n citoplasm Sinteza ARN n nucleu, sinteza proteinelor n citoplasm

Ribosomii 50S+30S 60S+40S

Structura citoplasmei

Structurat, cu citoschelet, dar mai puin complex

nalt structurat prin endomembrane i citoschelet mai complex

Micarea celular flageli formai din flagelin

Flageli i cili care conin microtubuli; lamelipodii i filopodii care conin actin

Mitocondrii fr Una pn la mai multe mii

Cloroplaste fr n alge i plante

Organizarea Unicelulare O singur celul, colonii, organisme multicelulare evoluate cu celule specializate

Diviziunea celular Fisiune binar Mitoz; Meioz

Tabelul 1. Caracteristicile celulelor procariote i eucariote Celulele eucariote au evoluat dintr-o comunitate simbiotic de celule procariote. Este aproape sigur c organite purttoare de ADN propriu cum este mitocondria sau cloroplastul sunt ceea ce a mai rmas dintr-o proteobacterie sau cianobacterie strveche simbiont capabil de respiraie aerob, n timp ce restul componentelor celulelor eucariote actuale par s derive dintr-o celul procariot ancestral de tip archaea, conform teoriei endosimbiozei. Cartea este structurat n capitole care prezint caracteristicile celulelor eucariote, cu referire predominant la celula uman. Aceste celule n interfaz prezint nucleu cu nucleoli, citoplasm alctuit din ecto- i endoplasm, plasmalema sau membrana celular. Apariia microscopiei electronice a permis studierea plasmalemei, jonciunilor intercelulare, a prelungirilor: microvili, cili, flageli, caracterizarea membranei duble a nucleului, cu pori i foia extern care se continu cu membrana RER, unde are loc biosinteza, modificarea, mpachetarea i exportul unor proteine de secreie sau membranare, caracterizarea nucleolilor

10

n care are loc biogeneza ribozomilor. Au fost studiate organitele celulare: lizosomii se desprind din aparatul Golgi i conin hidrolaze cu rol n digestia celular, peroxisomii n detoxifierea celular, aparatul Golgi n procesarea lipidelor i proteinelor sintetizate de celul, mitocondriile genereaz energia necesar celulei, capabile de autoreplicare, centrozomul cu doi centrioli, este centrul de organizare microtubular, vacuolele care sunt organite de depozitare. Cartea parcurge n mod foarte selectiv toate aceste aspecte, inevitabil pentru un domeniu att de vast i n continu expansiune cum este biologia celular i molecular.

11

2. Constituienii chimici ai celulei

Celula este compus dintr-un set restrns de elemente chimice, dintre care patru: C, N, O, H alctuiesc structuri care reprezint aproximativ 99% din greutatea unei celule vii. Cea mai abundent substan chimic din celulele vii este apa, care reprezint 70% din greutatea acestora i este mediul n care se desfoar majoritatea reaciilor intracelulare, n dependen de proprietile speciale ale moleculelor de ap: caracterul polar, capacitatea de a forma legturi de hidrogen i tensiunea superficial mare. n celule predomin elementele chimice uoare, solubile n ap. Atomul de carbon predomin n structura chimic a celulelor, are o mas atomic mic (12), dar formeaz patru legturi covalente puternice cu ali atomi, genernd un numr infinit de mare de molecule simple pn la extrem de complexe (pot conine pn la 30 de atomi de C) . N, O, H au de asemenea mas atomic mic (14, 16, 1) i sunt capabili de a forma legturi covalente puternice. Viaa este posibil datorit combinaiei dintre stabilitatea legturilor covalente n condiiile fiziologice i capacitatea catalizatorilor biologici (denumii enzime) de a rupe i reface aceste legturi covalente n mod controlat, specific n anumite molecule. Setul de molecule cu funcia biologic specific fiecreia dintre ele, odat stabilit n celula ancestral, s-a conservat, cu variaii, de-a lungul bilioanelor de ani de evoluie celular. Cteva combinaii simple de atomi cum este gruparea metil, hidroxil, carboxil i amino sunt larg rspndite n moleculele biologice. Aceste grupri au proprieti fizice i chimice care determin caracteristicile moleculelor din care fac parte, determinante pentru funciile moleculare din celul. Unele dintre aceste molecule sunt molecule mici, libere n soluie, n mediul intracelular, unde o parte din ele formeaz o categorie de intermediari din care are loc sinteza macromoleculelor, altele sunt intermediari eseniali n cile metabolice sau compui de nmagazinare a energiei. Aceste molecule organice mici reprezint o zecime din totalul moleculelor organice din celul, dar sunt foarte multe, de ordinul a o mie de tipuri diferite, ns fiind sintetizate din i degradate n compui comuni, avnd caracteristici chimice comune, pot fi clasificate n patru clase de molecule organice mici: monozaharide, acizi grai, aminoacizi i nucleotide. Cele mai simple glucide, monozaharidele, sunt compui cu formula (CH2O)n, unde n=3-7. Glucoza, de exemplu are formula C6H12O6. Monozaharidele exist sub form liniar, dar n soluii monozaharidele cu 5 sau 6 atomi de carbon pot forma un inel heterociclic tip furan-pentaciclu sau piran-hexaciclu. n forma liniar, poate aprea interaciunea gruprii aldehidice sau cetonice cu o grupare hidroxil a aceleiai molecule, pentru a forma heterociclul. Carbonul gruprii aldehidice sau cetonice poate lega un carbon ce poart o grupare hidroxil a altui monozaharid, formnd un dizaharid. Adiia mai multor monozaharide n acelai mod conduce la formarea macromoleculelor polizaharidice. Pentozele, monozaharide cu 5 atomi de C cuprind ribozele, componentele ribonucleotidelor i acizilor ribonucleici i dezoxiribozele, componente ale dezoxiribonucleotidelor i acidului dezoxiribonucleic. Hexozele sunt monozaharide cu 6 atomi de carbon i ar fi de menionat glucoza, care n form liber este o surs vital de energie, energia i caracterul reductor sunt nmagazinate apoi sub form de compui intermediari (ATP i respectiv, NADH).

12

Glicoliza este o cale amfibolic, avnd semnificaie funcional energetic preponderent n esutul muscular n contracie, esutul nervos i eritrocite i o semnificaie biosintetic prin compuii intermediari pe care i genereaz. Manoza, o alt hexoz, intr n constituia glicoproteinelor sanguine umane. Poliglucidele pot fi omogene, constituite dintr-un singur tip de oze, cum este glicogenul, format numai din resturi de glucoz, unica form de depozitare a glucidelor n lumea animal n hepatocite, celulele musculare i n cantitate mai mic i n alte celule. Heteropoliglucidele dau prin hidroliz amestecuri de monozaharide i/sau derivai ai lor, la care se pot aduga proteine sau lipide. Cuprind glicozaminoglicanii, numii i mucopolizaharide ntlnii n special n structura esutului conjunctiv (acidul hialuronic-substana fundamental a esutului conjunctiv i cartilaginos, n corpul vitros i n lichidul sinovial, acizii condroitinsulfurici, keratansulfatul, heparina), iar glicozaminoglicanii legai covalent de proteine formeaz proteoglicanii numii i mucoproteine din substana fundamental a esutului conjunctiv sau din mucoase i lipopolizaharidele de pe suprafaa extern a peretelui celular al bacteriilor Gram-negative (endotoxine). Lanuri mai scurte, dar complexe constituite din uniti monozaharidice sunt aadar legate de proteine formnd glicoproteine sau de lipide, formnd glicolipide. Lipidele au trei componente: lipidele simple- acizii grai, lipidele complexe- fosfolipide i glicolipide i lipidele de rezerv- trigliceridele. Acizii grai au roluri fundamentale n celule: energetic, biosintetic, structural. Acizii grai sunt catabolizai n celule prin -oxidarea mitocondrial, proces cu rol predominant energetic, cu randament dublu fa de al glicolizei. Acizii grai sunt eliberai prin degradarea trigliceridelor, proces intensificat de factori hormonali, inaniie, frig sau compui toxici. Prin generarea de acetil-CoA, intermediar n procese biosintetice, rolul lor devine dublu, dar cel mai important rol este cel structural, prin sinteza pornind de la acizi grai a fosfolipidelor membranare. Fosfogliceridele sunt formate din glicerol esterificat cu 2 molecule de AG, i o molecul de acid fosforic. n consecin, fiecare molecul de fosfolipid are o coad hidrofob constituit din lanurile de AG i un cap hidrofil polar, format din restul de acid fosforic, structur care st la baza arhitecturii de bistrat lipidic al membranelor biologice. Prostaglandinele, modulatori ai aciunilor hormonale, ai transmisiei nervoase i ai schimburilor ionice celulare se formeaz din acizi grai nesaturai. Sterolii au ca reprezentant principal colesterolul, component structural fundamental al celulelor animale, n special la nivelul membranelor. Hormonii steroidici (sexuali, corticosteroizi) au precursor comun colesterolul. Vitaminele D sunt compui de origine steroid. Exist 20 de aminoacizi universal rspndii, care intr curent n structura proteinelor. Exist AA care nu intr n structura proteinelor, au rol metabolic sau structural important, de exemplu acidul -aminobutiric (GABA) este mediator la nivelul SNC, 5-hidroxitriptofanul este precursor al serotoninei, ornitina i citrulina sunt intermediari n sinteza ureei, etc. Caracteristica comun a acestei clase de constituieni chimici ai celulei este prezena unui grup carboxil i a unui grup amino, ambele grupri fiind legate de acelai atom de carbon denumit . Sunt subuniti ale moleculelor proteice care sunt polimeri lungi, liniari, constitutii din aminoacizi legai prin legturi peptidice ntre gruparea carboxil a unui AA i gruparea amino a AA urmtor. Aminoacizii pe care organismul uman nu i poate sinteza din lipsa unor echipamente enzimatice corespunztoare sau a lipsei unor precursori disponibili, poart denumirea de AA eseniali.

13

Proteinele sunt compui macromoleculari, formai din mai multe lanuri polipeptidice, fiecare lan polipeptidic fiind alctuit din cteva zeci pn la cteva sute de AA. Proteinele reprezint 55-85% din greutatea uscat a celulei, pot fi clasificate dup structura chimic, funcia biologic, solubilitate, forma i mpachetarea molecular, numrul catenelor polipeptidice. Dup structura chimic, sunt proteine simple (holoproteine), care cuprind scleroproteinele- colageni, elastine, keratine, sferoproteine- albumine, globuline, protamine, histone, gliadine, gluteline i heteroproteine sau proteine conjugate- metaloproteine (conin fier, cupru, zinc, mangan, cobalt, molibden, magneziu, cu rol de depozitare sau de transport al acestor metale sau enzime), fosfoproteine, lipoproteine cu grupare prostetic AG, gliceride, fosfolipide, colesterol, nucleoproteinele, cromoproteinele porfirinice (hemoglobina, citocromii, citocromoxidaza, catalaza, peroxidaza), neporfirinice (rodopsina, flavoproteinele) i glicoproteinele care au ca grupare prostetic glucide (monozaharide, acidul glucuronic, aminoglucide- glucozamina, galactozamina, derivai ai monozaharidelor- acidul neuraminic, sialic). Glicoproteinele acide, cu vscozitate mare, sunt componente eseniale ale esutului conjunctiv: mucoproteinele cu acid mucoitinsulfuric, condroproteinele cu acid condroitinsulfuric, hialoproteinele cu acid hialuronic, sialoproteinele cu acid sialic. Glicoproteinele neutre se gsesc n plasma sanguin (haptoglobina, factorii grupelor sanguine, orosomucoidul), n tractul intestinal - factorul intrinsec cu rol n absorbia vitaminei B12, n constituia unor enzime (transferaze), n constituia unor hormoni (LH, FSH, TSH). Proteinele ndeplinesc urmtoarele funcii biologice: formeaz structuri de rezisten-colagen, keratina, sunt proteine contractile- actina, miozina cu rol n contracia muscular, catalizeaz reacii biochimice- enzimele, transport oxigenul- pigmenii respiratori (hemoglobina, mioglobina), transport informaie- hormonii proteici, recepioneaz informaie- receptorii membranari, intervin n mecanismul imun- imunoglobulinele, sistemul complement, regleaz expresia genic- represorii, activatorii, factorii de reglare, histone, pot fi substane toxice- toxinele bacteriene. Nucleotidele sunt unitile structurale fundamentale ale acizilor nucleici, fiind alctuite dintr-o baz azotat purinic sau pirimidinic, o pentoz (riboza- constituent al ARN i dezoxiriboza- constituient al ADN) i acid fosforic. Nucleotidele ndeplinesc urmtoarele funcii biologice: rol n metabolismul energetic, ATP fiind cea mai important form de nmagazinare a energiei, accesibil direct celulei. Ali compui macroergici sunt: GTP, CTP, UTP, etc.; sunt mediatori fiziologici, AMP ciclic este ,,al doilea mesager" n mecanismul de aciune al hormonilor nesteroizi, rol de ,,al doilea mesager" are i GMP ciclic, ADP este mediator n agregarea plachetelor sanguine, adenozina produce dilatarea vaselor coronariene, reglnd circulaia sanguin cardiac; prin policondensarea nucleotidelor se formeaz acizii nucleici; intr n structura unor coenzime: NAD(P), FAD, CoA, etc.; intr n alctuirea unor intermediari activai n metabolismul celular: UDP-glucoza (biosinteza glicogenului), UDP-galactoza (biosinteza glicoproteinelor), CDP-colina i CDP-colamina (biosinteza lipidelor); sunt efectori alosterici, regleaz activitatea unor enzime. Acizii nucleici sunt macromolecule cu structur liniar (polinucleotide), formate prin policondensarea mononucleotidelor, legtura dintre nucleotide fiind format prin esterificarea gruprii hidroxi din poziia 3 a pentozei cu restul fosforic din poziia 5 a nucleotidului urmtor. n funcie de natura pentozei, acizii nucleici se clasific n acid ribonucleici care

14

conin riboz i acid dezoxiribonucleici, care conin dezoxiriboz. Bazele azotate ale ADN sunt: adenina, citozina, guanina i timina, iar ARN conine: adenina, citozina, guanina i uracilul. ADN este purttorul informaiei ereditare, alctuiete genomul tuturor organismelor procariote i eucariote, precum i al dezoxivirusurilor. Cantitatea de ADN din celulele unei specii este constant. La procariote, ADN este localizat n cromozomul bacterian dar i extracromozomal, n episomi i plasmide. La eucariote, ADN se gasete preponderent n nucleu, este ADN cromozomial i n cantiti mici n mitocondrii. Cu ct organismele sunt mai evoluate, cantitatea de ADN este mai mare: la dezoxiribovirusuri 5x10-6 pg/ celul, la mamifere 6pg/ celul. Lungimea extins a moleculei de ADN la virusurile tumorigene este de 1,5 m, iar la mamifere lungimea este de 2m. Cele 6 miliarde de nucleotide din celula mamiferelor corespund la peste 1 milion de gene, din care doar 10% codific proteine i doar cteva mii sunt transcrise. Structura unui cromozom conine o molecul de ADN dublu helix, ADN monocatenar fiind prezent n structura unor dezoxiribovirusuri. ARN sunt clasificai n trei tipuri majore: ARN mesager (2-4% din totalul de ARN celular), ARN de transfer (16-18%), ARN ribozomal (80%), la care se adaug ARN nuclear heterogen, ARN viral i ARN viroidal. ARNm reprezint o copie a catenei codogene a ADN, ARNt este localizat cu precdere n citosol i are rolul de a transporta aminoacizii din citosol la ribozom n cursul biosintezei proteinelor. Exist peste 60 de specii moleculare de ARNt , fiecrui AA din cei 20 corespunzndu-i cel puin unul sau mai multe tipuri de ARNt. ARN ribozomal este reprezentat la eucariote de ARNr 5S, ARNr 5,8S, ARNr 28S n subunitatea ribozomal mare i de ARNr de 18S n subunitatea ribozomal mic. ARN nuclear heterogen este reprezentat de un ansamblu format din ARN premesageri, ARN ribozomali imaturi, alte specii de ARN. Moleculele mici de ARN nuclear i nucleolar formate din 100-180 nucleotide, particip la reglarea fenomenului de transcripie. ARN viral este o molecul monocatenar liniar sau circular sau dublu catenar liniar. n celule se gsesc i alte elemente chimice puin abundente (0,02-0,1%): P, S, Cl, Na, K, Ca, Mg i oligoelemente (

15

3.Membrana celular. Structura molecular i funciile membranelor celulare.

Membrana celular delimiteaz coninutul celular, confer individualitate celulei i menine diferenele eseniale ntre citosol i mediul extracelular. Realizeaz transportul molecular i ionic, conexiunile intercelulare i ancorarea celulelor n matricea extracelular, este sediul reaciilor enzimatice asociate structurilor membranare, are rol n semnalizarea celular, recunoaterea, legarea i transmiterea moleculelor semnal care nmagazineaz informaie, precum i n imunitate.

3.1. Structura molecular a membranelor biologice

Membranele biologice au o structur general identic, de ,,mozaic fluid" lipido-proteic, cu o grosime de 6-10 nm grosime. Este un fluid structural alctuit din bistrat lipidic penetrat total sau parial de molecule proteice; ntre lipidele i proteinele membranare exist mai ales legturi necovalente.

3.1.1.Dublul strat lipidic ( bistratul lipidic) al membranelor biologice

Este o component fundamental de 5nm grosime, observabil n microscopie electronic. Are structur fluid, confer membranelor proprietatea de membran impermeabil pentru moleculele hidrosolubile. Structura de bistrat este atribuit proprietilor speciale ale lipidelor membranare, care se asociaz spontan sub form de bistrat i n condiii artificiale.

Figura1. Structura membranei celulare (imagine preluat din cellbiology.med.unsw.edu.au)

16

3.1.2.Lipidele majore ale membranelor celulare

Lipidele majore ale membranelor celulare reprezint 50% din greutatea acestora i sunt reprezentate de trei clase majore: fosfolipidele, colesterolul, glicolipidele. Exist 500-1000 de tipuri diferite de lipide n funcie gruprile din capul polar, lungimea i gradul de desaturare al acizilor grai componeni, n care sunt incluse i lipidele minore, de exemplu fosfatidilinozitolul. Bistratul lipidic conine 5x106 molecule lipidice/ m2.

3.1.2.1.Fosfolipidele membranare Clasa fosfolipidelor cuprinde fosfogliceridele i sfingolipidele i reprezint peste 50% din fosfolipidele membranare. Fosfolipidele au caracter amfipatic deoarece sunt formate dintr-o regiune hidrofil polar sau cap polar i o regiune hidrofob nepolar sau cozi hidrofobe. Regiunea hidrofob este format din dou cozi hidrofobe alctuite fiecare din cte un acid gras cu 14-24 atomi de carbon, unul fiind acid gras saturat, iar cellalt nesaturat, cu una sau mai multe legturi duble de tip ,,cis". Diferenele n lungimea lanului de atomi de carbon ai acizilor grai i n gradul lor de nesaturare influeneaz mpachetarea moleculelor lipidice i fluiditatea bistratului. Prezena dublelor legturi de tip ,,cis" introduce un punct de inflexiune n catene acidului gras nesaturat.

Figura 2. Bistrat fosfolipidic n care atomii unei molecule fosfolipidice sunt reprezentate ca

sfere (imagine prelucrat din http://courses.washington.edu/conj/membrane/bilayer.htm)

Cele mai numeroase fosfolipide membranare sunt fosfogliceridele. Ele sunt formate dintr-un schelet de glicerin, prin esterificarea a dou grupri hidroxil din structura glicerinei cu doi acizi grai i a celei de-a treia cu acid fosforic. Gruparea fosfat la rndul ei, leag diferite tipuri de molecule, formndu-se regiunea cap hidrofil a diferitelor tipuri de fosfogliceride: fosfatidiletanolamine, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidilgicerol,

17

difosfatidilglicerol (cardiolipina), fosfatidilinozitol. n acidul fosfatidic gruparea fosfat nu este legat la o alt molecul polar.

Figura 3. Fosfogliceride membranare ( imagine prelucrat dup John M. Owens, Ph.D

http://www.agen.ufl.edu)

Sfingolipidele conin sfingozin (un aminoalcool) n loc de glicerol. Sfingozina este format dintr-un lan lung nesaturat, cu o grupare amino care leag un acid gras prin legtur amidic, rezultnd structura ceramidic i dou grupri hidroxil, dintre care gruparea hidroxil terminal a sfingozinei leag prin legtur fosfodiesteric gruparea polar. Sfingolipidul major este sfingomielina.

Figura 4. Structura general a unui sfingolipid. Structura specific a unei molecule depinde

de tipul gruprii R2 i de lungimea lanului hidrofob al acidului gras R1. (imagine prelucrat din

http://www.britannica.com)

18

3.1.2.2.Colesterolul Raportul molecular colesterol:fosfolipide n membranele celulare este de 1:1. Molecula de colesterol se insereaz ntre fosfolipidele membranare, orientndu-se cu gruparea hidroxil n vecintatea capului polar al fosfolipidelor. Inelul steroidic este o structur rigid, plan, care interacioneaz cu lanul hidrocarbonat adiacent capului polar, lsnd restul cozilor hidrofobe ale acizilor grai libere, flexibile. Colesterolul moduleaz proprietile bistratului lipidic, intensificnd proprietatea de barier impermeabil fa de moleculele mici solubile n ap, influeneaz fluiditatea membranei, previne interaciunea lanurilor hidrocarbonate ale acizilor grai din structura lipidelor membranare.

Figura 5. Interaciunea colesterolului cu fosfolipidele n bistratul lipidic (imagine prelucrat

din http://www.yellowtang.org/chemistry.php)

3.1.2.3.Glicolipidele membranare Glicolipidele membranelor celulare sunt specifice pentru specie, sunt de asemenea tisular-specifice i reprezint 5% din moleculele lipidice ale monostratului extern. Conin un cap polar format din unul sau mai multe resturi glucidice, ataate la o structur ceramidic. De exemplu, n structura galactocerebrozidelor, sfingozina mpreun cu acizii grai formeaz o structur ceramidic de care sunt ataate resturi de galactoz, iar gangliozidele conin unul sau mai multe resturi de acid sialic (acid N-acetilneuraminic) care imprim acestor molecule ncrctur negativ. n consecin, gangliozidele particip la construcia molecular a canalelor ionofore i la mecanismul de transmitere a informaiei de la suprafaa celulei (semnalizarea celular). Clasele de lipide membranare, datorit structurii i proprietilor lor imprim membranelor anumite caracteristici:

19

1. Fosfolipidele formeaz spontan bistratul, deoarece au o regiune hidrofil sau polar care este capabil de interaciuni electrostatice sau prin legturi de hidrogen cu moleculele de ap. Regiunile hidrofobe sunt insolubile n ap deoarece nu pot forma interaciuni energetic favorabile cu moleculele de ap. Ca urmare, moleculele de ap nconjoar moleculele hidrofobe formnd structuri asemntoare unor ,,cuti", n care moleculele de ap se prezint ntr-un aranjament mult mai ordonat dect n apa care constituie mediul nconjurtor. Costul energetic este minimalizat dac moleculele hidrofobe se acumuleaz ct mai strns, astfel nct un numr ct mai mic de molecule de ap s fie implicate n nconjurarea lor. Introduse n mediu apos, moleculele cu caracter amfipatic ale lipidelor membranare agreg spontan n aa mod nct adpostesc regiunile (cozile) hidrofobe n interiorul structurilor sferice denumite micelii sau plane denumite bistrat lipidic, fiind expuse apei regiunile cap hidrofile. 2. Fosfolipidele se rearanjeaz spontan, refac bistratul atunci cnd apar bree n acesta. 3. Un alt caracter este fluiditatea care st la baza caracterului dinamic al membranelor celulare. La o anumit valoare de temperatur denumit temperatur critic, are loc tranziia de faz, adic trecerea bistratului din stare fluid n stare de gel, datorit scderii mobilitii legturilor C-C din lanuri hidrocarbonat ale acizilor grai din structura fosfolipidelor. Are loc trecerea de la o conformaie randomic la o conformaie cu grad superior de ordonare. Valoarea de temperatur la care are loc tranziia de faz depinde de lungimea i caracterul nesaturat al lanurilor hidrocarbonate ale fosfolipidelor. Lanurile hidrocarbonate mai scurte i prezena legturilor duble favorizeaz organizarea randomic datorit scderii numrului de legturi van der Waals dintre regiunile hidrofobe. Fluiditatea depinde i de coninutul de colesterol al membranelor, concentraiile mari de colesterol scad fluiditatea bistratului. Aceast scdere a fluiditii are efecte aupra funciilor membranei celuare, prin scderea permeabilitii pentru ap i molecule hidrofile i creterea rezistenei mecanice a acestora. Prezena glicolipidelor influeneaz fluiditatea: gangliozidele se caracterizeaz prin capacitatea de a participa la formarea legturilor de hidrogen care determin creterea gradului de ordonare molecular i scderea fluiditii. 4. Bistratul lipidic este format din domenii cu compoziie diferit: forele van der Waals (fore de atracie ntre lanurile hidrocarbonate ale lipidelor membranare adiacente) nu sunt suficient de selective pentru a ine mpreun grupurile de molecule fosfolipidice, n consecin apar domenii specializate denumite ,,bacuri de lipide". Un exemplu de astfel de domenii sunt caveolele implicate n endocitoz, bogate n colesterol i sfingolipide, mpreun cu proteine specifice cu rol stabilizator al acestor domenii. Un alt exemplu este cel al unor domenii care conin o proporie ridicat de sfingolipide care, avnd lanuri hidrocarbonate mai lungi, determin la acest nivel o grosime crescut a bistratului, intervenind n organizarea moleculelor proteice pentru a-i ndeplini funciile: de transport, de semnalizare celular. 5. Organizarea sub form de monostrat a lipidelor (n loc de bistrat) este caracteristic picturilor lipidice cu rol n depozitarea trigliceridelor i colesterolului esterificat, fiind surs de precursori lipidici pentru sinteza membranelor sau surs de substrate pentru metabolismul energetic. Monostratul lipidic conine mari cantiti de proteine, unele cu funcie n metabolismul lipidelor, altele cu funcie necunoscut. Lipidele neutre din aceste picturi lipidice sunt molecule hidrofobe care n mediul apos intracelular agreg n picturi tridimensionale nconjurate de monostratul lipidic, cu cozile hidrofobe orientate spre

20

coninutul n lipide neutre, iar cu capetele hidrofile spre mediul apos intracelular. Aceast organizare este ntlnit n special n adipocite.

3.1.3. Proteinele membranelor celulare

Proteinele membranare sunt moleculele implicate n funciile majore ale membranelor celulare. Reprezint 50% din greutatea membranelor celulare i 75% din greutatea membranelor mitocondriale, cu o intens activitate metabolic. Clasificarea acestor proteine s-a fcut dup criteriul topografic, dar i dup aspectul interaciunilor cu moleculele lipidice ale bistratului n dou clase: proteine integrale ale membranelor i proteine periferice (de suprafa).

Figura 6. Tipuri de proteine ale membranei celulare (imagine prelucrat din ,,The Cell,

Geoffrey M. Cooper)

3.1.3.1. Proteinele integrale

Pot penetra membrana n ntregime datorit caracterului lor amfipatic: regiunea central localizat n interiorul membranei are caracter hidrofob i interacioneaz cu lanurile hidrocarbonate ale fosfolipidelor, fiind alctuit din aminoacizi cu caracter nepolar. Legturile dintre aminoacizi sunt legturi peptidice care sunt legturi polare i pentru c apa este absent n compartimentul hidrofob al membranelor, aceste legturi peptidice vor forma puni de hidrogen ntre ele. Domeniile hidrofile ale moleculelor proteice vor fi expuse pe faa extracelular i citosolic a membranelor, n contact cu gruprile polare ale moleculelor lipidice. Lanurile polipeptidice ale acestor proteine transmembranare pot realiza unul sau mai multe pasaje prin bistratul lipidic, prezentnd conformaie de -helix: un pasaj prin bistrat- un -helix ( ,,singlepass"), mai multe pasaje prin bistrat- mai multe -helixuri (,,multipass"). Conformaia de -helix nu este unica conformaie a proteinelor transmembranare. Aceste proteine pot prezenta conformaie a lanului polipeptidic de -foaie pliat, care poate fi mpachetat sau rulat n continuare n conformaie de ,,-barrel", multiplele segmente transmembranare putnd satisface n acest caz necesitatea de legturi de

21

hidrogen. -helixurile proteinelor transmembranare au funcie de ancorare n bistratul lipidic prin compoziia n aminoacizi hidrofobi. Multe proteine transmembranare care realizeaz un singur pasaj prin bistrat formeaz homodimeri datorit interaciunilor dintre domeniile -helix adiacente, cruciale pentru structura i funcia proteinelor-canal i proteinelor transportor. Proteinele transmembranare care realizeaz mai multe pasaje sunt formate din mai multe -helixuri, toate constituite din aminoacizi hidrofobi, deoarece dup sinteza lor n citosol, acestea sunt iniial integrate n bistratul lipidic de o protein-translocaz, fiind nconjurate de molecule lipidice. mpachetarea moleculei proteice apare ulterior i apr o parte din -helixuri de contactul cu lipidele membranare, unele interaciuni proteine-lipide fiind nlocuite cu interaciuni proteine-proteine i -helix--helix, facilitnd astfel apariia unor structuri canal pentru transportul moleculelor hidrofile mici prin membrana hidrofob . Unele proteine integrale strbat parial membrana i sunt integrate n bistrat n moduri diferite: 1. Proteinele prezente pe faa citoplasmatic, cum este familia de proteine Src kinaze care convertesc semnale extracelulare n semnale intracelulare, conin acid miristic adugat la gruparea aminoterminal a proteinei n timpul sintezei n ribozomi- se stabilete o legtur amidic. Acidul miristic reprezint o prim ancor, care se inser n monostratul citoplasmic al bistratului, ns este o ancor slab. Apariia unei molecule-semnal din mediul extracelular determin adugarea acidului palmitic la un rest de cistein al lanului polipeptidic pentru a ancora mai ferm proteinele Src. Oprirea semnalelor extracelulare conduce la desprinderea acidului palmitic i desprinderea kinazelor din membrana celular, urmat de eliberarea lor n citosol i, firete, de inactivarea cii de semnalizare celular. Inserarea unor proteine cum sunt proteinele p21ras se poate realiza prin legarea unui rest farnezil la un rest de cistein prin legtur tioesteric, la captul C-terminal al proteinei. 2. Proteinele situate pe faa exoplasmic a membranelor celulare se ancoreaz de monostratul lipidic prin intermediul unui fosfolipid glicozilat care conine resturi glucidice inozitol i N-acetilglucozamina.

Figura 7. Proteinele integrale de pe faa citoplasmic i exoplasmic a membranei celulare

(imagine prelucrat din ,,The Cell, Geoffrey M. Cooper)

22

3.1.4. Carbohidraii membranelor celulare

Reprezint 2-10% din greutatea componentelor membranare. Oligo- i polizaharidele se leag covalent de proteinele sau lipidele membranare formnd glicoproteine i respectiv, glicolipide: majoritatea proteinelor de suprafa ale membranelor sunt glicoproteine i una din zece molecule lipidice membranare sunt glicozilate. Proteoglicanii sunt constituii dintr-o component proteic n bistratul lipidic i o component polizaharidic. Lanul polizaharidic rmne n exteriorul celulei, fiind o component a matricei extracelulare.

3.1.5. Mobilitatea proteinelor i lipidelor n membrana celular

Mobilitatea proteinelor i lipidelor n monostratul lipidic se realizeaz prin difuzie lateral. Un alt mecanism este difuzia rotaional, care semnific micarea de rotaie a unei biomolecule n jurul unei axe perpendiculare pe planul membranei. Att difuzia lateral ct i cea rotaional sunt favorizate energetic, deoarece regiunile nepolare ale moleculelor proteice i lipidice nu prsesc interiorul hidrofob. Difuzia transversal denumit i inversiune sau ,,flip-flop" se realizeaz prin deplasarea moleculelor ntre cele dou monostraturi ale bistratului lipidic. Mobilitatea lipidelor i proteinelor membranare mpreun cu fluiditatea bistratului determin caracterul dinamic al membranelor celulare.

3.1.6. Asimetria distribuiei componentelor membranare

Este o caracteristic cu rol esenial n realizarea funciilor celulare. Distribuia asimetric a moleculelor lipidice pe cele dou fee ale bistratului poate fi exemplificat prin structura membranei hematiilor care conine n monostratul lipidic extern predominant fosfatidilcolin i sfingomielin, iar n monostratul intern fosfatidiletanolamin i fosfatidilserin. Consecinele sunt multiple: diferenele gradului de nesaturare ale lanurilor hidrocarbonate ale lipidelor i natura diferit a gruprilor polare determin diferene n fluiditatea celor dou monostraturi, apare de asemenea i o distribuie diferit a sarcinilor electrice, fosfatidilserina fiind singurul fosfolipid cu sarcin negativ. Importana funcional a asimetriei de distribuie a componentelor membranare poate fi exemplificat astfel:

a. Activitatea enzimatic a proteinelor asociate membranei este dependent de sarcina electric a fosfolipidelor, proteinkinazele necesitnd prezena fosfatidilserinei cu sarcin electric negativ.

b. n timpul apoptozei, fosfatidilserina este translocat n monostratul exoplasmic al bistratului lipidic i expus astfel pe suprafaa celular, semnalizeaz macrofagelor prezena unei celule moarte, acesta fiind semnalul pentru fagocitare. Translocarea fosfatidilserinei n monostratul extern se produce prin inactivarea translocazei care realizeaz translocri din monostratul extern n cel intern i activarea scramblazei care transfer fosfolipide nespecific ntre monostraturile lipidice.

Localizarea glicolipidelor n monostratul extern este implicat funcional n mecanisme de semnalizare celular, ele funcionnd ca receptori. De exemplu, toxina holeric

23

se leag doar de celule care prezint gangliozide GM1 pe suprafaa celular (celulele epiteliului intestinal). Se remarc localizarea proteinelor membranare, mai precis orientarea strict, specific pe faa exoplasmic sau citosolic a unor domenii ale moleculelor proteice. De exemplu, glicoproteinele au lanurile oligozaharidice orientate pe faa extern a membranelor celulare i pe faa citosolic a membranelor reticului endoplasmic i aparatului Golgi. Localizarea asimetric a lipidelor i proteinelor determin delimitarea specific a unor domenii structural-funcionale ale membranelor celulare: un exemplu ilustrativ este domeniul apical, respectiv laterobazal al membranei celulelor epiteliului intestinal.

3.2. Funcia de transport a membranelor celulare

Existena celulelor depinde de o permanent comunicare cu mediul nconjurtor, iar un rol fundamental n aceast comunicare o are proprietatea de permeabilitate selectiv a membranelor celulare. Consecina este meninerea homeostaziei celulare, adic asigurarea concentraiilor intracelulare relativ constante ale substanelor organice, ionilor, metaboliilor, meninerea unei activiti metabolice stabile i reglarea volumului celular. Permeabilitatea selectiv este influenat de metabolismul celular, condiiile din mediul extracelular i tipul de esut. Transportul diferitelor substane prin membran depinde de caracteristicile substanei transportate (greutatea molecular, forma, dimensiunile, gradul de ionizare, gradul de hidratare) i de compoziia chimic a membranelor, clasificndu-se n: Transport de ioni i molecule mici prin mecanisme de difuzie sau mecanisme n care sunt implicate proteine membranare. Transport de macromolecule i particule prin vezicule delimitate de membrane. Dup consumul de energie metabolic nmagazinat n ATP, transportul prin membranele celulare se clasific n transport pasiv i transport activ.

3.2.1. Transportul pasiv

Transportul moleculelor i ionilor prin membrana celular n sensul gradientului de concentraie sau electrochimic se numete transport pasiv. Decurge fr consum de energie inmagazinat n ATP, cteodat chiar cu pierdere de energie liber.

3.2.1.1. Difuzia simpl

Caracterizeaz moleculele mici cu caracter hidrofob i gazele: CO2, O2. Este cel mai simplu tip de transport pasiv, difuzia simpl fiind determinat de gradientul de concentraie i/sau electric al particulelor transportate, de o parte i de alta a membranei. Moleculele nu sunt modificate chimic sau asociate altor molecule n cursul trecerii prin membran. Difuzia simpl se desfoar n urmtoarele etape:

24

1. Trecerea moleculelor din mediul extracelular sau intracelular apos n interiorul hidrofob al membranei

2. Traversarea bistratului lipidic 3. Deplasarea moleculelor din membran n mediul apos intracelular sau

extracelular

Viteza cu care se desfoar etapa 1 depinde de coeficientul de partiie (K) al moleculei, care msoar afinitatea relativ a moleculei pentru mediul lipidic n raport cu apa, altfel spus, ilustreaz gradul de hidrofobicitate al moleculei. Cu ct valoarea acestui coeficient este mai mare, molecula este mai hidrofob (liposolubil) i ptrunde mai repede n celul. Coeficientul de partiie este direct proporional cu constanta de permeabilitate a membranelor celulare (P). Viteza de difuzie a moleculelor prin membran este mult mai mic n mediu apos, deci etapa 2 limiteaz viteza transportului. Difuzia simpl se desfoar conform legii lui Fick dac avem gradient de concentraie pe cele dou fee ale membranei:

(dn/dt) = P x S (C1aq C2

aq)

adic, viteza de difuzie este direct proporional cu diferena de concentraie, suprafaa i coeficientul de permeabilitate al membranelor.

3.2.1.2. Difuzia facilitat a moleculelor i ionilor

Figura 8. Transportul pasiv prin difuzie facilitat de proteinele canal sau de permeaze

(imagine prelucrat din http://www.brooklyn.cuny.edu)

A. n difuzia facilitat transportul pasiv este mediat de proteine membranare denumite permeaze care au specificitate fa de molecula transportat, proces cu cinetic de tip enzimatic. Permeaza leag reversibil la un situs activ pe o fa a membranei o singur specie molecular sau molecule ce aparin unei singure familii: se formeaz complexul permeaz-molecul care traverseaz bistratul, disociindu-se pe cealalt fa a membranei, cu eliberarea moleculei transportate. Viteza cu care are loc difuzia facilitat n funcie de concentraia moleculei transportate a evideniat existena unei relaii de tip Michaelis-Menten pentru reacii enzimatice cu un singur substrat. Viteza atinge o valoare maxim atunci cnd devine independent de concentraia substratului: la vitez maxim apare fenomenul de

25

saturare, toate permeazele fiind ,,ocupate", implicate n complexe de tip permeaz-molecul de transportat. O alt caracteristic comun ntre difuzia facilitat i reaciile enzimatice este inhibiia specific competitiv prin molecule similare sau necompetitiv, de exemplu prin ioni ai metalelor grele sau 2,4 dinitrofluorobenzen. Modelul propus: modelul transportorilor crui care execut o micare de rotaie n bistratul lipidic care are drept rezultat trecerea moleculelor de pe o fa pe alta a membranelor celulare. Un exemplu este transportul unor ioni de polipeptide antibiotic (valinomicina transport n acest mod ionul de potasiu). Un alt model este cel n care permeaza sufer o modificare conformaional n urma legrii moleculei de transportat, consecina fiind o modificare conformaional, formarea unui ,,canal" prin care moleculele pot traversa membrana. Modificarea conformaional ar determina de fapt orientarea aminoacizilor hidrofili ai permeazei spre interiorul moleculei, care ar delimita ,,canalul" prin care pot trece moleculele hidrofile. B.Difuzia mediat de proteinele canal, proteine transmembranare strbtute de un canal delimitat de aminoacizi hidrofili care formeaz pori membranari: 1. proteinele canal ionice prin care ionii difuzeaz cu diferite viteze n sensul gradientului de concentraie. Sunt de mai multe tipuri n funcie de modul cum are loc deschiderea lor care este un rspuns celular la stimuli mecanici, sau pot fi canale dependente de voltaj ( potenialul de membran) sau de liganzi. Ligandul poate fi un mediator extracelular (neurotransmitor) sau intracelular (ion, nucleotid, protein de legare a GTP).

Figura 9. Proteinele canal ionice cu poart (imagine prelucrat din ,,Molecular Biology of the

Cell, Bruce Alberts et al.)

Canalele cu poart comandat de voltaj Celulele excitabile (neuronul i celulele musculare) sufer modificri controlate ale valorilor potenialului de membran, asigurndu-se conducerea impulsului electric de-a lungul membranei plasmatice. Celulele aflate n stare de repaus se caracterizeaz prin potenial de membran denumit potenial de repaus. n prezena unui stimul, se produce o excitaie electric rapid, autopropagabil, cu caracter tranzitoriu denumit potenial de aciune care

26

genereaz un ciclu de depolarizare a membranei, hiperpolarizare, revenire la starea de repaus, asociate creterii tranzitorii a permeabilitii membranei celulare pentru ionii de Na i K, datorit conformaiilor moleculare alternative ale proteinelor canal n funcie de diferena de potenial. Depolarizarea este determinat de creterea permeabilitii pentru Na+, n consecin ionii de Na ptrund n celule datorit gradientului de concentraie ionic i potenialului de repaus. Se deschid i proteinele canal pentru K+, se produce efluxul ionilor de potasiu. Exist dou opiuni n acest moment: anularea generrii potenialului de aciune sau dezvoltarea potenialului de aciune, n funcie de permeabilitatea pentru Na/K. Dac permeabilitatea pentru ionii de sodiu este mai mare dect permeabilitatea pentru ionii de potasiu, influxul de Na este mai mare dect efluxul de K: se produce accentuarea depolarizrii locale a membranei i apare potenialul de aciune. La un prag de +35 mV canalele de Na+ sunt nchise-inactive i membrana fiind refractar la noi stimuli, este posibil restabilirea potenialului de repaus. Proteinele canal pentru Na+ sunt formate din patru domenii transmembranare, fiecare alctuit din cte ase -helixuri. Al 4-lea -helix din fiecare domeniu este alctuit din aminoacizi ncrcai pozitiv ( arginin, lizin), cu rol de senzor voltaic. Canalele cu poart comandat de liganzi. Structurile joncionale specializate n transmiterea semnalelor de la neuroni la celule-int: neuroni sau celule musculare, poart denumirea de sinapse, care pot fi electrice sau chimice. Sinapsele chimice implic eliberarea de ctre neuroni a neurotransmitorilor care acioneaz asupra celulelor-int, mpachetai sub form de vezicule sinaptice n terminaia axonal a neuronului presinaptic. Eliberarea neurotransmitorului n placa sinaptic determin creterea concentraiei de Ca++ n celula presinaptic, ca urmare a deschiderii canalelor pentru Ca++ cu poart comandat de voltaj, n momentul apariiei potenialului de aciune. Legarea neurotransmitorilor de receptorii membranari ai celulei postsinaptice determin modificarea conformaiei acelui receptor, deschiderea canalului ionic, adic modificarea permeabilitii locale a membranelor urmat de depolarizare i propagarea potenialului de aciune. De exemplu, legarea acetilcolinei la receptorul nicotinic crete local permeabilitatea membranei postsinaptice pentru Na+ i K+ , apare depolarizarea membranei i este generat potenialul de aciune. La rndul su, propagarea potenialului de aciune determin deschiderea proteinelor canal pentru Na+ (comandate de voltaj) din sarcolem, depolarizarea membranei reticulului sarcoplasmic i eliberarea Ca++ n citosol. Creterea concentraiei intracelulare a calciului determin contracia muscular.

2. proteinele canal ionice de repaus, dintre care cel mai reprezentativ este canalul de K+ a crui existen explic permeabilitatea mare a membranelor celulare pentru ionii de potasiu i rolul major al K+ n meninerea potenialului de membran. Exist peste 100 de tipuri de canale pentru ioni. Canalul de K+ este dotat cu aminoacizi ncrcai electronegativ care atrag cationii i cu un filtru ion-selectiv alctuit de atomii de oxigen ai gruprilor carbonil.

27

Figura 10. Modul de aciune al filtrului ion-selectiv care permite trecerea selectiv a ionilor n

funcie de dimensiunea lor: distana dintre ionul de potasiu i oxigenii carbonil ai filtrului este

aceeai cu distana dintre ionul de potasiu i atomii de oxigen ai apei care nconjur ionii cnd

acetia sunt n mediul apos (nainte de intrarea n filtru).Ionii de sodiu sunt de dimensiuni mai mici,

distana dintre aceti ioni i oxigenul carbonil al filtrului este mai mare dect distana dintre ionii de

sodiu i atomii de oxigen ai apei, deci ei nu pot interaciona cu oxigenii carbonil ai filtrului, rmn n

soluie apoas nefiind preluai de proteina canal cu filtru selectiv pentru potasiu.(imagine prelucrat

din http://www.aquaporins.org/aquaporins/ion.htm)

Datorit transportului selectiv al ionilor prin membrana plasmatic i a diferenelor de compoziie ionic dintre citosol i mediul extracelular, cele dou fee ale membranei sunt diferite din punctul de vedere al ncrcturii electrice: faa citoplasmic este ncrcat negativ n raport cu faa exoplasmic, deci exist o diferen de potenial electric denumit potenial de membran. Transportul unei specii ionice prin aceste proteine canal depinde de gradientul de concentraie ionic i valoarea potenialului de membran, care mpreun formeaz gradientul electrochimic. Meninerea stabilitii potenialului de membran se realizeaz prin mecanisme n care proteinele canal pentru K+ au un rol central. Pomparea ionilor de Na n spaiul extracelular prin activitatea Na+/K+ ATPazei conduce la creterea numrului sarcinilor electrice pozitive pe faa exoplasmic a membranelor i la apariia unui exces de sarcini electrice negative pe faa citoplasmatic datorit anionilor organici intracelulari. Restabilirea echilibrului se produce datorit influxului de K+ prin funcionarea Na+/K+ ATPazei, dar i prin difuzia lor liber prin canalele de K+. Influxul de potasiu are loc mpotriva gradientului de concentraie, sub aciunea forelor de atracie electrostatic determinate de sarcinile electrice negative din celul.

3. canalele de transport pentru ap (aquaporinele) Sunt impermeabile pentru ioni: Na+, K+, Ca++, Cl , H+, deoarece sunt prevzute cu canale nguste care permit moleculelor de ap s treac urmnd calea oxigenului carbonil i aminoacizilor hidrofobi care flancheaz constriciile aquaporinelor. Porul este prea ngust pentru a permite ionilor hidratai s traverseze, iar dehidratarea ionilor implic consum energetic foarte ridicat care nu poate fi compensat deoarece peretele de aminoacizi hidrofobi nu poate interaciona cu ionul dehidratat pentru a compensa pierderea apei. Aquaporinele

28

sunt impermeabile pentru ionii de hidrogen. Cei mai muli H+ sunt prezeni n celul sub form de H3O

+, ruperea i desfacerea legturilor de H dintre moleculele de ap decurgnd extrem de rapid. Aquaporinele au resturi de asparagin plasate strategic, care se leag de atomul de oxigen al moleculei de ap. Doarece ambele valene ale atomului de oxigen sunt ocupate, ele nu mai sunt disponibile pentru a lega protoni. Au fost identificate 13 tipuri de aquaporine n membranele celulelor umane, membri ai unei familii de proteine majore intrinseci de membran, care transport apa n i din celul, prevenind trecerea ionilor i altor substane. Prima aquaporin descoperit a fost AQP1 din membrana eritrocitului, a crei existen a fost raportat de profesor dr. Gheorghe Benga de la Universitatea de Medicin i Farmacie ,,Iuliu Haieganu din Cluj-Napoca, n 1986. ncercrile de izolare ale antigenului Rh, evideniau constant o protein asociat de 28 kDa, necunoscut, cu funcie nedeterminat, dar cu prezen constant n membrana hematiilor i n membranele celulelor tubilor renali. Peter Agre este cel care izoleaz i caracterizeaz aceast protein cu funcie de transport al apei, dup ce mult timp a fost suspectat un mecanism adiional de transport al apei care ar explica permeabilitatea mare pentru ap a membranelor unor tipuri de celule, permeabilitate care nu poate fi explicat prin simpla osmoz. Pentru activitatea sa de caracterizare i demonstarare a existenei aquaporinelor, Peter Agre primete premiul Nobel n 2003. Aquaporinele sunt formate din 6 domenii -helix transmembranare care determin 5 bucle interhelicale (A-E) care formeaz domeniile extracelulare i citosolice ale proteinei. Buclele B i E sunt buclele hidrofobe care conin un motiv nalt conservat Asn-Pro-Ala (NPA) care prin suprapunere n poriunea central hidrofob a bistratului lipidic, formeaz una din cele dou constricii ale aquaporinei n form de clepsidr. Cealalt constricie, mai ngust, este filtrul selectiv ar/R (aromatic/Arg), care slbete legturile de H dintre moleculele de ap, permind acestora s traverseze porul ngust al aquaporinelor i s interacioneze cu resturile de arginin ncrcate pozitiv datorit valenei negative a oxigenului. n acelai timp este oprit trecerea protonilor prin aceast protein-canal ( ionii hidroniu H3O

+ sunt ncrcai pozitiv). AQP1 se gsete n membrana bazolateral i apical a celulelor epiteliale din tubii contori proximali, ansa lui Henle i vasa recta, n membranele hematiilor, endoteliilor vasculare i tractului gastrointestinal. AQP2 se gsete n ductul colector principal al rinichilor i este controlat de vasopresin, mutaii n gena AQP2 determin diabetul insipid. AQP2 apare n membrane intracelulare. Tipurile 3 i 4 sunt rspunztoare de reabsorbia apei la nivelul ductelor colectoare medulare din rinichi. Tipurile 3, 7, 9 i 10 sunt aquagliceroporine, canale care transport glicerol i ap. Dac aquaporinele au un rol crucial n meninerea homeostaziei apei, rolul lor fiziologic i patologic ca transportori ai glicerolului nu este elucidat deplin. Adipocitele sunt sursa major de glicerol, substrat pentru gluconeogeneza hepatic. Aquaporinele 7 i 9 (AQP7, AQP9) sunt canale pentru glicerol n adipocite i hepatocite, care menin balana optim ntre eliberarea glicerolului din adipocite i preluarea acestuia n hepatocite.

29

Figura 11. Structura aquaporinelor, constricia cu resturi NPA i interaciunea moleculelor de

ap cu resturile de asparagin (imagine prelucrat din

www.klockgiesser.com/bio/aquaporine/aquaporine.htlm)

3.2.2. Transportul activ

Pentru a menine constant concentraia ionic a mediului intracelular, celula i-a creat mecanisme de transport activ, capabile s deplaseze moleculele i ionii n sens invers gradientelor de concentraie i electrochimice, datorit consumului de energie metabolic.

3.2.2.1. Transportul activ propriu-zis

n acest tip de transport, proteina-transportor are i funcie ATPazic i utilizeaz energia eliberat prin hidroliza ATP n procesul de transport. Aceste proteine transportoare sunt clasificate n: Clasa ATPazelor de tip P care au ca reprezentant major Na+-K+ ATPaza rspunztoare de eliminarea activ din celul a ionilor de sodiu concomitent cu acumularea intracelular a ionilor de potasiu. Meninerea constant a concentraiei intracelulare de K+ prin funcia acestei pompe asigur condiii pentru desfurarea biosintezei proteinelor, activitii unor enzime i meninerii potenialului de membran.

30

Figura 12. Na+-K+ ATPaza (imagine prelucrat din http://www.bio.miami.edu)

Un alt reprezentant este Ca2+ATPaza care este situat la nivelul membranei celulare i are rolul de a scoate ionii de calciu din celule, pentru meninerea unei concentraii intracelulare potrivite desfurrii proceselor de semnalizare celular. Pe de alt parte, Ca2+ ATPaza localizat n membrana reticulului sarcoplasmic din celulele musculare, scade concentraia intracelular de Ca2+ prin transportul activ al acestor ioni n lumenul reticulului n timpul relaxrii musculare.

Figura 13. Reglarea concentraiei intracelulare de Ca++ prin activitatea Ca++ ATPazelor din membrana

celular i sarcolem (imagine prelucrat din http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem)

Clasa ATPazelor de tip V cuprind pompele de protoni (H+ATPazele) care au funcia de a pompa protoni prin membrana celular a unor tipuri de celule (renale, osteoclaste, macrofage, neutrofile, spermatozoizi, celule tumorale, fiind implicate n procese ca homeostazia, resorbia osoas, transportul cuplat prin membran, fecundarea ovulului de spermatozoid, metastazarea tumoral. H+ATPazele localizate la nivelul membranelor

31

endosomale i lizosomale determin scderea pH-ului din interiorul acestor organite.

Clasa ATPazelor de tip F din membrana mitocondriilor utilizeaz gradientul protonic pentru a sintetiza ATP (cupleaz sinteza ATP cu transportul H+ de la concentraii ridicate la concentraii sczute).

Figura 14. Comparaie structural a ATPazelor de tip V i F. V-ATPazele hidrolizeaz ATP prin

domeniul periferic V1 i realizeaz transportul de protoni prin domeniul transmembranar

integral V0. F-ATPazele (sau ATP sintetazele) funcioneaz n sensul sintezei de ATP, prin cuplarea

micrii protonilor n direcie opus prin F0 cu sinteza ATP in F1. Ambele enzime opereaz prin

mecanism rotaional.

Clasa ATPazelor de tip ABC se remarc printr-un numr mare de molecule ce aparin acestei clase, implicate n mecanisme cu semnificaie n domeniul clinic. Dac ABC ATPazele bacteriene realizeaz importul de ioni, aminoacizi, peptide, proteine, mono- i polizaharide necesare acestor celule, ATPazele ABC ale eucariotelor sunt specializate pentru export. O astfel de ATPaz este proteina de multirezisten la medicamente (,,multidrug resistance protein" MDR ) care este supraexprimat n celulele tumorale umane, determinnd rezisten simultan la o varietate de medicamente citotoxice larg utilizate n chemoterapie, 40% din cancerele umane avnd rezisten multimedicamentoas. ABCATPazele din membrana reticulului endoplasmic transport n lumen peptide provenite din degradarea citosolic a proteinelor virale sau microbiene. Aceste peptide ajung din lumenul RE pe suprafaa celular fiind recunoscute de limfocitele T citotoxice, care n acest mod suprim celulele infectate.Un alt reprezentant al acestei clase este proteina CTFR (,,cystic fibrosis transmembrane conductance regulator"), care este un transportor al ionilor de clor prin

32

membranele celulelor productoare de mucus, saliv, transpiraie, lacrimi sau enzime digestive. Transportul clorului prin membranele celulare are rol n reglarea transportului de ap pentru meninerea fluiditii secreiilor i mucusului, dar i n reglarea transportului membranar de sodiu. Deleia unui aminoacid din poziia 508 a proteinei CTFR determin un blocaj al transportului de ap i sare (NaCl) prin membrane, cu producerea de ctre celulele care cptuesc cile respiratorii sau canalele secretorii ale pancreasului a unui mucus vscos ce obstrueaz aceste ci. Mucusul cu aceste caracteristici defavorizeaz funcia ciliar i favorizeaz infecii bacteriene cronice.

3.2.2.2. Sistemele de cotransport

Proteinele transportor de tip ATPazic nu sunt singurele rspunztoare de transportul activ prin membranele celulare. Celulele au o clas secundar de proteine care import sau export ioni i molecule mici cum sunt glucoza sau aminoacizii mpotriva gradientului lor de concentraie, fr consum de energie provenit din hidroliz de ATP. Proteinele care realizeaz cotransport utilizeaz energia gradientului electrochimic al Na+ sau H+ pentru a transporta simultan o alt substan, proces denumit cotransport. Cnd molecula/ionul transportat i ionul cotransportat trec prin membran n aceeai direcie, procesul se numete simport, iar cnd trec n direcii opuse, procesul este antiport. Un exemplu de cotransport este importul glucozei sau aminoacizilor n celulele epiteliului intestinal sau al tubilor renali mpotriva gradientului lor de concentraie prin cuplarea cu transportul n celul al ionilor de Na.

Figura 15. Simportul Na+-glucoz/aminoacizi (imagine prelucrat din http://www.biochem.arizona.edu)

Micarea Na+ din mediul extracelular n celule este determinat de dou fore: gradientul de concentraie (concentraia Na+ este sczut n mediul intracelular fa de cel extracelular) i de potenialul de membran (faa citoplasmic a membranelor celulare fiind ncrcat negativ n raport cu faa exoplasmic). Pentru fiecare doi ioni de sodiu transportai

33

n celul se produce cotransportul unei molecule de glucoz. n aceelai timp, activitatea Na+-K+ATPazei asigur meninerea gradientului de concentraie al Na+ i simportul continuu al Na+-glucozei/AA n celulele epiteliale. Transportul transcelular al glucozei i aminoacizilor din lumenul intestinal sau tubii renali n snge este condiionat de polaritatea celulelor epiteliale: membrana apical conine proteina simport Na+- glucoz/aminoacizi, iar membrana latero-bazal deine pompe de tip Na+-K+ATPaz i proteine (permeaze) care mediaz difuzia facilitat a glucozei i aminoacizilor n circulaie. Celulele miocardice au o protein membranar denumit sistem antiport Na+-Ca2+ care are un rol mai important n meninerea unei concentraii intracelulare sczute de Ca2+ n aceste celule, importul a trei ioni de sodiu fiind nsoit de exportul unui ion de calciu mpotriva gradientului su de concentraie (concentraia extracelular de Ca2+ este de 10000 de ori mai mare dect cea intracelular). Creterea concentraiei intracelulare de calciu determin contracia, iar activitatea antiportului Na+-Ca++ care scade concentraia intracelular de calciu reduce fora contraciilor inimii. Gradientul de Na+ necesar funcionrii acestui antiport este furnizat prin activitatea Na+-K+ATPazei. Ouabaina i digoxina cresc contraciile musculaturii cardiace n insuficien cardiac congestiv, prin inhibarea Na+-K+ATPazei, ceea ce determin creterea concentraiei intracelulare de Na+ i reducerea activitii sistemului antiport Na+-Ca2+, cu creterea concentraiei intracelulare de ioni de calciu, consecina fiind creterea forei de contracie a miocardului.

Figura 16. Ca++ este transportat n celul prin canalele pentru Ca++ (1) sau prin antiportul Na+-Ca++(2), iar scderea concentraiei intracelulare a calciului se realizeaz prin Ca++ATPaza din membrana plasmatic (3) i antiport Na+-Ca++ (2), dar i prin sechestrarea Ca++ n reticulul sarcoplasmic, nucleu i mitocondrie sau de ctre proteine din citosol-calmodulina, calsequestrina. Reticulul sarcolasmic, ca i nveliul nuclear posed Ca++ATPaz, iar transportul Ca++ n mitocondrie are loc prin transportor de tip uniport (imagine prelucrat din http://ehp.niehs.nih.gov)

Proteina antiport Cl /HCO3 denumit proteina AE1 este proteina integral de

membran predominant n eritrocitele mamiferelor. Schimbul unui anion de clor contra unui anion bicarbonat nu implic modificri ale ncrcturii electrice a membranei, antiportul fiind

34

dependent doar de gradienii de concentraie ai celor doi anioni pe cele dou fee ale membranei. CO2 eliberat din celule ajunge n sngele capilar, difuzeaz prin membrana eritrocitului i este transformat n bicarbonat solubil n ap (anionul HCO3

-), reacie catalizat de anhidraza carbonic:

Eliberarea O2 din oxihemoglobin induce o schimbare conformaional n polipeptidul globin, care permite unei histidine s lege protonul produs n reacia catalizat de anhidraza carbonic cu formare de hemoglobinat acid. HCO3

format este transportat din eritrocit prin acivitatea antiportului Cl /HCO3

, la schimb cu Cl , care ptrunde n eritrocit.

Figura 17. Transportul CO2 de la esuturi la plmni mediat de antiportul Cl/HCO3 (imagine

prelucrat din ,,Mollecular Cell Biology", H.Lodish et al.)

La nivelul capilarelor pulmonare, procesul este invers. CO2 difuzeaz din eritrocite, scderea concentraiei citosolice a CO2 determin activarea anhidrazei carbonice care

35

catalizeaz reacia de la dreapta la stnga, n sensul formrii CO2 i OH . Prin legarea

oxigenului la hemoglobin, este eliberat protonul, care formeaz cu OH molecula de ap. Scderea concentraiei intracelulare a HCO3

datorit activitii anhidrazei carbonice determin ptrunderea HCO3

n celul, la schimb cu Cl . Dac schimbul anionic prin proteina AE1 nu ar avea loc, HCO3

s-ar acumula n eritrocite i ar genera mult CO2, modificnd pH-ul citosolic eritrocitar, care devine alcalin. Aproximativ 80% din CO2 din snge este transportat prin mecanismul de generare al bicarbonatului n eritrocite. Sistemul antiport Cl /HCO3

permite transportul unor mari volume de CO2 de la esuturi spre plmni, schimbul HCO3

cu Cl menine pH-ul citosolic neutru. n reglarea pH-ului celular, un rol esenial au proteinele cotransportor Na+HCO3

/Cl

i antiportul Na+/H+. Metabolismul anaerob al glucozei produce acid lactic, iar metabolismul aerob produce mari cantiti de CO2, care este hidratat de anhidraza carbonic la acid carbonic. Acest acid slab disociaz, crescnd concentraia intracelular de protoni, pH-ul celular devine acid, afectnd metabolismul celulelor. Proteina antiport Na+HCO3

/Cl import un ion de sodiu n sensul gradientului su de concentraie, mpreun cu ionul bicarbonat i export la schimb un ion de clor mpotriva gradientului de concentraie. HCO3

importat se combin cu protonii, genernd CO2, care difuzeaz din celule. Antiportul Na+/H+ import un ion de sodiu n sensul gradientului de concentraie i export la schimb un proton. Aceste sisteme de export de protoni sunt activate de scderea pH-ului intracelular, care stimuleaz antiportul Cl/HCO3

, determin intensificarea importului de HCO3 i

normalizarea pH-ului citosolic la valori de 7,4. Meninerea pH-ului fiziologic creeaz condiiile desfurrii normale a proceselor de sintez de ADN, ARN, de biosintez a proteinelor (creterea i diviziunea celular) i activitatea enzimelor implicate n desfurarea altor ci metabolice celulare.

3.2.3. Transportul macromoleculelor i particulelor prin membrana celular

Transportul proteinelor, polinucleotidelor, polizaharidelor i particulelor prin membrana celular se desfoar prin mecanisme de transport mediate de vezicule. Transportul mediat de vezicule cuprinde: 1.Exocitoza prin care molecule sintetizate n celul sunt secretate n spaiul extracelular 2.Endocitoza prin care are loc transportul n celul al unor molecule sau particule din fluidul interstiial 3.Fagocitoza care reprezint ingerarea de ctre celule specializate a unor particule de ordinul micrometrilor: bacterii, debriuri celulare 4.Transcitoza este procesul prin care moleculele sau particulele ptrunse n celul prin endocitoz strbat spaiul celular fiind exportate din nou printr-o alt regiune membranar dect cea prin care au ptruns. Caracterele comune ale acestor tipuri de transport mediat de vezicule sunt: sechestrarea moleculelor sau particulelor n vezicule, transportul strict direcionat, procesele de fuziune ale veziculelor cu membrane.

36

1.Exocitoza este procesul pe care se bazeaz secreia celular a componenilor structurali membranari i extracelulari i a unor proteine solubile cum sunt moleculele-semnal (hormonii, neurotransmitorii), enzimele. Proteinele de export sunt sintetizate n ribozomii ataai reticulului enpoplasmic rugos, sunt procesate i sortate n aparatul Golgi, de unde se desprind veziculele care conin proteinele de secreie, vezicule care traverseaz spaiul celular, fuzioneaz cu membrana celular i deverseaz coninutul n spaiul extracelular. Componentele lipidice i proteice ale membranelor veziculelor sunt ncorporate n membrana celular i apoi recuperate prin endocitoz i reutilizate la nivelul aparatului Golgi, de unde se desprind noi vezicule. Exocitoza este de dou tipuri: Ca2+ dependent non-constitutiv i Ca2+ independent constitutiv. Exocitoza la nivelul sinapselor chimice neuronale este un exemplu de exocitoz Ca2+ dependent i are ca finalitate semnalizarea interneuronal. Exocitoza constitutiv este caracteristic tuturor celulelor i are ca finalitate eliberarea componenilor matricii extracelulare i a proteinelor structurale de membran care vor fi ncorporate n membrana plasmatic dup fuziunea veziculelor cu aceasta. Transportul intracelular al veziculelor de exocitoz implic activitatea proteinelor-motor asociate citoscheletului actinic i tubulinic. Urmeaz captarea veziculelor de ctre membrana-int cu care va avea loc fuziunea. Captarea implic legturi care limiteaz mobilitatea veziculelor, dar nu sunt foarte rigide i au o lungime >25 nm. Ancorarea veziculelor la membrana plasmatic se realizeaz prin interaciunea stabil a celor dou membrane, la distana de 5-10nm, care implic rearanjri moleculare i apariia unor structuri ncolcite extinse. O alt etap este condiionarea care ns este caracteristic doar exocitozelor Ca2+ dependente neconstitutive, este etapa care include modificrile moleculare ale proteinelor ATP-dependente i ale lipidelor, astfel nct infuzia de ioni de calciu s declaneze secreia, de exemplu a neurotransmitorilor. Fuziunea membranei plasmatice cu membrana veziculelor este mediat de proteinele SNARE, fiind finalizat fie prin eliberarea coninutului veziculei (enzime, hormoni, neurotransmitori, toxine) n spaiul extracelular, fie de ncorporarea unor componente ale membranei veziculare (proteine, lipide) n membrana int (de exemplu membrana celular). Ultimul proces e important pentru meninerea compoziiei/dimensiunilor membranei celulare, sau dimpotriv, pentru schimbarea rapid a acestora ca rspuns la semnale exterioare. Mai mult, n acest fel se asigur modificarea suprafeei membranei n timpul creterii celulei. Proteinele SNARE (,,Soluble NSF Attachment Protein Receptors") mediaz fuziunea veziculelor cu membrana plasmatic sau cu membranele lizosomale. Proteinele v-SNARE sunt localizate n membranele veziculelor, iar t-SNARE sunt localizate n membranele-int. Cele mai bine studiate sunt cele implicate n fuziunea veziculelor sinaptice cu membrana presinaptic, fiind inta neurotoxinelor bacteriene care produc tetanosul i botulismul. Domeniul citoplasmic al acestor proteine, motivul SNARE alctuit din 60-70 de aminoacizi este capabil de asamblare reversibil n complexe strnse alctuite din teancuri de cte 4 -helixuri, denumite complexe trans- SNARE. Moleculele proteice implicate n formarea complexelor de fuziune sunt: sintaxina1 (1 -helix) i SNAP-25 (2 -helixuri) din membrana celular i sinaptobrevina (1 -helix) din membrana vezicular. Complexul trans-SNARE este format din proteine SNARE ancorate n membrane ,,trans" aflate n opoziie nainte de fuziune. Dup unirea membranelor, proteinele SNARE formeaz un complex ,,cis" fiind localizate n membrana unic, rezultat n urma fuziunii. Influxul de calciu completeaz

37

fuziunea, prin interaciunea senzorului pentru calciu denumit sinaptotagmin cu lipidele membranare i complexul trans-SNARE. Energia eliberat n cursul asamblrii complexului SNARE este utilizat pentru a contracara forele de respingere dintre membrane.

Figura 18. Complex de fuziune ntre membrana veziculei de exocitoz i membrana-int (imagine prelucrat dup autorul Danko Dimchev Georgiev, M.D.)

2.Endocitoza este un proces de importan vital pentru celule, intervenind n preluarea nutrienilor din mediul extracelular, n adeziunea i migrarea celular, semnalizarea celular prin receptori, neurotransmisia, prezentarea antigenelor, polaritatea celular, diviziunea, creterea i diferenierea celular i importul unor medicamente n celule. n funcie de mecanism, se cunosc mai multe tipuri de endocitoz: a.endocitoz mediat de receptor, un mecanism de transport specific, deoarece receptorul membranar recunoate i leag macromolecule care intr n celul sub form de complex receptor-ligand. Implic existena unor regiuni specializate ale membranei celulare, care au aspectul unor depresiuni i pe a cror fa citoplasmic se afl o reea proteic. Componentul major al acestei reele proteice este clatrina, alctuit din ase lanuri polipeptidice care formeaz o structur caracteristic de stea cu 3 brae (,,triskelion"). Prin asamblarea moleculelor de clatrin se formeaz o reea polihedral care d veziculelor de endocitoz aspectul de vezicule ,,mbrcate". Dup formarea veziculelor, reeaua polihedral se destram, clatrina i celelalte proteine ale reelei sunt reciclate, ajungnd din nou n membran formnd noi regiuni specializate pentru endocitoz. Depresiunile membranare ,,mbrcate" pot concentra i internaliza numeroase tipuri de molecule deoarece conin receptori responsabili pentru endocitoza mediat a acestor liganzi, cum sunt: LDLcolesterolul, transferina, factori de cretere, anticorpi, etc. Endocitoza mediat de receptor are loc i prin vezicule de endocitoz fr nveli de clatrin. Regiunile specializate ale membranei fr clatrin dein o protein denumit caveolin care leag colesterolul i au un bistrat lipidic bogat n colesterol i glicolipide. Sunt abundente n celulele musculaturii netede, pneumocite, fibroblaste, adipocite i celule endoteliale, au form tipic de grot, de unde i denumirea lor.

38

Figura 19. Mecanismul endocitozei mediate de receptor prin vezicule ,,mbrcate de clatrin. Proteinele adaptor AP leag membrana plasmatic prin situsuri fosfatidilinozitol (4,5)bifosfat, recunosc i leag o secven de aminoacizi hidrofobi din molecula receptorilor. Clatrina stabilizeaz interaciunea AP cu membrana plasmatic i activeaz prin fosforilare o subunitate a AP, ceea ce permite recunoaterea i legarea receptorilor. (imagine preluat din: http://www.abcam.com)

b. Pinocitoza sau endocitoza de faz fluid este un proces constitutiv, comun tuturor celulelor, prin care ptrund n celule molecule n soluie, procesul fiind direct proporional cu concentraia moleculelor n fluidul extracelular. Veziculele de pinocitoz fuzioneaz cu alte vezicule: endosomi i lizosomi. Calea endocitozei const din compartimente distincte care internalizeaz molecule i le recicleaz spre membrana plasmatic (endosomii timpurii i endosomii de reciclare) sau le sorteaz spre a fi degradate (endosomii trzii i lizozomii). Endosomii timpurii sunt localizai la periferia celulei i recepioneaz veziculele internalizate din membrana celular. Au structur tubulo-vezicular i pH acid, datorit pompelor de H+ din structura membranelor lor. Sunt organite de sortare n care receptorii disociaz de liganzi n mediu acid, receptorii fiind reciclai n membrana celular via tubulii endosomali, sau de sortare spre calea transcitozei i spre endosomii trzii. Endosomii trzii preiau particule sau molecule de la endosomii timpurii ai cii endocitozei, de la reeaua trans-Golgi n calea biosintetic sau de la fagosomi n calea fagocitozei, reprezentnd ultima etap n procesul de sortare nainte de a ceda coninutul lizosomilor. Lizosomii sunt ultimul compartiment al cii de endocitoz, fiind principalul compartiment hidrolitic al celulei cu un pH acid (4,8) i coninut ridicat de enzime hidrolitice.

39

Figura 20. Calea endocitozei: EV- vezicul de endocitoz, EE- endosom timpuriu, de sortare

(,,early endosome), LE- endosom trziu (,,late endosome), PA- preautofagosom, EA-autofagosom

timpuriu, autofagosom trziu, LY-lizosom, G-reeaua transGolgi. (imagine prelucrat din

http://www.cell-research.com)

3. Fagocitoza este un proces de aprare fa de substane strine, microorganisme, celule mbtrnite sau tumorale, resturi celulare, etc. caracteristic unor celule specializate: monocitele care se difereniaz n esuturi n macrofage i neutrofilele. Procesul de fagocitoz este influenat de compoziia chimic i proprietile suprafeei particulei ingerate i se desfoar n urmtoarele etape: a. legarea particulei de fagocit prin receptorii membranari ai fagocitului care recunosc i leag specific liganzii de pe suprafaa particulei-int. De exemplu, fagocitarea bacteriilor este precedat de opsonizarea lor (acoperirea cu anticorpi i/sau componente ale complementului). Regiunea FC a anticorpului este expus spre exterior fiind recunoscut i legat de receptorii FC din membrana fagocitului. Formarea complexului receptor- ligand FC declaneaz semnalul intracelular pentru internalizarea bacteriei. b. internalizarea bacteriei prin emiterea pseudopodelor care nchid particula ntr-o vezicul care se numete fagosom. Acesta fuzioneaz cu vezicule din compartimentul lizosomal formnd fagolizosomul unde se desfoar aciunea enzimelor hidrolitice i a enzimelor care catalizeaz reacii din care rezult substane toxice: peroxid de hidrogen, anion supe