BIOLOGIA VIRUSURILOR. BIOLOGIA VIRUSURILOR. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL

VIROZELOR.VIROZELOR.Particularităţile virusurilorParticularităţile virusurilor1.1. Reprezintă structuri acelulare cu potenţial Reprezintă structuri acelulare cu potenţial

infecţiosinfecţios2.2. Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm)Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm)3.3. Genomul viral este constituit dintr-un Genomul viral este constituit dintr-un

singur tip de AN (ADN sau ARN)singur tip de AN (ADN sau ARN)4.4. Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind

paraziţi obligaţi intracelulariparaziţi obligaţi intracelulari5.5. Nu cresc şi nu se divid, se reproducNu cresc şi nu se divid, se reproduc în în

celule vii celule vii 6.6. Nu cNu cultivultivă pe medii artificiale, numai pe ă pe medii artificiale, numai pe

celule viicelule vii7.7. Rezistenţă naturală la antibioticeRezistenţă naturală la antibiotice

CLASIFICAREA VIRUSURILORCLASIFICAREA VIRUSURILORDupă tipul AN (După tipul AN (cu genom ARN/ADN)cu genom ARN/ADN)După dimensiuniDupă dimensiuni (mici – 20-50 nm, medii (mici – 20-50 nm, medii

– 50-150 nm, mari – peste 150 nm)– 50-150 nm, mari – peste 150 nm)După tipul de simetrie a capsideiDupă tipul de simetrie a capsidei

(helicoidală, cubică, mixtă)(helicoidală, cubică, mixtă)DupDupăă compozitia chimic compozitia chimicăă (simple, (simple,

complexe)complexe) DDupă gazdăupă gazdă (om, animal, insectă, (om, animal, insectă,

bacterie)bacterie)După sensibilitatea în mediul externDupă sensibilitatea în mediul extern, ,

substansubstanţe chimice, etcţe chimice, etc

OrderOrder ( (-virales-virales) ) Family (Family (-viridae-viridae) ) Subfamily (Subfamily (-virinae-virinae) ) Genus (Genus (-virus-virus) ) Species (Species (-virus-virus) )

Virusuri ADNVirusuri ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae, : Parvoviridae, Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, PoxviridaeAdenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae

Virusuri ARN+:Virusuri ARN+: Picornaviridae, Caliciviridae, Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, RetroviridaeRetroviridae

Virusuri ARN-Virusuri ARN- : Rhabdoviridae, : Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, FiloviridaeBunyaviridae, Arenaviridae, Filoviridae

Virusuri ARNd.cVirusuri ARNd.c. : Reoviridae. : Reoviridae

VirionVirion – unitate structurală infecţioasă a virusului – unitate structurală infecţioasă a virusului

ViroidViroid – ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante – ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante

PrionPrion – proteină termostabilă infecţioasă, – proteină termostabilă infecţioasă, cauzează la om boala cauzează la om boala Kuru, Creutzfeldt-JacobKuru, Creutzfeldt-Jacob, , sindromul sindromul Gerstmann-StrausslerGerstmann-Straussler, , scrapiescrapie la oi la oi

COMPOZIŢIA CHIMICĂ ŞI COMPOZIŢIA CHIMICĂ ŞI STRUCTURA VIRIONULUISTRUCTURA VIRIONULUI

Virusurile simpleVirusurile simple – – acid nucleicacid nucleic ((ANAN)) şi înveliş proteic – şi înveliş proteic – capsidacapsida ((ansamblu numit ansamblu numit nucleocapsidănucleocapsidă))

Virusurile complexeVirusurile complexe – – nucleocapsidănucleocapsidă şi un înveliş şi un înveliş extern, lipoglicoproteic extern, lipoglicoproteic ((supercapsidă, peplossupercapsidă, peplos))

AAcidul cidul NNucleicucleic – ADN sau ARN, – ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, linmono- sau bicatenar, liniiar, circular ar, circular sau fragmentat.sau fragmentat.

ARN monocatenar : ARN monocatenar : ARN+ARN+ (catenă cu (catenă cu sens, sens, funcfuncţţie de ie de ARNm) sau ARNm) sau ARN- ARN- (catenă fără sens)(catenă fără sens)

Funcţia ANFuncţia AN – asigurarea replicării şi – asigurarea replicării şi expresia genomului pentru sinteza expresia genomului pentru sinteza proteinelor viraleproteinelor virale

• • I: Double-stranded DNA (e.g. I: Double-stranded DNA (e.g. AdenovirusesAdenoviruses, , HerpesvirusesHerpesviruses, , PoxvirusesPoxviruses))

• • II: Single-stranded (+) sense DNA (e.g. II: Single-stranded (+) sense DNA (e.g. ParvovirusesParvoviruses))

• • III: Double-stranded RNA (e.g. III: Double-stranded RNA (e.g. ReovirusesReoviruses)) • • IV: Single-stranded (+) sense RNA (e.g. IV: Single-stranded (+) sense RNA (e.g.

PicornavirusesPicornaviruses, , TogavirusesTogaviruses)) • • V: Single-stranded (-) sense RNA (e.g. V: Single-stranded (-) sense RNA (e.g.

OrthomyxovirusesOrthomyxoviruses, , RhabdovirusesRhabdoviruses)) • • VI: Single-stranded (+) sense RNA with VI: Single-stranded (+) sense RNA with

DNA intermediate in life-cycle (e.g. DNA intermediate in life-cycle (e.g. RetrovirusesRetroviruses))

• • VII: Double-stranded DNA with RNA VII: Double-stranded DNA with RNA intermediate (e.g. intermediate (e.g. HepadnavirusesHepadnaviruses))

CapsidaCapsida – formată din unităţi proteice, – formată din unităţi proteice, capsomerecapsomere, aranjate simetric., aranjate simetric.

1.1. Simetrie helicoidalăSimetrie helicoidală – capsomerele se – capsomerele se fixează pe catena de AN, formă de bastonaşfixează pe catena de AN, formă de bastonaş

2.2. Simetrie cubicăSimetrie cubică (icosaedrică) – (icosaedrică) – capsomerele se aranjează în jurul AN, capsomerele se aranjează în jurul AN, formând un icosaedru (poliedru regulat cu 20 formând un icosaedru (poliedru regulat cu 20 feţe triunghiulare şi 12 vârfuri),feţe triunghiulare şi 12 vârfuri), eikos eikos=20=20

3.3. Simetrie mixtăSimetrie mixtă (bacteriofagii, poxvirusurile) (bacteriofagii, poxvirusurile)

FuncţiaFuncţia capsideicapsidei– protecţia AN, rol antigenic, – protecţia AN, rol antigenic, adeziuneadeziune

SupercapsidaSupercapsida – structură glucido-lipido-– structură glucido-lipido-proteică, derivată din membrana proteică, derivată din membrana celulei gazdă. Lipidele provin din membrana celulei gazdă. Lipidele provin din membrana celulară, iar glicoproteinele sunt de origine celulară, iar glicoproteinele sunt de origine virală (ex.: hemaglutinina, neuraminidaza)virală (ex.: hemaglutinina, neuraminidaza)

FuncţieFuncţie – protecţie, antigene de suprafaţă, – protecţie, antigene de suprafaţă, adeziuneadeziune

Unele virusuri conţin Unele virusuri conţin enzimeenzime – polimeraze, – polimeraze, transcriptaze, etc. transcriptaze, etc.

Acţiunea factorilor fizici, chimiciAcţiunea factorilor fizici, chimici

Virusurile sunt foarte sensibile la căldură, Virusurile sunt foarte sensibile la căldură, desicare, raze UV. Detergenţii şi solvenţii desicare, raze UV. Detergenţii şi solvenţii inactivează virusurile cu supercapsidă. inactivează virusurile cu supercapsidă.

Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80°°CC

REPRODUCEREA VIRUSURILORREPRODUCEREA VIRUSURILOR

I ADSORBŢIAI ADSORBŢIA virusului la celula-gazdă prin virusului la celula-gazdă prin intermediul receptorilor specifici (tropism)intermediul receptorilor specifici (tropism)

II PENETRAREAII PENETRAREA virusului în celulă virusului în celulă

a)a) Pinocitoză (viropexis) Pinocitoză (viropexis)

b)b) Fuziunea membranelorFuziunea membranelor

c)c) TranslocareTranslocare

d)d) Injectarea AN în citoplasmă (bacteriofagiInjectarea AN în citoplasmă (bacteriofagiii))

III DECAPSIDAREAIII DECAPSIDAREA ( cu enzime celulare). Din ( cu enzime celulare). Din acest moment urmează acest moment urmează faza de eclipsăfaza de eclipsă..

IV BIOSINTEZAIV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor şi replicarea AN) (sinteza proteinelor şi replicarea AN)

Are loc în citoplasmă (virusuri cu ARN) sau în nucleul Are loc în citoplasmă (virusuri cu ARN) sau în nucleul celulei (virusuri cu ADN)celulei (virusuri cu ADN)

Biosinteza virusurilor ADNBiosinteza virusurilor ADN

ADNdcADNdc transcrierea ARNm transcrierea ARNm replicareareplicarea,, translaţia (precoce, tardivă)translaţia (precoce, tardivă) sinteza proteică sinteza proteică

Biosinteza virusurilor ARNBiosinteza virusurilor ARN

ARN+ARN+ replicarereplicare,, translaţie translaţie sinteza proteicăsinteza proteică

ARN-ARN- transcriere ARNm transcriere ARNm replicarereplicare,, translaţietranslaţie sinteza proteică sinteza proteică Retrovirusuri Retrovirusuri (ARN+)(ARN+) transcriere ADN- transcriere ADN- ADNdc transcriere ARNm replicare, ADNdc transcriere ARNm replicare, translaţie, sinteza pr. (sau integrare în cromosom)translaţie, sinteza pr. (sau integrare în cromosom)

RNA VIRUSES THAT DO NOT HAVE A DNA PHASE

Genome

RNA-dependent RNA

polymerase (=transcriptase)

in virion

Infectivity of RNA

Initial event in cell

RNA + No Infectious Translation

RNA - Yes Non-infectious Transcription

RNAd.c. Yes Non-infectious Transcription

RETROVIRUSES

Genome

RNA-dependent RNA polymerase

(=transcriptase) in virion

Infectivity of RNA

Initial event in cell

RNA + YesNon-infectious

Reverse transcription

V. MORFOGENEZAV. MORFOGENEZA (asamblarea) şi (asamblarea) şi maturizarea maturizarea virionilorvirionilor

Proteinele capsidale participă la formarea Proteinele capsidale participă la formarea nucleocapsidei (în nucleu sau citoplasmă) iar nucleocapsidei (în nucleu sau citoplasmă) iar glicoproteinele sunt inserate în MCP, substituind glicoproteinele sunt inserate în MCP, substituind proteinele celulare. În această fază apar proteinele celulare. În această fază apar incluziunile virale sau corpusculii elementari.incluziunile virale sau corpusculii elementari.

VI. ELIBERAREA virionilorVI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, înmugurire, (liza celulei, înmugurire, exocitoză). Nr lor poate atinge 100.000 exocitoză). Nr lor poate atinge 100.000 per/celulăper/celulă

Ciclul reproductiv viral are durata variabilă – de la Ciclul reproductiv viral are durata variabilă – de la câteva ore până la câteva zile (ex.: 8h – câteva ore până la câteva zile (ex.: 8h – poliovirus, 72h – citomegalovirus).poliovirus, 72h – citomegalovirus).

Interferenţa viralăInterferenţa virală – fenomen în care, – fenomen în care, consecutiv infecţiei unei celule cu 2 virusuri, consecutiv infecţiei unei celule cu 2 virusuri, multiplicarea unuia este inhibată (virus multiplicarea unuia este inhibată (virus interferat / virus interferent)interferat / virus interferent)

RELAŢII VIRUS-CELULA GAZDĂRELAŢII VIRUS-CELULA GAZDĂ Infecţie virală productivă, citocidăInfecţie virală productivă, citocidăVirusul este infecţios iar celula permisivă Virusul este infecţios iar celula permisivă

(receptivă). La nivelul ma/o corespunde (receptivă). La nivelul ma/o corespunde infecţiilor acute, aparente sau inaparente infecţiilor acute, aparente sau inaparente (gripă, rujeolă ...)(gripă, rujeolă ...)

Infecţii virale persistenteInfecţii virale persistente Celulele infectate supravieţuiesc, cu producerea Celulele infectate supravieţuiesc, cu producerea

permanentă sau intermitentă a virusului.permanentă sau intermitentă a virusului.1. 1. Infecţii abortive (Infecţii abortive (cu virioni defectivi) – cu virioni defectivi) –

infecţia nu se exprimă, are loc transformarea infecţia nu se exprimă, are loc transformarea celulelor prin proteine virale. Ele devin ţintă celulelor prin proteine virale. Ele devin ţintă pentru efectorii imunităţii (macrofage, T-pentru efectorii imunităţii (macrofage, T-limfocite) în cursul unor infecţii cronice (PESS limfocite) în cursul unor infecţii cronice (PESS post-rujeolică)post-rujeolică)

2. 2. Infecţii integrateInfecţii integrate (virusuri ADN sau copii (virusuri ADN sau copii de de ADN ale Retrovirusurilor). Consecinţe:ADN ale Retrovirusurilor). Consecinţe:

- Transformarea malignăTransformarea malignă a celulei gazdă a celulei gazdă - IInfecţii lentenfecţii lente - - mmanifestarea infecţiei după o anifestarea infecţiei după o

perioadă de incubaţie îndelungată cu expresia perioadă de incubaţie îndelungată cu expresia integrală a genomului viral (ex.: HIV-SIDA) integrală a genomului viral (ex.: HIV-SIDA)

- IInfecţii latentenfecţii latente - r- reactivări ocazionale, repetate eactivări ocazionale, repetate ale infecţiei cu exprimarea integrală a ale infecţiei cu exprimarea integrală a informaţiei genetice virale (ex.: infecţia informaţiei genetice virale (ex.: infecţia herpetică) herpetică)

- Infecţii croniceInfecţii cronice – perioade de remisie şi – perioade de remisie şi acutizare, virusul este prezent permanent, acutizare, virusul este prezent permanent, chiar în absenţa simptomelor (ex.: hepatita chiar în absenţa simptomelor (ex.: hepatita virală B)virală B)

CULTIVAREA VIRUSURILORCULTIVAREA VIRUSURILOR

Virusurile sunt cultivate pentru:Virusurile sunt cultivate pentru:- Stabilirea diagnosticului etiologicStabilirea diagnosticului etiologic- Testarea infecţiozităţii virusurilorTestarea infecţiozităţii virusurilor- Testarea preparatelor antiviraleTestarea preparatelor antivirale- Producerea vaccinurilorProducerea vaccinurilorSISTEME DE CULTIVARESISTEME DE CULTIVARE1.1. Culturi de celuleCulturi de celule2.2. Ou embrionat de găinăOu embrionat de găină3.3. Animale de laboratorAnimale de laborator

Animalele de laboratorAnimalele de laborator se utilizează se utilizează limitat (receptivitate selectivă, limitat (receptivitate selectivă, preexistenţa infecţiilor, cost avansat). Se preexistenţa infecţiilor, cost avansat). Se recurge numai când nu există alte recurge numai când nu există alte posibilităţi (VHB, HIV, Coxsackie, etc). posibilităţi (VHB, HIV, Coxsackie, etc). Constituie modele de cercetare sau de Constituie modele de cercetare sau de control al vaccinurilor. Animalele utilizate control al vaccinurilor. Animalele utilizate curent – şoriceii albi nou-născuţi, dar pot curent – şoriceii albi nou-născuţi, dar pot fi utilizaţi şobolani, cobai, maimuţe, etc. fi utilizaţi şobolani, cobai, maimuţe, etc.

Regulile de lucru cu animalele de laborator Regulile de lucru cu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt (selectare, inoculare, examinare) sunt identice cu cele din infecţiile bacteriene. identice cu cele din infecţiile bacteriene.

Oul embrionat de găinăOul embrionat de găină (5-13 zile) reprezintă (5-13 zile) reprezintă un mediu de celule nediferenţiate, cu un mediu de celule nediferenţiate, cu multiplicare activă, steril şi lipsit de mijloace multiplicare activă, steril şi lipsit de mijloace de apărare antiinfecţioasă. Se utilizează în de apărare antiinfecţioasă. Se utilizează în prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)

- Iniţial se verifică viabilitatea embrionului la - Iniţial se verifică viabilitatea embrionului la ovoscop în camera obscură. ovoscop în camera obscură.

- Prelevatul se inoculează steril cu seringa în Prelevatul se inoculează steril cu seringa în cavitatea amniotică sau alantoideană, sau pe cavitatea amniotică sau alantoideană, sau pe membrana chorioalantoideană (utilizând membrana chorioalantoideană (utilizând metoda deschisă sau închisă). metoda deschisă sau închisă).

- Orificiul se parafinează şi se incubează la 35-Orificiul se parafinează şi se incubează la 35-3737°°C timp de 48-72 ore C timp de 48-72 ore

Culturile de celuleCulturile de celule (1949 - Enders, Weller, Robbins). (1949 - Enders, Weller, Robbins). Celule provenite din ţesuturi adulte sau embrionare, Celule provenite din ţesuturi adulte sau embrionare,

normale sau tumoralenormale sau tumorale.. PPlasate într-un mediu adecvat lasate într-un mediu adecvat (nutrienţi, pH, t) rămân viabile şi se multiplică. Pentru (nutrienţi, pH, t) rămân viabile şi se multiplică. Pentru cultivarea virusurilor se utilizează culturile în monostrat cultivarea virusurilor se utilizează culturile în monostrat celular.celular.

Tipurile de culturi de celuleTipurile de culturi de celule (CC) (CC):: Culturi primareCulturi primare (primar tripsinizate). Sunt obţinute din (primar tripsinizate). Sunt obţinute din

ţesuturi adulte sau embrionare de origine animală sau ţesuturi adulte sau embrionare de origine animală sau umană. Suportă 4-6 pasaje (subcultivări)umană. Suportă 4-6 pasaje (subcultivări)

Culturi diploideCulturi diploide. Obţinute din ţesut embrionar (MRS5, . Obţinute din ţesut embrionar (MRS5, fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaţii fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaţii

Linii continui de celuleLinii continui de celule. Obţinute din ţesut tumoral. . Obţinute din ţesut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat.Pot fi subcultivate nelimitat.

HeLaHeLa – carcinom de col uterin – carcinom de col uterinKBKB – tumoare a rinofaringelui – tumoare a rinofaringeluiHep-2Hep-2 – tumoare canceroasă a laringelui – tumoare canceroasă a laringelui

Obţinera culturilor de celule primar tripsinizateObţinera culturilor de celule primar tripsinizate::- Prelevarea ţesutului (ex.: rinichi de maimuţă)Prelevarea ţesutului (ex.: rinichi de maimuţă)- Fragmentarea şi spălarea cu solFragmentarea şi spălarea cu sol.. fiziologică fiziologică- Dezagregarea tisulară cu enzime proteoliticeDezagregarea tisulară cu enzime proteolitice

(tripsina)(tripsina)- Separarea celulelor prin centrifugareSepararea celulelor prin centrifugare- Dozarea suspensiei Dozarea suspensiei - - 101055 – 10 – 106 6 celule/ml celule/ml - Întroducerea celulelor în mediu nutritiv şi Întroducerea celulelor în mediu nutritiv şi

repartizarea în recipiente sterilerepartizarea în recipiente sterile- Incubarea până la formarea monostratului celular Incubarea până la formarea monostratului celular

(inhibiţie de contact)(inhibiţie de contact)- Monostratul poate fi infectat cu virus sau serveşte Monostratul poate fi infectat cu virus sau serveşte

drept sursă de celule pentru o nouă cultivare (pasaj)drept sursă de celule pentru o nouă cultivare (pasaj)

Mediile de culturăMediile de cultură pentru culturi de celule pentru culturi de celule ((Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbuminălactalbumină, etc), conţin AA, Vit, factori , etc), conţin AA, Vit, factori de creştere, săruri minerale, roşu fenol de creştere, săruri minerale, roşu fenol pentru monitorizarea pH (virează în galben pentru monitorizarea pH (virează în galben în mediu acid)în mediu acid)

1.1. Mediile de creştereMediile de creştere (pentru cultivarea CC) (pentru cultivarea CC) sunt îmbogăţite cu ser sangvin (uman, sunt îmbogăţite cu ser sangvin (uman, animal) animal)

2.2. Mediile de întreţinereMediile de întreţinere se utilizează pentru se utilizează pentru menţinerea monostratului în procesul menţinerea monostratului în procesul reproducerii virale. Nu conţin ser. reproducerii virale. Nu conţin ser.

CC reprezintă sistemul virus-gazdă predilect în CC reprezintă sistemul virus-gazdă predilect în virologia clinică şi cercetare.virologia clinică şi cercetare.

Inocularea CCInocularea CC - Se aleg tuburi cu monostrat bine Se aleg tuburi cu monostrat bine

formatformat- Se înlătură mediul de creştere, se Se înlătură mediul de creştere, se

spală cu sol. Hanks spală cu sol. Hanks - Se inoculează 0,1 – 0,2 ml de prelevatSe inoculează 0,1 – 0,2 ml de prelevat- Peste 30-60 min în tuburi se toarnă Peste 30-60 min în tuburi se toarnă

câte câte

1 ml mediu de întreţinere1 ml mediu de întreţinere- Se întroduc în termostat la Se întroduc în termostat la

temperatura adecvată 3 - 4 zile temperatura adecvată 3 - 4 zile

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL VIROAL VIROZZELORELOR

IndicaţiiIndicaţii: : - Boli cu măsuri terapeutice sau profilactice Boli cu măsuri terapeutice sau profilactice

speciale (SIDA, hepatite, rubeola, etc)speciale (SIDA, hepatite, rubeola, etc)- Elucidarea etiologiei virale a unor izbucniri Elucidarea etiologiei virale a unor izbucniri

epidemice (meningite, gastro-enterite, epidemice (meningite, gastro-enterite, pneumonii, etc)pneumonii, etc)

- Supravegherea epidemiologicăSupravegherea epidemiologică

PrelevatePrelevate: LCR, sânge, exsudate, secreţii : LCR, sânge, exsudate, secreţii nazale, rino-faringiene, mase fecale, urină, nazale, rino-faringiene, mase fecale, urină, conţinutul veziculelor şi ulceraţiilor cutaneo-conţinutul veziculelor şi ulceraţiilor cutaneo-mucoase, bioptate, etc.mucoase, bioptate, etc.

EficacitateaEficacitatea diagnosticului este diagnosticului este condiţionată de:condiţionată de:

1.1. Alegerea corectă a prelevatelor, Alegerea corectă a prelevatelor, calitatea lor şi transportarea în calitatea lor şi transportarea în laboratorlaborator

2.2. Examinarea precoce (la debutul bolii)Examinarea precoce (la debutul bolii)

3.3. Transportarea rapidă a probelor sau Transportarea rapidă a probelor sau utilizarea mediului de transport utilizarea mediului de transport

4.4. Respectarea regulilor de autoprotecţie Respectarea regulilor de autoprotecţie şi de protecţie a anturajului la şi de protecţie a anturajului la recoltarea, transportarea şi recoltarea, transportarea şi examinarea probelorexaminarea probelor

METODELE DE DIAGNOSTIC AL METODELE DE DIAGNOSTIC AL VIROZELORVIROZELOR

METODE DIRECTEMETODE DIRECTE- Examenul virusoscopicExamenul virusoscopic (evidenţierea (evidenţierea

directă a virionului sau a componentelor lui în directă a virionului sau a componentelor lui în prelevate)prelevate)

- Examenul virusologicExamenul virusologic (izolarea şi (izolarea şi identificarea virusului)identificarea virusului)

- Detectarea Ag virale în prelevatDetectarea Ag virale în prelevat- Identificarea genomului viralIdentificarea genomului viral (hibridizarea (hibridizarea

AN, amplificarea genică – PCR)AN, amplificarea genică – PCR)METODE INDIRECTEMETODE INDIRECTE- - SerodiagnosticulSerodiagnosticul (creşterea de cel puţin 4 (creşterea de cel puţin 4

ori a titrului Ac în dinamică)ori a titrului Ac în dinamică)

EXAMENUL VIRUSOSCOPICEXAMENUL VIRUSOSCOPIC

1.1. Microscopia opticăMicroscopia optică – depistarea în – depistarea în prelevat a incluziunilor virale specifice prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii Guarnieri în variolă, Babeş-(corpusculii Guarnieri în variolă, Babeş-Negri în rabie) sau nespecifice, Negri în rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau nucleare. Se prepară citoplasmatice sau nucleare. Se prepară frotiuri sau frotiuri-amprente colorate frotiuri sau frotiuri-amprente colorate RRomanovschiomanovschi-G-Giemsaiemsa sau cu fluorocrom sau cu fluorocrom

2.2. Microscopia electronicăMicroscopia electronică3.3. IImunoelectronomicroscopia munoelectronomicroscopia – mai – mai

sensibilă, mai specifică. Se examinează sensibilă, mai specifică. Se examinează complexele imune virus – Accomplexele imune virus – Ac

4.4. Imunofluorescenţa Imunofluorescenţa (directă şi indirectă) (directă şi indirectă) – utilizată în diagnosticul rapid al virozelor – utilizată în diagnosticul rapid al virozelor

EXAMENUL VIRUSOLOGICEXAMENUL VIRUSOLOGIC

Prelucrarea prealabilă a prelevatelor:Prelucrarea prealabilă a prelevatelor:- Omogenizarea (după necesitate) Omogenizarea (după necesitate) - Înlăturarea elementelor celulare, inclusiv Înlăturarea elementelor celulare, inclusiv

bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare)bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare)- Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea

creşterii bacteriilor şi fungilor creşterii bacteriilor şi fungilor contaminanţi (penicilină - 500 UA/ml, contaminanţi (penicilină - 500 UA/ml, streptomicină – streptomicină –

500 UA/ml, nistatină - 20 UA/ml)500 UA/ml, nistatină - 20 UA/ml)

ETAPELE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGICETAPELE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC1.1. Izolarea virusuluiIzolarea virusului2.2. Evidenţierea (indicarea) reproducerii Evidenţierea (indicarea) reproducerii

viralevirale3.3. Identificarea virusuluiIdentificarea virusuluiIzolarea virusuluiIzolarea virusului se realizează prin se realizează prin

inocularea cu material de examinat a inocularea cu material de examinat a animalelor de laborator, embrionilor de animalelor de laborator, embrionilor de găină sau a culturilor de celule. Alegerea găină sau a culturilor de celule. Alegerea sistemului de cultivare se efectuează în sistemului de cultivare se efectuează în funcţie de particularităţile biologice ale funcţie de particularităţile biologice ale agentului etiologic probabil şi posibilităţile agentului etiologic probabil şi posibilităţile laboratorului.laboratorului.

Indicarea virusuluiIndicarea virusului

În culturi de celuleÎn culturi de celule

1.1. ECPECP – modificări degenerative şi – modificări degenerative şi distrugere celularădistrugere celulară,, rezultat al rezultat al multiplicării virale (rotunjire sau multiplicării virale (rotunjire sau retracţie celulară, citoliză, apariţia retracţie celulară, citoliză, apariţia vacuolelor sau granulelor în citoplasmă, vacuolelor sau granulelor în citoplasmă, picnoza nucleului, fuziunea picnoza nucleului, fuziunea membranelor, etcmembranelor, etc)). ECP poate fi studia. ECP poate fi studiatt la microscopul optic pe celule la microscopul optic pe celule necolorate sau colorate cu hematoxilin-necolorate sau colorate cu hematoxilin-eozină, Giemsa, fluorocrom. eozină, Giemsa, fluorocrom.

2. Formarea plajelor2. Formarea plajelor Reprezintă focare de celule alterate în Reprezintă focare de celule alterate în

monostratul celular acoperit cu agar. monostratul celular acoperit cu agar. Numărarea plajelor permite cuantificarea Numărarea plajelor permite cuantificarea virusului infectant.virusului infectant.

3. Incluziuni virale3. Incluziuni virale

Reprezintă acumulări paracristaline Reprezintă acumulări paracristaline de virioni sau de componente virale de virioni sau de componente virale în aria de replicare şi asamblare a în aria de replicare şi asamblare a virusurilor (citoplasmă, nucleu). virusurilor (citoplasmă, nucleu). Coloraţia Giemsa, hem-eozină, Coloraţia Giemsa, hem-eozină, fluorocrom. Localizarea, forma şi fluorocrom. Localizarea, forma şi afinitatea tinctorială (bazofile, afinitatea tinctorială (bazofile, acidofile) sunt particularităţi acidofile) sunt particularităţi diagnostice pentru unele viroze.diagnostice pentru unele viroze.

4. 4. Hemaglutinarea (Reacţia de HA)Hemaglutinarea (Reacţia de HA)Unele virusuri posedă în componenţa capsidei, în Unele virusuri posedă în componenţa capsidei, în

special special a a supercapsidei, glicoproteine care pot supercapsidei, glicoproteine care pot adera la suprafaţa hematiilor – adera la suprafaţa hematiilor – hemaglutinine hemaglutinine ((HAHA))..

RHA este caracteristicRHA este caracteristică pentru virusurile ă pentru virusurile cu HA cu HA acumulate în mediul de întreţinere. În acest caz acumulate în mediul de întreţinere. În acest caz mediul de întreţinere aglutinează eritrocitele mediul de întreţinere aglutinează eritrocitele unor specii de mamifere sau păsări.unor specii de mamifere sau păsări.

5. Hemadsorbţia (Reacţia de HAd)5. Hemadsorbţia (Reacţia de HAd) RHAd este RHAd este caracteristică virusurilor caracteristică virusurilor cu HA cu HA în poziţie în poziţie intracelulară. În procesul asamblării acestor intracelulară. În procesul asamblării acestor virusuri, HA lor se află deja înserate în MCP la virusuri, HA lor se află deja înserate în MCP la nivelul viitorului mugure. Dacă la această etapă nivelul viitorului mugure. Dacă la această etapă în recipientul cu monostrat celular se adaugă în recipientul cu monostrat celular se adaugă suspensie de hematii şi se menţine 15-20 min la suspensie de hematii şi se menţine 15-20 min la t caracteristică fiecărui virus, la microscop pot fi t caracteristică fiecărui virus, la microscop pot fi urmărite hematiile fixate la suprafaţa celulelor urmărite hematiile fixate la suprafaţa celulelor infectate (RHAd).infectate (RHAd).

6. 6. Proba culoriiProba culorii- - Metabolismul cMetabolismul celulelularar neafectatneafectat – virajul – virajul

culorii mediului din roşu în galben (pH culorii mediului din roşu în galben (pH acid)acid)

- Metabolismul celular inhibat – culoarea Metabolismul celular inhibat – culoarea mediului nu se modificămediului nu se modifică

7. Interferenţa7. Interferenţa Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar

determină fenomenul de interferenţă. determină fenomenul de interferenţă. Pentru detectarea V.rubeolei se Pentru detectarea V.rubeolei se infectează CC cu virus citopatogen. Lipsa infectează CC cu virus citopatogen. Lipsa multiplicării acestui virus confirmă multiplicării acestui virus confirmă prezenţa V.rubeolic prezenţa V.rubeolic

Indicarea virusului în oul Indicarea virusului în oul embrionat de găinăembrionat de găină

Ouăle se răcesc 18 ore la +4 grade C Ouăle se răcesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstricţie maximă, apoi pentru o vazoconstricţie maximă, apoi aseptic se taie coaja, se recolteazăaseptic se taie coaja, se recoltează lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA şi embrionul se întroduc în cutii Petri şi embrionul se întroduc în cutii Petri sterile. Se observă:sterile. Se observă:

1.1. Moartea embrionuluiMoartea embrionului2.2. Apariţia modificărilor (hemoragii, Apariţia modificărilor (hemoragii,

pustule) pe MCApustule) pe MCA3.3. Acumularea de HA în lichideAcumularea de HA în lichide

Indicarea virusului pe animale de Indicarea virusului pe animale de laboratorlaborator

1.1. Boala manifestă a animalului, decesBoala manifestă a animalului, deces

2.2. Urmărirea virusului în organele-ţintă:Urmărirea virusului în organele-ţintă:- HemaglutinareHemaglutinare- Infecţiozitatea omogenatelorInfecţiozitatea omogenatelor- Examene histopatologice (leziuni Examene histopatologice (leziuni

inflamatorii, degenerare, incluzii inflamatorii, degenerare, incluzii virale specifice: corp. Babeş-Negri în virale specifice: corp. Babeş-Negri în neuronii infectaţi cu V.rabic, etc)neuronii infectaţi cu V.rabic, etc)

Identificarea virusurilorIdentificarea virusurilor

Determinarea Determinarea genului, genului, specieispeciei şi serotipului şi serotipului de virus prin stabilirea structurii antigenice. de virus prin stabilirea structurii antigenice.

Se efectuează cu ajutorul serurilor Se efectuează cu ajutorul serurilor imune imune specifice antivirale în diferite reacţii specifice antivirale în diferite reacţii serologice:serologice:

- RNRN- RIHA/RIHAdRIHA/RIHAd- RFCRFC- RIFRIF- RIE (ELISA)RIE (ELISA) - ARI, etcARI, etc

DETECTAREA AG VIRALE ÎN DETECTAREA AG VIRALE ÎN PRELEVATEPRELEVATE

AvantajeAvantaje: simplitatea şi rapiditatea : simplitatea şi rapiditatea examenului, nu necesită menţinerea examenului, nu necesită menţinerea infecţiozităţii virusuluiinfecţiozităţii virusului

DezavantajeDezavantaje: sensibilitate direct : sensibilitate direct proporţională cu cantitatea virusului din proporţională cu cantitatea virusului din prelevatprelevat

Se utilizează Ac policlonali de origine Se utilizează Ac policlonali de origine umană (seruri imune) sau Ac monoclonali umană (seruri imune) sau Ac monoclonali (de origine murină)(de origine murină)

Reacţii: Reacţii: RHAI, RLA, RIF, RIE (ELISA), RHAI, RLA, RIF, RIE (ELISA), Western-blot, ARIWestern-blot, ARI, etc., etc.

IDENTIFICAREA GENOMULUI VIRALIDENTIFICAREA GENOMULUI VIRAL (punerea în evidenţă a AN virali din (punerea în evidenţă a AN virali din

prelevate în cursul infecţiilor virale prelevate în cursul infecţiilor virale acute sau cronice şi monitorizarea acute sau cronice şi monitorizarea tratamentului).tratamentului).

Pot fi examinate toate ţesuturile şi Pot fi examinate toate ţesuturile şi lichidele biologice.lichidele biologice.

Hibridizarea acizilor nucleici fără Hibridizarea acizilor nucleici fără amplificareamplificare

Hibridizarea după amplificare (PCR Hibridizarea după amplificare (PCR şi variantele ei)şi variantele ei)

DIAGNOSTICUL SEROLOGICDIAGNOSTICUL SEROLOGIC

EsenţaEsenţa: depistarea Ac sintetizaţi de : depistarea Ac sintetizaţi de gazdă în răspuns la o infecţie virală.gazdă în răspuns la o infecţie virală.

După o După o primo-infecţieprimo-infecţie are loc inducerea are loc inducerea formării Ac, iar după o formării Ac, iar după o reinfecţiereinfecţie sau sau reactivare titrul Ac creşte în dinamică. reactivare titrul Ac creşte în dinamică.

În serodiagnosticul virozelor este În serodiagnosticul virozelor este obligator de a examina obligator de a examina 2 probe de ser2 probe de ser de la bolnav de la bolnav (seruri-perechi)(seruri-perechi): prima : prima prelevată la debutul bolii, aprelevată la debutul bolii, a doua doua prelevată peste 15 zile. prelevată peste 15 zile.

Ac sunt depistaţi în ser, uneori în LCR, exudate, Ac sunt depistaţi în ser, uneori în LCR, exudate, lichid articular, etc. lichid articular, etc.

Pentru depistarea Ac se utilizează Ag virale de Pentru depistarea Ac se utilizează Ag virale de referinţă (suspensie virală inactivată, proteine referinţă (suspensie virală inactivată, proteine virale native sau recombinante, oligopeptide virale native sau recombinante, oligopeptide sintetice).sintetice).

Tehnici utilizate: Tehnici utilizate: RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI, RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI, ARI, AIE (ELISA),ARI, AIE (ELISA), etc. etc.

Semnificaţie diagnosticăSemnificaţie diagnostică prezintă prezintă trecerea trecerea titrului de Ac de la 0 la pozitivtitrului de Ac de la 0 la pozitiv (seroconversie, primo-infecţie) sau (seroconversie, primo-infecţie) sau creşterea creşterea titrului Ac de cel puţin 4 orititrului Ac de cel puţin 4 ori în cursul în cursul infecţiei. Ambele seruri vor fi testate în infecţiei. Ambele seruri vor fi testate în aceeaşi zi, prin tehnici identice şi în acelaşi aceeaşi zi, prin tehnici identice şi în acelaşi laborator. laborator.

TERAPIA ANTIVIRALĂTERAPIA ANTIVIRALĂDificultăţiDificultăţi::- Toxicitate (imposibil de a distruge virusul fără Toxicitate (imposibil de a distruge virusul fără

afectarea celulei!)afectarea celulei!)- Apariţia mutantelor rezistenteApariţia mutantelor rezistente- Activitate asupra virusului în fază de Activitate asupra virusului în fază de

multiplicare multiplicare - Costul avansat al tratamentuluiCostul avansat al tratamentuluiPrimele preparate antivirale – anticanceroase.Primele preparate antivirale – anticanceroase.Preparatele antivirale contemporanePreparatele antivirale contemporane::- Nu manifestă activitate virucidă, doar inhibă - Nu manifestă activitate virucidă, doar inhibă

reproducerea viralăreproducerea virală- Sunt dirijate contra etapelor reproducerii virale Sunt dirijate contra etapelor reproducerii virale

Adeziunea virusului la celulăAdeziunea virusului la celulăMecanismul – blocarea receptorilor celulari (HIV-Mecanismul – blocarea receptorilor celulari (HIV-

oligopeptidul T, care reproduce oligopeptidul T, care reproduce gp120; CD4gp120; CD4 solubili)solubili)

Dificultăţi: afinitate redusă, degradare rapidăDificultăţi: afinitate redusă, degradare rapidă Fuziunea, penetrareaFuziunea, penetrareaReprezintă peptide sintetice (Reprezintă peptide sintetice (pentafuzida-T20, pentafuzida-T20,

T1249T1249) blochează fuziunea virusului HIV cu ) blochează fuziunea virusului HIV cu membrana celulară (dificultate – injecţii s/c membrana celulară (dificultate – injecţii s/c zilnice)zilnice)

DecapsidareaDecapsidareaAmantadina, rimantadinaAmantadina, rimantadina inhibă decapsidarea inhibă decapsidarea

virusului gripal Avirusului gripal AUtilizare limitată – dezvoltarea rezistenţeiUtilizare limitată – dezvoltarea rezistenţei

ReplicareaReplicareaMecanismul – blochează activitatea enzimelor virale Mecanismul – blochează activitatea enzimelor virale

de reproducere (transcriptaze, polimeraze, de reproducere (transcriptaze, polimeraze, replicaze)replicaze)

Avantaj – nu influenţează componentele celulei-Avantaj – nu influenţează componentele celulei-gazdăgazdă

1.1. Analogi nucleozidiciAnalogi nucleozidiciSe disting de nucleozidele naturale prin modificarea Se disting de nucleozidele naturale prin modificarea

componentului glucidic sau a bazei purinice sau componentului glucidic sau a bazei purinice sau pirimidinice. Blochează elongarea catenei de ADN pirimidinice. Blochează elongarea catenei de ADN în curs de formare. în curs de formare.

- Antiherpetice (Antiherpetice (aciclovir, ganciclovir, penciclovir, aciclovir, ganciclovir, penciclovir, idoxuridinidoxuridin))

- Anti-HIV (Anti-HIV (zidovudin, didanozin, zalcitabin, zidovudin, didanozin, zalcitabin, stavudin, lamivudinstavudin, lamivudin, etc), etc)

- Anti-HBV (Anti-HBV (entecavir, LdT, LdCentecavir, LdT, LdC – fază de cercetare) – fază de cercetare)

2. 2. Analogi nucleotidiciAnalogi nucleotidici - Cidofovir Cidofovir - CMV, HSV - CMV, HSV - Adefovir Adefovir - HIV, HBV, HSV, CMV - HIV, HBV, HSV, CMV - TenofovirTenofovir – HIV, HBV – HIV, HBV

3. 3. Analog al pirofosfatuluiAnalog al pirofosfatului - FoscarnetFoscarnet – HSV, CMV (HIV, HBV -?) – HSV, CMV (HIV, HBV -?)

4. 4. Inhibitori nenucleozidici ai RT Inhibitori nenucleozidici ai RT HIVHIV ( (nevirapin, delavirin, efavirenznevirapin, delavirin, efavirenz))

Blocarea activităţii polimerazelor virale Blocarea activităţii polimerazelor virale se realizează prin:se realizează prin:

1.1. Competiţie cu substratul natural al Competiţie cu substratul natural al enzimeienzimei

2.2. Îngrămădirea sterică a centrului Îngrămădirea sterică a centrului activ al enzimei activ al enzimei

3.3. Incorporarea în catena de ADN în Incorporarea în catena de ADN în curs de sintezăcurs de sinteză

4.4. Blocarea procesului de elongare a Blocarea procesului de elongare a catenei de ADN prin incapacitatea catenei de ADN prin incapacitatea de a fixa un alt nucleozid pe de a fixa un alt nucleozid pe analogul său artificialanalogul său artificial

Asamblarea, eliberareaAsamblarea, eliberarea- Inhibitori ai proteazei HIVInhibitori ai proteazei HIV

((sanquinavir, ritonavir, indinavir, sanquinavir, ritonavir, indinavir, amprenavir, lopinaviramprenavir, lopinavir, , nelfinavirnelfinavir, , etc) – toxicitate, rezistenţăetc) – toxicitate, rezistenţă

- Inhibitori ai neuraminidazeiInhibitori ai neuraminidazei virusurilor gripale (virusurilor gripale (zanamivir, zanamivir, oseltamiviroseltamivir). Activă contra gripei ). Activă contra gripei A şi B (efect preventiv, curativ, A şi B (efect preventiv, curativ, rezistenţă rară)rezistenţă rară)

INTERFERONII (IFN)INTERFERONII (IFN) IFN – ansamblu de proteine capabile să IFN – ansamblu de proteine capabile să

confere celulelor o stare de rezistenţă la confere celulelor o stare de rezistenţă la o infecţie virală.o infecţie virală.

IFN tip 1IFN tip 1 (clasic, (clasic, antiviralantiviral):):1.1. IFN-alfa (leucocitar)IFN-alfa (leucocitar)2.2. IFN-beta (fibroblastic) IFN-beta (fibroblastic) InductoriInductori ai IFN 1 ai IFN 1: virusuri, LPS, ARN : virusuri, LPS, ARN

bicatenarbicatenarIFN-gamma, tip 2IFN-gamma, tip 2, , imunimun, produs de LT , produs de LT

activate, NK. Manifestă activitate activate, NK. Manifestă activitate imunomodulatoareimunomodulatoare

- IFN acţionează asupra ciclului de replicare virală IFN acţionează asupra ciclului de replicare virală prin intermediul celulei: interacţiunea IFN-alfa cu prin intermediul celulei: interacţiunea IFN-alfa cu receptorul său induce sau stimulează expresia unor receptorul său induce sau stimulează expresia unor gene celulare, rezultând o activitate antivirală gene celulare, rezultând o activitate antivirală (blocarea translaţiei ARNm viral, degradarea ARNm (blocarea translaţiei ARNm viral, degradarea ARNm viral). Este posibilă şi blocarea asamblării şi viral). Este posibilă şi blocarea asamblării şi înmuguririi virusului (HIV)înmuguririi virusului (HIV)

- IFN măresc expresia moleculelor clasa I a CMH, iar IFN măresc expresia moleculelor clasa I a CMH, iar IFN-gamma şi a celor de clasa II IFN-gamma şi a celor de clasa II

- IFN măresc activitatea macrofagelor şi manifestă IFN măresc activitatea macrofagelor şi manifestă activitate antiproliferativăactivitate antiproliferativă

- IFN-gamma activează celulele NK IFN-gamma activează celulele NK

Utilizarea terapeuticăUtilizarea terapeutică a IFN– a IFN– hepatite B şi C hepatite B şi C cronice, infecţii herpetice, sarcomul Kaposi, cronice, infecţii herpetice, sarcomul Kaposi, limfome, leucemiilimfome, leucemii

Alte citokine (TNF-a, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) sunt la Alte citokine (TNF-a, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) sunt la etapa de testare in vitro.etapa de testare in vitro.

TERAPIA CELULARĂ (CMV, EBV)TERAPIA CELULARĂ (CMV, EBV)Fondată pe administrarea CTL Fondată pe administrarea CTL

(limfocite Tc) autologe.(limfocite Tc) autologe.- Prelevarea sângelui de la bolnavPrelevarea sângelui de la bolnav- Izolarea CTL specificeIzolarea CTL specifice- Clonarea şi proliferarea CTL in vitroClonarea şi proliferarea CTL in vitro- Reinjectarea la pacient Reinjectarea la pacient VIITOR: fototerapia, imunizarea VIITOR: fototerapia, imunizarea

intracelulară (introducerea unei gene intracelulară (introducerea unei gene ce codifică un anticorp antiviral)ce codifică un anticorp antiviral)