CAPITOLUL I

1

ILEANA STOICA TATIANA VASSU ELENA SSRMAN

BIOLOGIA I TAXONOMIA MOLECULAR

A MICROORGANISMELOR

COLECIA DE CULTURI MICROBIENEIlustraie: Oana Iftime

Ileana Stoica

Coperta: Oana Iftime

Redactor: Oana Iftime

Ileana Stoica

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei

STOICA, ILEANA

Biologia i taxonomia molecular a microorganismelor:

Colecia de culturi microbiene / Ileana Stoica, Tatiana Vassu-Dimov,

Elena Ssrman Bucureti: Arvin Press, 2002

p. ; cm.

ISBN 973-96090-3-8

I. Vassu-Dimov, Tatiana

II. Ssrman, Elena

579.8Partea a treia. Biologia i taxonomia drojdiilor

Capitolul X

Biologia i taxonomia drojdiilorDrojdiile sunt un grup de fungi cu o diversitate filogenetic deosebit, ale cror forme teleomorfe sau stri sexuate sunt prezente la nivelul a dou clase taxonomice majore, Ascomycotina i Basidiomycotina.

Speciile anamorfe, care prezint numai nmulire asexuat, au fost iniial grupate n fungii imperfeci.

De asemenea, termenul de drojdie este considerat, n prezent, unul de convenien, aceste organisme, a cror diviziune mitotic (pe cale vegetativ) se realizeaz prin nmugurire sau prin fisiune binar, fiind formele unicelulare ale fungilor filamentoi.

Taxonomia sau sistematica unui organism cuprinde trei pri importante i anume:

clasificarea aranjarea organismelor n grupe taxonomice pe baz de similaritate;

identificarea compararea caracterelor organismelor neidentificate cu indivizi deja caracterizai i clasificai i

nomenclatura atribuirea unor nume taxonilor identificai, parametrii valabili i n cazul drojdiilor n definirea unui taxon.

Microbiologii au studiat taxonomia drojdiilor de mai bine de un secol, dar nc mai sunt destule de realizat pentru a stabili un sistem de clasificare complet.

O identificare corect este absolut necesar pentru tratamentul eficient al infeciilor, pentru nelegerea interaciunii dintre specii n natur i pentru selectarea celor mai potrivite tulpini pentru industria fermentativ i alimentar.

Un sistem de clasificare acurat presupune stabilirea interrelaiilor filogenetice, ce se bazeaz pe similariti biochimice i genetice, incluznd diferite ci metabolice i mecanismele de control ale acestor ci.

Un astfel de sistem filogenetic de clasificare prezint un interes particular pentru biotehnologi, care trebuie s combine diferite proprieti metabolice i, dac aceste proprieti aparin unor specii strns nrudite, ansa de a se exprima ntr-un singur organism este mai mare.

De exemplu, n cazul fuziunii de protoplati, produii de fuziune au o mai mare stabilitate dac parentalii aparin unor specii strns nrudite. n cazul aplicrii tehnologiei ADN recombinant pentru introducerea anumitor caracteristici metabolice, ADN-ul heterolog inserat se exprim mult mai bine ntr-o gazd strns nrudit cu specia donor.

Scopul acestui capitol este de a prezenta principalele metode de clasificare, identificare i nomenclatur a drojdiilor, inclusiv a tehnicilor de taxonomie molecular, care permit o ncadrare taxonomic mai corect a diferitelor genuri i specii.

Tabelele 10.1, 10.2 i 10.3 prezint caracteristicile claselor n care se ncadreaz drojdiile.

Tabelul 10.1. Genurile clasei Ascomycotina i caracteristicile lorGenulAspectulAlte trsturi

asc ascosporicelule vegetative

AmbrosiozymaSferic sau oval1-4/asc cu form de plrienmugurire multipl, pseudohife, hife adevrate cu septe adevrateFermenteaz slab zaharurile; izolate de pe insecte

ArthroascusProvine din celule hifale dilatateSferici sau aproape sferici ; 1-4/ascnmugurire multipolar, pseudo-hife; hife adevrate cu septe, avnd un singur microporNu fermenteaz zaharurile; izolate din sol; materiale vegetale

ArxiozymmaSferic sau oval; provine din celule vegetativeSferici sau ovali; 1-2/ascnmugurire multipolar; pseu-dohife; nu formeaz hife adevrateFermenteaz zaharurile; izolate iniial de la psri de curte

CiteromycesSfericSferici; 1-2/ascnmugurie multipolar; nu formeaz hife sau pseudohifeFermenteaz intens unele zaharuri; izolate din concentrate de fructe

ClavisporaSferic sau alungitClavai; 1-2/ascnmugurire multipolar; pseudohife; nu au hife adevrateFermenteaz zaharurile; izolat iniial din surse umane i animale

CoccidiascusAlungit cu form de bananAu form de fus; peste 8 per ascnmugurire multipolar; nu formeaz hife sau pseudohifeIzolate de la Drosophila

CyniclomycesAlungitAlungii, 1-4/ascnmugurire multipolar; pseudohife, dar nu hife adevrateFermentaia slab a zaharurilor; izolate din stomacul i fecalele de iepure

Debaryomyces Sferic sau elipsoidan general sferic cu suprafaa ondulat, 1-4/ascnmugurire multipolar, ocazional pseudohife, fr hife adevrate

DekkeraSferic sau alungit Cu form de plrie sau sferic, 1-4/ ascnmugurire multipolar, pseudohife, fr hife adevrateFermenteaz zaharurile, proces care este stimulat de oxigenare; izolate din bere i vin ca specii contaminante.

GuilliermondellaAlungitSferici, ovali sau reniformi 1-4/ ascnmugurire predominant lng polii celulei; formeaz pseudohife i hife adevrateFermenteaz glucoza; izolate din reziduri taninice.

HanseniasporaOval sau alungit Cu form de plrie, 1-4 per ascCelule nmgurite au form de lmie; formeaz pseudohife dar nu hife adevrateFermenteaz zaharurile; izolate din sol, fructe i alte materiale vegetale i din surse clinice

IssatcheriaOval sau alungit Sferici i uor ondulai pe margine, 1-4 per ascnmugurire multipolar, pseudohife, fr hife adevrateFermenteaz zaharurile; izolate din sol, fructe, vin, Drosophila, ap marin i surse clinice

KluyveromycesSferic sau alungitSferici sau reniformi, 1-c.1oo/ascnmugurire multipolar, pot forma pseudohife, dar nu i hife adevrateFermenteaz zaharurile; izolate din sol, ap, fructe i alte materiale vegetale, Drosophila, surse clinice

LipomycesElipsoidal sau alungitSferici sau alungii, de culoare brun, 1-c.3o/ascnmugurire multipolar, pot forma pseudohife, dar nu i hife adevrateNu fermenteaz zaharurile; izolate din sol, formeaz colonii mucoide

LodderomycesSferic sau alungitOblongi cu capete netede, 1-2per ascnmugurire multipolar, formeaz pseudohife dar nu i hife adevrateFermenteaz zaharurile; izolate din sol i suc de portocale; utilili-zeaz n-alkani

MetschnicowiaSferic sau elipsoidalAlungii, 1-2 per ascnmugurire multipolar; pseudohife; nu formeaz hifeFermenteaz zaharurile; izolate din ap marin, ape curgtoare, de pe flori, nevertrebate i Drosophila

NadsoniaAlungitSferici; 1-2 per ascnmugurire bipolar; nu formeaz nici pseudohife nici hife adevrateFermenteaz zaharurile; izolate din sol i materiale vegetale

NematosporaAlungitAlungii cu form de fus, cu un apendice terminal asemntor unui biciInmugurire multipolar; fsormeaz pseudohife i hife adevrateFermenteaz zaharurile; determin boli la alunele de pmnt, capsulele de bumbac, fasole

PachysolenHemisfercHemisferici; 1-4 per ascnmugurire multipolar; pseudo-hife; nu formeaz hife adevrateFermenteaz zaharurile, inclusiv xiloza; izolate din reziduri taninice

PachytichospoaElipsoidalSferici sau elipsoidalinmugurire multipolar; pseudo-hife rudimentare; nu formeaz hifeFermenteaz zaharurile; izolate din sol i din cecumul animal

PichiaSferic sau elipsoidalSferici sau cu form de plrie, 1-4 per ascnmugurire multipolar; unele specii formeaz pseudohife sau hife adevrate, cu un singur micropor septalUnele specii fermenteaz zaharurile; izolate din sol, fructe, alte materiale vegetale insecte, surse clinice

SaccharomycesSferic sau elipsoidalSferici sau elipsoidali, 1-4 per ascnmugurire multipo-lar, pseudohife, nu formeaz hife adevrateFermenteaz viguros zaharurile; izolate din sol, fructe, alimente, bere, vin foarte rar din surse clinice

SaccharomycodesElipsoidal sau alungitSferici, 1-4 per ascnmugurire bipolar, formeaz pseudohife, dar nu hife adevrateFermenteaz zaharurile; izolate din produse vegetale

SaccharomycopsisSferic sau elipsoidalSferici, elipsoidali sau n form de plrie, 1-4 /ascnmugurire multipolar, formeaz pseudohife i hife adevrate cu septe avnd plasmodeseFermenteaz slab zaharurile; izolate de pe fructe, polen, material lemnos, insecte, alimente bogate n amidon

SchizosaccharomycesAlungitSferici sau elipsoidali; 4-8 per ascDiviziune celular prin fisiune binar; se pot forma hife adevrate Fermenteaz viguros glucidele izolate din sucuri, fructe, vin, substraturi bogate n zaharuri

SchwanniomycesSferic sau elipsoidalSferici cu un inel ecuatorial distinct; 1-2/ascnmugurire multipolar ; formeaz ocazinal pseudohife, nu hife adevrateFermenteaz zaharurile; izolate din sol

SporopachydermiaSferic sau alungitSferici sau elipsoidali, 1-4/ascnmugurire multipolar, formeaz ocazional pseudohife dar nu hife adevrateNu fermenteaz zaharurile, produc mirosuri puternice; izolate din ape marine, curgtoare, reziduale, surse clinice

StephanoascusSfericIniial cu form de plrie,iar la maturitate devin hemisferici,

1-4/ascnmugurire multipolar, formeaz pseudohife i hife adevrateNu fermenteaz zaharurile; izolate din sol, surse animale i umane

TorulasporaSferic sau elipsoidalSferici, 1-4/ascnmugurire multipolar; pseudohife, nu formeaz hife adevrateNu fermenteaz zaharurile; izolate din sol, fructe, sucuri de fructe, buturi alcoolice, alimente bogate n zaharuri sau sare, surse clinice sau animale

WaltomycesElipsoidal sau alungitSferici sau alungii; pigmentai n brun;1-20/ascnmugurire multipolar; nu formeaz pseudohife sau hife adevrateNu fermenteaz zaharurile; formeaz colonii mucoide; izolate din sol

WickerhamiellaSfericOblongi, n general 1/ascnmugurire multipolar, nu formeaz pseudohife i hife adevrateNu fermenteaz zaharurile; izolat din vin i melas

WilliopsisSferic sau elipsoidalSferici sau elipsoidali, cu un inel ecuatorial; 1-4/ascnmugurire multipolar, pseudohife, nu formeaz hife adevrateFermenteaz zaharurile; izolate din sol, ape, material vegetal

WingeaSfericAu form lenticular; de culoare brun deschis, 1-4/ascnmugurire multipolar; nu formeaz hife i pseudohifeNu fermenteaz zaharurile; izolate din sol i materiale vegetale

YarrowiaSferic sau elipsoidalSferici sau n form de plrie;

1-4/ascnmugurire multipolar; formeaz pseudohife i hife adevrate cu un singur por centralNu fermenteaz zaharurile; izolate din sol, ape reziduale, materiale bogate n lipide i proteine, surse clinice i animale

ZygoascusSferic sau elipsoidalHemisferici sau cu form de plrie; 1-4/ascnmugurire multipolar; formeaz pseudohife sau hife adevrate, cu un singur micropor septalFermenteaz zaharurile; izolate din must, reziduri industriale organice

ZygosaccharomicesFormat prin conjugarea a dou celule, fiecare cuprinznd 1 sau mai muli ascosporiSferici sau elipsoidali, 1-4/ascnmugurire multipolar, pseudohife, nu formeaz hife adevrateFermenteaz zaharurile; izolate din vin, alimente, fructe, material vegetal, Drosophila

Tabelul 10.2. Genurile clasei Basidiomycotina i caracteristicile lor

GenulAspectul

starea sexualcelulele vegetativeAlte trsturi

ChionosphaeraConjugarea celulelor nmugurite de tip opus de mperechere uninucleate determin formarea unor hife dicariotice care formeaz un mic corp de fructificaie; basidia de pe corpul de fructificaie poart basidiospori care se reproduc prin nmugurireCelule nmugurite i ocazional pseudohife; hife adevrate se formeaz numai ca parte a ciclului sexuatCu excepia prezenei corpului de fructificaie acest gen pare s aib un ciclu de via similar cu Filobasidiella; nu formeaz teleospori i pigmeni; izolate de pe suprafaa frunzelor moarte

FilobasidiellaCelulele nmugurite de tip opus de mperechere se unesc pentru a forma hife dicariotice; din hife se formeaz basidii neseptate, care produc basidiospori aranjai n lanuri de cte patru; au fost identificate i tulpini homotalice cu autofertilizare Celule nmugurite; nu se formeaz pseudohifeStarea teleomorf a lui Cryptococcus neoformans; nu formeaz teleospori i pigmeni; izolate din sol i excremente de porumbel

FilobasidiumCelulele nmugurite de tip opus de mperechere fuzioneaz pentru a forma hife dicariotice din care se formeaz basidii cu basidiospori terminali; sunt prezente i tulpini homotaliceCelule nmugurite, pseudohife i hife adevrateUnele specii fermenteaz zaharurile; nu formeaz pigmeni i teleospori; izolate din buturi alcoolice, alimente fermentate i surse clinice

LeucosporidiumCelulele nmugurite de tip opus de mperechere conjug pentru a forma hife dicariotice care dau natere la teleospori; teleosporii germineaz pentru a forma basdii septate i neseptate care formeaz basidiospori; prezint i tulpini homotaliceCelule nmugurite; unele tulpini formeaz hife i pseudohife nainte de conjugareMajoritatea speciilor fermenteaz zaharurile; izolate din ape marine i solul Antarcticii

RodosporidiumSimilar cu LeucosporidiumCelule nmugurite, pseudohife i hife adevrate formate de unele specii nainte de conjugareNu fermenteaz zaharurile; culturile sunt de culoare galben stins, portocaliu sau roie datorit prezenei pigmenilor carotenoizi; izolate din ape marine i curgtoare, sol, plante i surse clinice

SporidiobolusCiclul de sexuat este n mare msur similar cu cel de la LeucosporidiumCelule nmugurite, pseudohife i hife adevrate formate de unele specii nainte de conjugare; formeaz ca i anamorful su Sporobolomyces, ballistosporiNu fermenteaz zaharurile; culturile sunt de culoare roz sau roie; izolate din sol, ape, aer, surse clinice i de pe frunze

SterigmatosporidiumSe formeaz hife dicariotice care poart teleospori,care germineaz pentru a forma basidii neseptate, ce dau natere la basidiospori; prezint i tulpini homotaliceMugurii se formeaz la nivelul unor extensii celulare denumite sterigme; se formeaz i pseudohife i hife adevrateNu fermenteaz zaharurile; izolate de pe pasta de celuloz

Tabelul 10.3. Drojdiile imperfecte (anamorfe ) i caracteristicile lor

GenulAspectul

celulele vegetativeteleomorfii asociaiAlte trsturi

AciculoconidiumCelule ovale sau elipsoidale nmugurite i conidii aciculare; se formeaz hife adevrate Ascomicete pe baza testului DBB (diazonim blue B) negativFermenteaz slab zaharurile; izolate de la Drosophila

Brettanomycesnmugurire multipolar, celule frecvent ogivale la un capt, se formeaz pseudohife dar nu hife adevrate Genul DekkeraVezi genul Dekkera din tabelul 10.1

BulleraCelule nmugurite, pseudohife i hife adevrate; formeaz balistosporiBazidimicete pe baza testului DBB pozitiv i prezena balistosporilorNu fermenteaz zaharurile; nu au pigmeni carotenoizi; izolate din aer, debriuri vegetale

Candidanmugurire multipolar, pseudohife i hife adevrateMulte genuri de ascomicete i cteva genuri de bazidiomiceteCaracteristicile sunt cele ale partenerilor teleomorfi

CryptococcusCelule nmugurite i ocazional pseudohifeTestul DBB pozitiv indic specii de bazidiomiceteNu fermenteaz zaharurile; inozitolul reprezint sursa de carbon; izolate din aer, ap, alimente, materiale vegetale, insecte, animale, om

Feniellamugurire bipolar i ocazional pseudohife rudimentareTestul DBB negativ indic un teleomorf ascomicet Fermenteaz zaharurile; izolate din bere; acest gen este neobinuit, deoarece prezint nmugurire bipolar, dar n acelai timp o serie de caracteristici ale genului Brettanomyces, incluznd producerea de acid acetic i un timp scurt de via n cultur

Fellomycesnmuguririre din vrful sterigmelor cu un punct de septare adiacent mugurelui; celulele mam au n general cteva sterigme; formeaz pseudohife i hife adevrateCreterea vegetativ este similar cu cea de la Strigmatosporidim, gen ce reprezint starea teleomorfNu fermenteaz zaharurile; izolate din aer, ap marin, brnzeturi, insecte, animale, om

KloeckeraCelule n form de lmie, cu nmugurire bipolar; pot s formeze psudohife, dar nu hife adevratePartenerul teleomorf este HanseniasporaVezi genul Hanseniaspora n tabelul 10.1

MalasseziaCelule cu nmugurire unipolar; forneaz hife adevrate Pe baza testului DBB bazidiomiceteIzolate de pe piele, de la om i animale

Oosporidiumnmugurire multipolar; se pot forma pseudohifePe baza testului DBB ascomiceteNu fermenteaz zaharurile; sunt prezeni pigmeni non-carotenoizi roz sau orange; izolate din materiale vegetale

PhaffaCelule nmugurite; clamidospori; pseudohife rudimentareTestul DBB pozitiv indic specii de bazidiomiceteFermentaia slab a zaharurilor; culturile sunt de culoare roie darorit acumulrii pigmenilor carotenoizi

Rhodotorulanmugurire multipolar; formeaz pseudohife i hife adevrate Starea sexual este reprezentat de RhodosporidiumNu fermenteaz zaharurile; culturi de culoare roie, oranj sau galben; izolate din aer, ap, sol, materiale vegelale, insecte, animale, om

SarcinosporonCelulele nmugurite care se separ sau rmn legate n agregate de tipul celor formate de SarcinaTestul DBB pozitiv indic specii de bazidiomiceteNu fermenteaz zaharurile; izolate din leziuni ale pielii

Schizoblastosporiumnmugurire bipolar; pseudohifele sunt rudimentare sau absente, nu formeaz hife adevrateTestul DBB negativ indic specii de ascomiceteNu fermenteaz zaharurile; izolate din sol i coninut stomacal

SporobolomycesCelule nmugurite; unele tulpini formeaz pseudohife sau hife adevrate; formeaz balistosporiPartenerul teleomorf este SporodiobolusNu fermenteaz zaharurile; culturile sunt roz sau roii, datorit pigmenilor carotenoizi; izolate din sol, ap, aer, frunze, surse clinice

Sterigmatomycesnmugurire din vrful sterigmelor; nu formeaz pseudohife sau hife adevrate Testul DBB pozitiv indic specii de basidiomicete Nu fernenteaz zaharurile; izolate din aer, ap de mare, surse clinice

SympodiomycesCelule nmugurite; unele celule formeaz conidiofori care produc conidii terminale; eliberarea succesiv a conidiilor determin formarea unui patern de cicatrici de tip simpodial; se formeaz i hife adevrate Testul DBB negativ indic asocirea cu ascomiceteleNu fermenteaz zaharurile; izolate din ap marin

TrichosporonCelule nmugurite i artrospori care se formeaz printr-un proces de fuziune; sunt prezente pseudohife i hife adevrate; se pot forma i endospori asexuaiAsocierea unor specii de basidiomicete i a altora cu ascomicetePot s realizeze sau nu fermentarea zaharurilor; izolate din ap, aer, sol, alimente, material vegetal, de la om i animale

Trigonopsisnmugurire multipolar cu celule elipsoidale sau triunghiulare; nu se formeaz pseudohife sau hife adevrateTestul DBB negativ indic asocierea cu ascomiceteleNu fermenteaz zaharurile; din bere i must

X.1. Metode convenionale de identificare a drojdiilor

Separarea drojdiilor n genuri i specii se realizeaz, ntr-o prim etap, pe baza analizei aspectului microscopic al strilor vegetative i sexuate.

Testele fiziologice reprezint etapa urmtoare de identificare a drojdiilor la nivel de specie. Majoritatea taxonomitilor utilizeaz aceste teste asociate cu cele morfologice, dar exist numai cteva scheme care permit o identificare complet a unui taxon numai pe baza reaciilor de fermentaie i asimilaie. Principalul dezavantaj n utilizarea exclusiv a acestor teste const n faptul c exist o variabilitate mare n reaciile test, fie datorit procedeelor utilizate, fie datorit rspunsului tupinii, ceea ce duce la o identificare eronat.

1. Teste morfologice

Morfologia strilor vegetative

Marea majoritate a drojdiilor prezint nmugurire multipolar, un tip de diviziune celular n care mugurii se formeaz pe o arie extins a suprafeei celulare.

Au fost identificate i specii cu nmugurire bipolar sau unipolar.

Speciile genului Schizosaccharomyces difer de celelalte drojdii, prin faptul c nmulirea vegetativ se realizeaz exclusiv prin fisiune binar, proces care presupune formarea unui perete celular n partea central a celulei i separarea celor dou celule fiice.

O alt variaie se ntlnete n cazul speciilor genului Trichosporon, care se divid i prin nmugurire i prin fisiune binar.

Unele specii, pe lng diviziunea prin nmugurire sau fisiune, pot s formeze hife sau pseudohife. Hifele adevrate se caracterizeaz prin lipsa constriciilor la nivelul pereilor despritori, n timp ce pseudohifele, dei sunt alungite, se formeaz prin nmugurire i prezint constricii n punctele de ataare celular. Formarea hifelor i a pseudohifelor este stimulat de reducerea oxigenului, fapt ce se poate realiza n laborator ntr-o plac Petri, prin plasarea unei lame de sticl pe suprafaa agarului, n zona inoculului.

Morfologia strilor sexuate

n cazul drojdiilor ascomicete, o semnificaie taxonomic deosebit o prezint o serie de caracteristici ale strilor sexuate, cum ar fi:

dac au un sistem de mperechere homo- sau heterotalic;

tipul de conjugare, dac exist, nainte de formarea ascosporilor;

forma, topografia i numrul ascosporilor.

Speciile heterotalice sunt uneori izolate din natur sub form de haploizi asporogeni, care ulterior sunt intermixai cu tipul de mperechere complementar, pentru sporulare i analiz genetic.

Tulpinile homotalice prezint un proces de autofertilizare, formnd diploizi pornind de la o cultur monosporal, spre deosebire de tulpinile heterotalice, care prezint fertilizare ncruciat i formeaz diploizi prin conjugarea celulelor de tip opus de mperechere.

Ascosporii prezint o varietate de forme i ornamentri de suprafa. Forma cea mai comun este cea de plrie. Alte forme sunt sferice, elipsoidale, alungite, cu apendice n form de bici, etc. Unii spori prezint pe suprafa cutri i creste.

Bazidiosporii produi de bazidiomicete sunt, n general, celule neornamentate, elipsoidale sau alungite, dar evenimentele ce duc la formarea lor pe suprafaa bazidiilor sunt extrem de complexe. Depinznd de gen, bazidiile pot s apar din teleospori cu peretele ngroat sau apar direct din hife. Speciile pot s fie homo- sau heterotalice, iar mperecherea poate fi controlat de o pereche sau dou perechi de alele, spre deosebire de ascomicete, unde o singur pereche de alele controleaz conjugarea.

2. Teste fiziologice

Dup cum am mai discutat, separarea drojdiilor n genuri s-a realizat iniial pe baza observaiilor microscopice. Recunoaterea pn la nivel de specie pune, ns, problema realizrii unor teste de asimilaie i fermentaie.

Testele de fermentaie

Drojdiile prezint o mare variabilitate n ceea ce privete fermentarea zaharurilor (de la o fermentaie foarte viguroas pn la lipsa complet a capacitii fermentative), proces evideniat de majoritatea taxonomitilor prin tehnica Durham, metod extrem de simpl i eficient.

Metoda const n cultivarea drojdiilor pe medii cu extract de drojdie (Yeast Extract 0,5g/l), incluznd ca surs de carbon diferite zaharuri n concentraie de 50 mM. Capacitatea de fermentaie a diferitelor zaharuri se estimeaz pe baza procentului de gaz (CO2) acumulat n tuburile Durham. Zaharurile utilizate sunt D-glucoz, D-galactoz, zaharoz, maltoz, lactoz, rafinoz i trehaloz. Ocazional, sunt incluse n test, pentru comparaie, i melibioza, D-xiloza, amidonul i inulina. Testele de asimilaie

Testele de asimilaie presupun creterea drojdiilor n condiii de aerobioz pe diferite zaharuri. Se realizeaz n eprubete care conin mediu lichid standard (YNB-yeast nitrogen base-5ml ), sursa de carbon fiind adugat n concentraie de 50 mM. Citirile se realizeaz dup 1, 2, 3 i 4 sptmni. Pattern-urile de asimilaie pentru diferte specii pot fi gsite n determinatoare de genul: The Yeasts. A Taxonomic Study (Kreger-van Rij, 1984) i Yeast: Characteristics and Identification ( Barnett et al., 1983).

Au fost puse la punct i metode rapide de identificare, de tipul kiturilor de testare, care sunt, ns, valabile n special pentru drojdiile cu importan medical. Deoarece spectrul compuilor cu carbon este limitat, aceste kituri au o aplicabilitate mai mic n cazul celorlalte tipuri de drojdii (Baker et al., 1981).

Alte tipuri de teste

Alte teste de cretere includ rspunsul la compui cu azot, absena vitaminelor din mediu variaia presiunii osmotice, prezena n mediu a cicloheximidei i variaia temperaturii.

O problem major care se pune este, n cazul drojdiilor anamorfe, identificarea partenerilor teleomorfi, care pot s aparin ascomicetelor sau bazidiomicetelor. Van der Walt i Hopsu-Havu (1976) au pus la punct un test simplu de culoare, care distinge cele dou clase. Colorarea se realizeaz cu albastru de diazonium B (DBB-Diazonium Blue B) care reacioneaz cu celulele ce aparin culturilor de bazidiomicete, peretele celular colorndu-se n rou aprins. Ascomicetele nu rspund la reacia cu DBB.

Tabelul 10.4. Compuii organici utilizai n mod obinuit n testele de asimilaie i fermentaie la drojdii

ClasaCompuii

HexozeD-glucoz, D-galactoz, D-ramnoz, D-sorboz

PentozeD-xiloz, D-riboz, D-arabinoz

Dizaharidezaharoz, maltoz, celobioz, trehaloz, lactoz, melibioz

Trizahariderafinoz, melezitoz

Polizaharideamidon solubil, inulin

Alcoolieritritol, ribitol, D-manitol, inozitol, metanol, etanol, glicerol, galactitol, sorbitol

Acizi organiciacid succinic, acid citric, acid lactic, acid malic, acid gluconic, acid gucuronic, 2-cetoglucuonat, 5-cetoglucuonat

Glicozide-metil-D-glucozid, arbutin, salicin

Ali compuiglucono- lacton, D-glucozamin, hidroclorid, decani, hexadecani

3. Sisteme generale de identificare utilizate de taxonomiti

Identificarea definitiv

Pentru a obine o identificare definitiv este necesar compararea rezultatelor obinute pentru o tulpin necunoscut cu caracteristicile unor tulpini standard.

Barnett i colab (1983) au realizat un sistem relativ simplu, computerizat, de ncadrare cu ajutorul unor chei de identificare, care se bazeaz n special pe teste fiziologice. Dezavantajul sistemului const n faptul c, utiliznd un numr mare de chei de identificare, comportarea atipic a tulpinii necunoscute ntr-un singur test poate da rezultate eronate.

Kirshop i colab. (1986) au pus la punct un sistem mai rapid de identificare, ce se bazeaz pe o matrice probabilistic ce cuprinde rspunsul la 46 de teste morfologice i fiziologice pentru 400 de specii de drojdii, reproductibile i aplicabile la o gam larg de specii. Identificarea se bazeaz pe rspunsul unei tulpini necunoscute la toate testele, iar un rspuns atipic la un test este inclus n calculul probabilistic. Sistemul, denumit COMPASS (computer assay) este accesibil Coleciilor Naionale de Culturi de Drojdii conectate la Internet.

Tabelul 10.5. Teste utilizate n sistemul COMPASS de identificare a drojdiilor

TestulInformaiile obinute

Creterea pe mediu lichid

Creterea pe mediu agarizat

Creterea pe mediu solid cu acetat de

potasiu sau carbonat de calciu

Fermentarea zaharurilor

Creterea n aerobioz pe medii cu surse de carbon

Creterea n aerobioz pe surse de azot

Creterea pe mediu fr vitamine

Activitate ureazicDiviziunea celular; formarea de pelicule

Caracteristicile creterii vegetative

Formarea de pseudomicelii

Formarea de hife adevrate

Prezena artrosporilor

Prezena balistosporilor

Formarea de ascospori

Capacitatea de a fermenta 5 zaharuri

Capacitatea de cretere aerobiotic pe 31 de carbohidrai

Capacitatea de cretere aerobiotic pe 2 surse de azot

Capacitatea de cretere fr adaos de vitamine

Prezena activitii ureazice

X.2. Nomenclatura drojdiilor

Caracteristicile cele mai importante utilizate frecvent n definirea unui taxon de drojdii sunt, dup cum s-a menionat i anterior:

aspectul microscopic al celulelor;

tipul de reproducere sexuat;

caracterele fiziologice i

caracterele biochimice.

Speciile care prezint o nmulire sexuat cunoscut sunt denumite teleomorfe, n timp ce starea anamorf este caracteristic drojdiilor imperfecte, care nu prezint sexualitate.

Unul dintre punctele cardinale ale taxonomiei este faptul c, n clasificare, se pornete de la starea teleomorf n construirea de arbori filogenetici.

Dac se determin capacitatea de reproducere sexuat i respectiv apartenena la forma teleomorf, un gen poate fi clasificat alturi de un alt gen, anamorf, care prezint aceleai caracteristici morfologice i fiziologice. De exemplu, Candida utilis este anamorful speciei Pichia jadinii, n timp ce Candida pulcherrima are ca partener teleomorf specia Metschnikowia pulcherrima.

Taxonii cunoscui ca avnd doar reproducere asexuat sunt listai ca genuri anamorfe. Odat cu identificarea unor forme sexuate, genul respectiv se asimileaz cu partenerul teleomof i se renun la denumirea dat formei anamorfe.

O alt problem care apare n clasificarea diferiilor taxoni este prezena sinonimelor. Sinonimele apar din modificri fcute n nomenclatura unei specii sau din redescrierea neadecvat a unei specii deja cunoscute.

Un exemplu pentru primul caz ar fi cel al drojdiei utilizate n sinteze proteice Torula utilis, reclasificat drept Torulopis utilis. Mai trziu a fost transferat genului Candida i a devenit Candida utilis. Ca urmare, numele de Torula utilis i Torulopsis utilis au devenit sinonime cu Candida utilis. n prezent, Candida utilis este cunoscut i ca anamorful speciei Pichia jadinii.

Un alt sinonim al drojdiei C. utilis este C. guillermondii. Acest termen a rezultat din denumirea incorect a unei tulpini de C. utilis identificat ca o specie nou.

Alte exemple includ speciile Saccharomyces diastaticus i S. italicus care n urma analizelor ADN s-au dovedit identice cu S. cerevisiae i deci au devenit sinonime.

Cunoaterea sinonimelor prezint o importan deosebit i pentru biotehnologi, care pot s evite confuziile care apar n urma unei clasificri eronate.

De exemplu, descoperirea c o anumit reacie poate fi mediat de S. cerevisiae, S. beticus, S. chevalieri, S. gaditensis, S. hispalensis i Zygosaccharomyces paradoxus a sugerat iniial o funcie metabolic comun; ulterior s-a stabilit c sunt conspecifice cu S. cerevisiae i sunt sinonime.

X.3. Taxonomia molecular a drojdiilorAplicarea tehnicilor moleculare n sistematica drojdiilor a dus la identificarea mai precis a diferitelor specii i a permis reevaluarea arborilor filogenetici existeni. Prin aplicarea unor metode genotipice, fenotipice i a unor criterii filogenetice s-au pus bazele aa numitei taxonomii polifazice.

Informaiile genotipice sunt aduse de studiile realizate pe acizii nucleici (ADN i ARN); cele fenotipice deriv din studiul proteinelor i al funciilor lor, al unor markeri chemotaxonomici i al altor trsturi exprimabile - morfologie, fiziologie, enzimologie, serologie.

1. Analize taxonomice pe ADN cromozomal

Metodele genotipice sunt cele care aduc datele cele mai rapide i acurate privind ncadrarea taxonomic a unei anumite specii. Aceste tehnici moleculare vizeaz la drojdii analiza ntregului ADN cromozomal:

determinarea compoziiei n baze azotate, respectiv a procentului molar de guanin/ citozin - % mol GC;

determinarea gradului de omologie prin reasocieri ADN/ADN;

analiza profilului de lungime a fragmentelor de restricie - RFLP (Restriction Fragments Length Polimorfism);

studii de omologie a ARNr i a genelor corespunztoare;

compararea profilurilor cromozomale obinute prin tehnici electroforetice speciale (electrocariotipare).

Determinarea coninutului n guanin/citozin (% mol GC)

n ultimii ani au fost puse la punct o serie de tehnici de analiz a ADN cromozomal, ce ofer informaii cu valoare taxonomic despre microorganisme. Una dintre cele mai folosite analize este reprezentat de determinarea compoziiei ADN genomic n baze azotate. Complementaritatea bazelor azotate i structura dublucatenar a ADN asigur existena n molecul a unor cantiti echivalente de guanin - citozin i adenin timin.

Este important de subliniat faptul c similaritatea n compoziia n baze azotate nu nseamn n mod necesar c dou microorganisme sunt nrudite, pentru c pot avea acelai % mol GC, dar secven diferit de nucleotide. Reciproca nu este ns valabil, pentru c dou tulpini cu valori foarte diferite ale mol % GC, au i secven diferit de nucleotide. Ca urmare, compoziia n baze azotate exprimat n % mol GC reprezint un criteriu taxonomic de excludere i nu de includere (criteriu negativ de ncadrare a taxonilor).

Estimarea procentului G+C al moleculelor ADN se poate realiza prin trei principale metode:

determinarea cromatografic a bazelor azotate obinute n urma hidrolizei ADN cromozomal, utilizndu-se tehnica HPLC (High Performance Liquid Chromatography- cromatografie n faz lichid, Nakaseetal, 1989);

Aceast metod este extrem de acurat, dar este laborioas i costisitoare, iar la eucariote prezint i dezavantajul existenei i a ADNmt n fracie.

ultracentrifugarea probei de ADN cromozomal n gradient de densitate de CsCl urmat de calcularea densitii de plutire a macromoleculelor de ADN din prob cu ajutorul densitii de plutire a unei probe standard de ADN;

Procentul molar G+C se calculeaz pe baza relaiei:

Densitatea de plutire = 1,66 x mol % GC

i aceast metod este laborioas i costisitoare, dei nu la fel de acurat ca HPLC.

denaturarea termic, metoda utilizat n prezent cel mai frecvent n stabilirea procentului molar de guanin + citozin dintr-o prob de ADN.

n aceast tehnic, moleculele de ADN sunt nclzite ntre 20 i 100o C, timp n care este msurat spectrofotometric variaia absorbanei la lungimea de und ( = 260 nm (A260).

Datorit creterii temperaturii, are loc denaturarea termic a moleculelor ADN. Procesul const n ruperea legturilor de hidrogen dintre cele dou catene i trecerea moleculelor de ADN din form dublucatenar n form monocatenar.

n timpul denaturrii termice, valoarea A260 crete cu pn la 40%, proces denumit shift hipercromic. Temperatura la care jumtate din cantitatea de ADN se afl sub form monocatenar este denumit temperatur de topire, Tm, i este corelat linear cu % mol GC din prob.

n decursul timpului, au fost elaborate mai multe ecuaii de corelaie ntre cei doi parametrii (%mol GC), n funcie de tipul de microorganism i de ncrctura ionic a tamponului n care a fost dizolvat ADN-ul (n special concentraia ionilor de sodiu).

Astfel, pentru bacterii au fost elaborate dou ecuaii de corelaie:

a) % mol GC = 2,44 x Tm 169

(Franck, 1971)

util cnd ADN este dizolvat n 0,1X SSC (NaCl 15 mM, citrat trisodic 1,5 mM), rezultnd o concentraie mai mare a ionilor de sodiu.

b) % mol GC = 2,08 x Tm 106,4

util cnd ADN este dizolvat n tampon TE pH= 8,0 (Tris 10 mM EDTA 1mM), deci la o concentraie mai mic a ionilor de sodiu.

Pentru drojdii este valabil o alt formul, i anume:

%mol GC = 2,08 x Tm 106,4

(Owen, 1985)

Valorile % mol GC ofer posibilitatea diferenierii claselor i genurilor i la drojdii.

Astfel, procentul G+C al drojdiilor ascomicete este cuprins ntre 30 i 50 %, n timp ce la basidiomicete variaz ntre 50 i 70% (Nakase i Komagata, 1968; Kurtzman, Phaff i Meyer, 1983). i genurile clasei de drojdii imperfecte, cu excepia celor cu valori apropiate, cuprinse ntre 48 i 52 %, pot fi determinate pe baza coninutului n baze azotate.

n general, variaia % mol GC pentru diferitele specii ale unui gen nu este mai mare de 10%, fapt confirmat pentru majoritatea genurilor de drojdii. Exist, ns i excepii, cum ar fi n cazul speciilor genului Pichia la care diferena ajunge pn la 22%, sau la Rhodotorula, pn la 14%. Ca urmare, s-a sugerat necesitatea diferenierii unor asemenea taxoni n mai multe genuri de drojdii.

Studii de hibridizare ADN-ADN

Hibridizarea sau reasocierea ADN nuclear reprezint o metod indirect de estimare a gradului de nrudire dintre dou specii (Kurtzman i Phaff, 1987), ce ofer o rezoluie mai mare comparativ cu determinarea procentului molar de baze azotate.

Pn n prezent au fost descrise diferite metode de evaluare a gradului de hibridizare ADN, dintre care amintim :

Metodele spectrofotometrice (DeLey i colaboratorii, 1970)

Metodele spectrofotometrice permit:

decelarea ntre formele mono- sau bicatenare, absorbana la 260 nm fiind mult mai mare pentru ADN monocatenar dect pentru ADN dublucatenar;

studierea renaturrii ADN n funcie de timp (diminuarea absorbanei), la o temperatur optim:

TOR = (0,51 x % molGC) + 47 (OR = renaturare optim)

Hibridizarea pe suport solid

Aceast metod utilizeaz filtre de nitroceluloz i sonde marcate de ADN i se poate realiza prin:

metode directe: ADN-ul monocatenar A, neradioactiv, fixat ireversibil pe filtre de nitroceluloz ; incubarea filtrelor la Tm - 250C n prezena sondei monocatenare marcate radioactiv;

metode prin competiie: filtrul pe care s-a fixat ADN de referin, neradioactiv A este incubat n prezena ADN radioactiv, denaturat, A* homolog i o cantitate mai mare de ADN denaturat - B, aparinnd tulpinii luate n studiu (competitorul).

Martori:- negativ : fr ADN competitor B = 100% reasociere cu A* = 0% competiie ;

- pozitiv: ADN competitor este ADN-ul A) = 0% reasociere cu A* = 100% competiie.

Hibridizarea n soluie

Se realizeaz innd cont de anumii parametrii:

ADN radioactiv s fie n cantitate foarte mic (reasocierea este improbabil);

ADN neradioactiv s fie n cantitate de 1500 de ori mai mare.

Hibridizarea n NaCl 0,42 M, sau n tampon fosfat 0,28 M, la temperatur optimal (de la Tm 25 la Tm 30o C ): prin aplicarea acestei metode se impune n final separarea ADN hibrid (bicatenar) de ADN rmas monocatenar, fie prin cromatografie pe hidroxiapatit, fie prin tratament cu nucleaz S1, care hidrolizeaz specific ADN monocatenar (Vandamme et al., 1996).

Rezultatele obinute prin aplicarea metodelor de reasociere ADN se exprim n procente de omologie, dar exist anumite semne de ntrebare n deciderea punctului n care dou tulpini sunt considerate specii diferite. Unii cercettori au sugerat faptul c un procent de reasociere mai mare de70 80 % demonstreaz conspecificitate (Price et al., 1978).

Kurtzman i colab. (1980) au analizat aceast problem la tulpinile de drojdii heterotalice i au constatat c o complementaritate crescut a moleculelor de ADN este corelat cu fertilitatea. Astfel, au constatat c speciile Pichia amylophila i P. missippiensis care prezint capacitate de mperechere, dar sporii nu sunt viabili, au un procent sczut de omologie ADN, n jur de 25%. Ca urmare, se poate face o corelaie ntre fertilitatea sczut i un grad mic de complementaritate ADN.

n acelai timp, ns, relaia dintre alte tulpini, cum ar fi Issatchenikia scutulata var. scutulata i I. scutulata var. exigua este oarecum diferit. Aceti doi taxoni prezint o omologie ADN de numai 25%, dar ncrucirile genetice dau o viabilitate a ascosporilor de 3-6 %. Mai mult, ncruciarea descendeilor din F1 a dat o viabilitate de 17% n generaia F2. Aceste rezultate sugereaz faptul c toi descendenii au n general cromozomi omologi i nu apar nici amfiploizi, nici aneuploizi.

Este clar c limita minim a valorii procentului de reasociere ADN-ADN, care sugereaz delimitarea speciilor, nu este bine definit, iar diferena n secvena de nucleotide, estimat din compararea ntregului genom, poate fi chiar de 75% fr ca s apar modificri genetice.

Tabelul 10.6 cuprinde principalele date referitoare la corelaiile dintre procesul de mperechere i complementaritatea ADN.

n aceste studii se demostreaz c descreterea procentului de reasociere este asociat cu scderea competenei de mperechere i a fertilitii.

Existena unor excepii n ceea ce privete omologia ADN genomic i fertilitatea descendenilor pune problema c procentul de reasociere reprezint un indicator puternic, dar nu infailibil al nrudirii speciilor. Aceste excepii se datoresc unor mutaii genetice de tipul inversiilor, translocaiilor, autoploidiei i aloploidiei, care afecteaz fertilitatea. Majoritatea acestor modificri nu pot fi detectate n urma comparrii ADN genomic total. Doar amfiploidia poate fi decelat, n cazul n care apar variaii n mrimea genomului la specii foarte nrudite.

De exemplu, S. carlsbergensis este nalt nrudit i cu S. cerevisiae i cu S. bayanus, dei aceste dou ultime specii sunt foarte puin nrudite ntre ele. Compararea mrimii genomurilor sugereaz c S. carlsbergensis este un amfiploid parial care apare ca un hibrid natural ntre S .cerevisie i S. bayanus. (Vaughn Martin i Kurtzman, 1985). n acest caz, s-a presupus c S. carlsbergensis este infertil cu parentalii, n ciuda omologiei mari a ADN.

Studiile de reasociere ADN au avut un impact extraordinar n definirea speciilor i genurilor de drojdii (Tabelul 10.7).

Astfel, speciile genurilor Candida i Torulopsis au fost iniial ncadrate n taxoni diferii pe baza faptului c primele produc pseudohife. n prezent, aceti taxoni sunt considerai sinonimi, pe baza studiilor de reasociere ADN, i denumirea de Candida a avut prioritate, fiind prima descris.

Este i cazul speciilor Pichia lindneri i Hansenula minuta (Kurtzman, 1984), care au fost iniial ncadrate ca taxoni diferii pe baza capacitii diferite de asimilare a azotului, iar n prezent sunt considerate ca aceeai specie, prezentnd un procent de omologie ADN de 75%.

Tabelul 10.6. Corelaia dintre reacia de mperechere i complementaritatea ADN ntre ascomicete heterotalice strns nrudite i bazidiomicete

SpeciileReacia de mperechere% omologie ADN

Filobasidiela neoformans x

F. bacillisporaConjugare slab; viabilitatea bazidiosporilor 0-30% (descendena F 1, 2 nedeterminat)55-63

(Aulakh, 1981)

Issatchenkia scutulata var. exigua x I.scutulata var. scutulataConjugare bun; ascospori viabili: F1= 5%; F2 =17%21-26

(Kurtzman et al., 1980)

Pichia amylophila x P. mississippiensisConjugare bun; ascospori neviabili20-27

(Kurtzman et al., 1980)

P. bimunadalis x P.americanaConjugare slab; nu se produc ascospori21

(Kurtzman et al., 1980 )

P.alni x P. canadensisConjugare slab; nu se produc ascospori6

(Fuson et al., 1979)

Issatchenkia orientalis x I. occidentalisConjugare slab; nu se produc ascospori3-8

(Kurtzman et al., 1980 )

Tabelul 10.7. Utilizarea criteriilor de reasociere a ADN n taxonomia drojdiilor

SpeciaCaracteristicile /+ sau /-%reasociere ADN

Candida slooffiTorulopsis pintolopesiipseudohife/+

/-80

(Mendonsa-Hagler & Phaff, 1975)

Hansenula wingeiHansenula canadensishife adevrate/+

/-

78

(Fuson,1979)

Debaryomyces formicarius

Debaryomyces vanrijifermentarea glucozei/+

/-96

(Price et al., 1978)

Schwanniomyces castellii

Schwanniomyces occidentaliasim. lactozei /+

/-

97

(Price et al., 1978)

Hansenula minuta

Pichia lindneriasim. azotatului /+

/-75

(Kurtzman, 1984)

Sterigmatomyces halophilus

Sterigmatomyces indicasasim. azotului/+

/-100

(Kurtzman,1984)

2. Studii de omologie pe ADN mitocondrial

Studiile de omologie pe ADN mitocondrial (ADNmt) se realizeaz prin compararea pattern-urilor de restricie i prezint avantajul c, ADN mitocondrial avnd dimensiuni mai mici dect ADN nuclear, analiza fragmentelor de restricie este mai facil.

Dei structura genetic a ADNmt este aceeai pentru toate speciile de drojdii, profilurile de restricie sunt diferite, datorit modificrilor de dimensiune ce apar frecvent, fie n urma unor mutaii ireversibile ce afecteaz ntregul genom, fie datorit variabilitii genelor mozaicate.

Astfel, locusul cob-box, care codific pentru apoproteina citocromului b, este format la unele tulpini din 4 exoni i 3 introni, n timp ce la alte tulpini conine 6 exoni i 5 introni, datorit inseriei a 3 introni n exonul 1. De asemenea, gena pentru ARNr 21S prezint, la unele tulpini, un intron de 1,1 Kpb, n timp ce la alte tulpini acest intron este deletat.

Recent, a fost pus la punct o tehnic simpl i rapid de analiz a pattern-ului de restricie a ADNmt (Querol,1996), care nu necesit n prealabil izolarea i purificarea ADN mt, prin ultracentifugare izopicnic, permind caracterizarea facil a unui numr mare de tulpini naturale de drojdii.

Metoda const n tratarea ADN total (izolat printr-o micrometod) cu endonucleaze de restricie care recunosc secvene tetranucleotidice (AluI, HaeIII, Hpa, RsaI, Sau3A, MboI) sau pentanucleotidice (DdeI, HinfI, MaeIII). Pentru aceste enzime de restricie sunt prezente foarte multe situsuri de recunotere n ADN-ul nuclear, n timp ce n ADNmt sunt foarte puine secvene specifice. Datorit dimensiunii lor mari, aceste fragmente pot fi observate cu uurin n gelul de agaroz, profilurile RFLP obinute permind decelarea diferitelor tulpini de drojdii, avnd astfel o valoare taxonomic deosebit.

3. Studii de omologie pe ADNr pe baza reasocierii ARNr-ADNr

n ultimul timp, studiile de taxonomie la drojdii apeleaz, ca de altfel i n cazul altor organisme, i la analiza genelor pentru diferitele tipuri de ARNr (25 S, 18 S, 5,8 i 5 S).

S-a ajuns la concluzia c secvenele ADNr i implicit moleculele de ARN ribozomal corespunztoare prezint, n scar evolutiv, un grad ridicat de constan funcional i de secven, constituind cele mai bune cronometre moleculare. Astfel, interesul pentru studiile realizate pe ARNr/ ADNr se datoreaz unor caracteristici importante, cum ar fi:

ribozomii sunt prezeni la toate organismele i au aceeai origine evolutiv, ceea ce presupune o origine molecular comun pentru toate organismele vii;

unele secvene ARNr/ADNr sunt nalt conservate i, ca atare, omoloage la toate organismele, reprezentnd puncte de referin pentru identificarea secvenelor variabile, markeri de identificare a relaiilor filogenetice dintre specii;

genele ADNr sunt organizate n uniti repetitive dispuse n tandem, fiind prezente la eucariotele inferioare, inclusiv la drojdii, n 100-200 copii. Din acest motiv reprezint un material perfect pentru reaciile de restricie (Kurtzman, 1994 ).

Studiile de taxonomie molecular s-au axat iniial pe analiza moleculelor de ARNr, innd cont de faptul c metodele de izolare i purificare a acestor molecule se realizeaz relativ facil, datorit cantitii mari de ARNr existent n celule.

Tehnicile de caracterizare a diferitelor tipuri de ARNr, de dimensiuni mici i mari, constau n secvenierea moleculelor ARNr prin aplicarea metodei Sanger sau, mai recent, a moleculelor ADNc rezultate prin utilizarea unor primeri oligonucleotidici specifici i a reverstranscrierii (Lane i colab, 1985). De altfel, s-a constatat c se obin rezultate mai acurate prin secvenierea ADNr, utiliznd primeri oligonucleotidici i reacia PCR (Kaltenboecker i colab., 1992).n sistematica drojdiilor, primele studii de reasociere ARNr-ADNr au fost realizate n 1970, de Bicknell i Douglas.

Prin estimarea gradul de reasociere dintre probe de ARNr 25S marcate radioactiv i ADN nuclear au stabilit nrudirea strns dintre genurile Saccharomyces, Kluyveromyces, Zygosaccharomyces, Torulopsis i Arxiozyma i o divergen crescut ntre aceti taxoni i alte drojdii, cum ar fi Pichia jadinii (specia anamorf, Candida utilis). O metodologie similar a fost utilizat i de Segal i Zylan (1974) n compararea speciilor de Candida, inclusiv Candida albicans.

i la bazidiomicete studiile de reasociere ARNr-ADN au reevaluat relaiile dintre diferite specii, stabilind, de exemplu, c speciile cu pigmentaie roie, Rhodosporidium toruloides i Sporidiobolus salmoniocolor sunt mult mai puin nrudite ntre ele dect R. toruloides i specia Leucosporidium scotti, care nu produce pigmeni carotenoizi.

Dei hibridizrile ARNr/ADNr dau informaii generale privind relaiile dintre taxoni, prezint unele impedimente n aplicarea lor extensiv n studiile de taxonomie, deoarece sunt laborioase, iar n cazul n care cresc distanele filogenetice se ajunge la un punct n care secvenele de nucleotide sunt att de diferite, nct nu permit hibridizri moleculare. De altfel, s-a sugerat c similaritatea de secven trebuie s fie n jur de 80%, pentru a se realiza reasocierile moleculare.

Studiul paternurilor de restricie pe ADNr

Studiile realizate pe diferii taxoni de drojdii au demonstrat c pattern-urile de restricie pe ADNr dau rezultate concludente, att n identificarea speciilor, ct i a tulpinilor unei anumite specii.

Primele cercetri care au vizat ncadrarea taxonomic a drojdiilor prin RFLP pe ADNr au avut ca obict de studiu drojdiile patogene, cu importan medical. n cazul tulpinilor patogene aceast tehnic prezint valoare de diagnostic.

Astfel, au fost stabilite relaiile filogenetice ntre diferite specii aparinnd genurilor Candida i Cryptococcus (Magee i colab., 1987; Vigalys i Hester, 1990). Aceste estimri sunt ns mai puin acurate dect cele derivate din compararea secvenelor de nucleotide, deoarece cu ct distanele filogenetice sunt mai mari, cu att estimarea similaritilor paternurilor de restricie este mai puin sigur.

Secvenierea ARNr 5S

Majoritatea studiilor de secveniere a ARNr 5S s-au realizat la bazidiomicete i prezint o importan deosebit n stabilirea relaiilor filogenetice, datorit analizei facile a acestor molecule de dimensiuni mici (circa 120 nucleotide) i cu o secven de nucleotide nalt conservat (Kurtzman, 1993).

La ascomicete, aceste studii au fost mai puin abordate, dar au avut o mare relevan n stabilirea evoluiei divergente a speciilor Schizosaccharomyces pombe i Saccharomyces cerevisiae (Mao i colab., 1985 ).

Rezultate similare au fost obinute i de walker (1985), care a demonstrat pe baza studiilor de secveniere a ARN 5S c ascomicetele prezint o divergen mult mai mare dect s-a crezut iniial i se divid n trei grupe mari: 1. Schizosaccharomyces i Protomyces; 2. drojdiile care se nmulesc prin nmugurire; 3. fungii filamentoi.

Secvenierea ARNr 18S i 25S

Compararea secvenelor ARNr 18S i 25S (Guttel i Fox, 1988 ) a demonstrat faptul c la capetele 5 aceste molecule prezint un grad ridicat de variabilitate, ceea ce permite decelarea speciilor nalt nrudite. Astfel, Peterson i Kurtzman (1991) au artat c regiunea desemnat 25S-635 (domeniul D2, Guadet i colab., 1989) prezint o variabilitate destul de mare, care permite separarea speciilor stns interrelate (Tabelul 10.8).

Exist i excepii, cum ar fi perechea Saccharomyces bayanus/ S. pastorianus, cu o variabilitate de 0% n regiunea D2. Se presupune c S. pastorianus este un amfidiploid parial rezultat din hibridizrile S. cerevisiae x S. bayanus, care a reinut ADNr de la S. bayanus (Peterson i Kurtzman, 1991).

Tabelul 10.8. Variabilitatea regiunii 25S-635- criteriu de difereniere a speciilor strns nrudite

Speciile perecheOmologie ADN (%)

Variabilitate n regiunea 25S-635 (% nucleotide diferite)

Specii heterotalice

Saccharomyces cerevisiae x S.pastorianus

S.cerevisiae x S. bayanus

S.pastorianus x S. bayanus

Pichia mississippiensis x P. amylophila

P. bimundalis x P. americana

Issatchenkia scutulata x var. esigna

Specii homotalice

Debaryomyces melissophilus x D.sp.n.

Saturnospora saitoi x S. ahearnii

Williopsis saturnus x sargentensis58

10

70

25

21

25

30

30

435,4

5,4

0

2,0

1,0

5,1

0,7

2,0

0

Astfel, regiunea D2 este suficient de variabil pentru a permite, cu cteva excepii, identificarea speciilor de drojdii aparinnd ascomicetelor i bazidiomicetelor, chiar i a celor cu un grad mare de nrudire.

Speciile conspecifice prezint n mod obinuit o divergen de 0-1%, n timp ce la speciile ndeprtate filogenetic, cum ar fi Pichia bimundalis i Schizosaccharomyces japonicus var. versatilis, se observ o varabilitate de circa 47% (Peterson i Kurtzman, 1991).

Analiza comparativ a regiunii D2 i a regiunilor 25S-1841 i 18S-1627 la diferite specii de drojdii a permis construirea arborilor filogenetici la genurile Debaryomyces, Saccharomyces i Schizosaccharomyces.

S-a constatat c n cele trei regiuni pot s apar substituii de perechi de baze, cu rate variabile n funcie de gen, reprezentnd, astfel, un criteriu important n clasificarea drojdiilor.

Identificarea drojdiilor prin tehnici electroforetice specialeTehnicile de electrocariotipare permit separarea prin electroforez n gel de agaroz a moleculelor de ADN cu dimensiuni de peste 25 kpb a cror migrare este blocat n condiiile electroforezei clasice datorit imposibilitii de naintare prin ochiurile reelei gelului de agaroz. O soluie ar fi utilizarea unei agaroze de concentraie mai mic de 0,5% ceea ce ridic ns dificulti de manipulare a gelului.

Aceste tehnici fac posibil evidenierea celor 16 cromosomi de la S. cerevisiae a cror dimensiune medie (determinat prin tehnicile clasice de cartare genetic) variaz ntre 500 - 1000 kpb.

n prezent se utilizeaz diferite tehnici de electrocariotipare care difer att prin numrul i dispunerea electrozilor ct i prin tipul de cmp electric generat, fapt care determin grade diferite de rezoluie a benzilor electroforetice:

Tehnica OFAGE (ortogonal field alternation gel electrophoresis)

Aceast tehnic a fost introdus de Carle i Olson n 1984, utilizeaz 2 perechi de electrozi astfel plasai nct produc cmpuri electrice n diagonal la unghiuri mai mari de 90o. Datorit neomogenitii cmpului aplicat moleculele de ADN migreaz pe o traiectorie curb departndu-se de centru, asigurnd totui apariia unor benzi clare (Figura 10.1). Actualmente tehnica a fost nlocuit cu altele mai performante.

Figura 10.1. Tehnici electroforetice speciale

Tehnica FIGE (field inversion gel electrophoresis)

n tehnica FIGE (field inversion gel electrophoresis) Olson i Carle (1984) - este schimbat cu 180o polaritatea cmpului electric la fiecare ciclu cu un timp mai mare (aproape dublu) pentru direcia spre anod. Relaia ntre viteza de migrare i dimensiunea moleculelor de ADN este complex i, de regul, impune creterea timpului de schimbare a direciei de migrare, proces numit ramping. La unele drojdii care prezint cromosomi de dimensiuni mari, cum este cazul celor din genul Saccharomyces, s-a reuit separarea cromozomilor fr ramping.

Pentru cei 16 cromosomi de la Saccharomyces cerevisiae, s-au evideniat 13 benzi electroforetice datorit co-migrrii unor cromozomi cu dimensiuni apropiate (XIII i XVI, VII i XV, V i VIII) (Fig. 4. 18). Mrimea cromosomului XII variaz de la o tulpin la alta (2 Mb 3Mb) n funcie de numrul de copii (100 200) ale genelor ADNr prezente la nivelul acestui cromosom. Acest aspect s-a dovedit a fi de mare importan n taxonomia drojdiilor.

CromozomDimensiune

(kpb)

Figura 10.2. Cromosomii de S. cerevisiae evideniai prin FIGE

IV1625

XII1095+ADNr

VII + XV1120+1170

XIII + XVI965+1015

II840

XIV825

X760

XI680

V + VIII585+595

IX440

III350

VI270

I245

Tehnica CHEF (contour clamped homogeneous electric fields)

Descris de Chu (1989), Meese i Meltzer (1990), aceast tehnic folosete o arie hexagonal n care sunt plasai muli electrozi mici conectai n serie astfel nct cmpurile electrice se ntretaie n unghiuri de 120o. Benzile rezultate sunt mai clare i pe acelasi gel poate fi ncarcat un numr mare de probe (Fig. 4. 17). O variant a acestei tehnici este RGE (rotating gel) n care se utilizeaz cmpuri electrice ntretiate omogene rezultate prin rotirea gelului cu 90o la fiecare ciclu.

Tehnicile electroforetice speciale permit: (I) separarea i caracterizarea cromosomilor (molecule de ADN intacte) n scopul determinrii polimorfismului cromosomal a diferitelor tulpini de drojdii; (II) identificarea poziiei genelor pe cromosomi; (III) prepararea i screening-ul bibliotecilor YAC (Yeast Artificial Chromosomes).

PAGE 14

_1031387256.bin