BIOCHIMIE MEDICAL

LUCIANA DOBJANSCHI

1

I. Introducere Scopul principal al biochimiei de astzi este s determine cum interacioneaz grupele de molecule nevii din organismele vii pentru a constitui, menine i perpetua starea vie. Biochimia este o tiin foarte tnr. Pn acum cteva zeci de ani puine universiti o recunoteau ca tiin n toate drepturile ei. Exist dou izvoare distincte n genealogia biochimiei actuale. Unul provine din medicin i fiziologie i este rezultatul unor vechi preocupri de a cunoate compoziia chimic a sngelui, a urinii, i a esuturilor, precum i modificrile acestora n stare normal i patologic. Cellalt deriv din chimia organic, din vechi studii asupra compuilor organici naturali. Mult vreme, biochimia a fost privit pur i simplu, fie ca o ramur a fiziologiei, fie ca o ramur a chimiei. Pn la nceputul ultimului sfert de secol, ea nu a fost o tiin bine conturat, de sine stttoare, cu o solid metodologie experimental i cu posibilitatea de aprofundare a fenomenelor biologice. Dou descoperiri mai nsemnate au contribuit la schimbarea situaiei. Una a fost recunoterea sistemelor multienzimatice ca uniti catalitice pentru majoritatea cilor metabolice i dezvoltarea unei ipoteze unitare pentru transferul de energie n celula vie. Cealalt, a avut o inflen mult mai adnc i mai puternic, a fost recunoaterea faptului c ereditatea, unul din aspectele cele mai importante ale biologiei, are o baz real, molecular. Biochimia de astzi face investigaii spectaculoase ntr-o serie de ramuri fundamentale ale biologiei diferenierea celulelor i a organismelor, originea vieii i evoluia, comportamentul i memoria, patologia uman cercetri ce au demonstrat c aceste probleme fundamentale pot fi eficient abordate prin metode biochimice. ntr-adevr, succesul biochimiei n explicarea multor procese celulare a fost att de mare nct muli oameni de tiin au ajuns la concluzia c biologia este chimie. Unii biologi nu accept acest punct de vedere, ei susin c esena sau caracterul complex al organismelor vii nu poate fi redus, acum i niciodat, la nivelul moleculelor sau al interaciilor moleculare. Astzi este probabil mai logic s presupunem, ca o filozofie curent, c toate fenomenele biologice au n cele din urm o baz molecular i s abandonm aceast idee numai atunci cnd nu va mai fi util pentru proiectarea experimentelor cheie sau pentru explicarea datelor experimentale. Nu trebuie totui s privim biologia numai ca pe o ramur a chimiei clasice, cum este chimia organic, chimia fizic sau chimia anorganic. Dac biologia este chimie, ea este un fel de suprachimie care include, dar n acelai timp depete chimia clasic. Aceasta deoarece moleculele din organismele vii nu numai c se supun principiilor fizice i chimice obinuite, care guverneaz comportarea tuturor moleculelor, dar interacioneaz i ntre ele conform altui grup de principii pe care l vom numi logica molecular a strii vii. Aceste principii nu includ n mod necesar fore sau legi fizice noi, nedescoperite nc. Mai curnd ele trebuie privite ca un grup de reguli fundamentale care guverneaz natura, funcia i interaciile tipurilor specifice de molecule din organismele vii, proprieti ce confer acestora capacitatea de a se autoorganiza i autoreplica. Pn n prezent nu au fost identificate nc toate principiile cuprinse n logica molecular a strii vii, iar unele dintre ele sunt vag nelese. De fapt, este probabil mult mai potrivit s considerm aceste principii ca axiome, deoarece unele dintre ele sunt intuitive i nu pot fi demonstrate nc. Biochimia studiaz procesele chimice care condiioneaz viaa i structurile ce i corespund. Biochimia apare i dezvolt ca tiin de grani ntre chimie i biologie, fr a se putea realiza ns o demarcaie net ntre cele dou. nceputurile Biochimiei ca tiin dateaz din sec.XVIII, dar empiric unele procese biochimice se cunosc cu mult timp nainte. Contibuii din domeniul chimiei, biologiei i medicinei se afl ntr-o relaie de reciprocitate cu dezvoltarea biochimiei. Astfel a aprut biochimia modern care studiaz procesele biochimice care se desfoar la nivel celular i molecular. n ceea ce privete profesia de farmacist, Biochimia este o disciplin indispensabil, deoarece ea ne ofer bazele moleculare pentru studiul medicamentului n ceea ce privete aciunea principal, efectele secundare, biotransformarea medicamentului i toxicitatea sa. Deasemenea n terapie sunt cunoscute un numr mare de produi biologici cum ar fi: 2

vitaminele, hormonii, enzimele, aminoacizii, glucidele, compuii purinici i pirimidinici precum i derivaii lor de sintez. Prin inginerie genetic se obin : hormoni, enzime, anticorpi, inetrferon, antitripsina. Deci, se poate concluziona c Biochimia studiaz totalitatea proceselor biochimice din organism (procese catabolice i anabolice), precum i procesele de biotransformare a medicamentelor ajunse n organism.

3

II. Compoziia chimic a organismului uman 1. Compoziia elementar a organismului uman Au fost identificate un numr de peste 60 de elemente care intr n compoziia chimic a organismului uman. Acestea au fost clasificate n funcie de proporia n care se gsesc n organism. Dintre acestea majoritatea se gsesc n urme. Astfel ele au fost clasificate n: macroelemente, oligoelemente i microelemente. Tabelul 1. Repartiia elementelor n organismul uman. Element carbon oxigen hidrogen azot calciu fosfor Procent ( %) 50 20 10 8,5 4 1 Element sulf sodiu clor magneziu fier iod Procent (%) 0,8 0,4 0,4 0,1 0,01 0,00005

Dintre acestea primele patru (C,O,H i N) reprezint peste 95% i sunt considerate macroelemente. Ele sunt principalele bioelemente ale majoritii biomoleculelor datorit tendinei lor mrite de a forma legturi covalente. Oligoelementele se gsesc n proporie mai mic n organism i la fel ca i macroelementele intr n structura biomoleculelor. Microelementele se gsesc n urme, dar cu toate astea ele au un rol esenial pentru via. 2. Compoziia fundamental a organismului uman Bioelementele enumerate mai sus se gsesc n organism grupate n categorii de componeni i anume: componeni organici i componeni minerali. Componenii organici care intr n compoziia organismului uman sunt: proteinele, glucidele, lipidele i acizii nucleici. Aceti compui sunt molecule complexe, care sunt alctuite din molecule simple. Astfel, proteinele se formeaz prin policondensarea aminoacizilor, glucidele sunt formate din monozaharide, lipidele sunt formate din acizi grai i ali componeni, iar acizii nucleici sunt formai din ribonucleotide i dezoxiribonucleotide. Tabelul 2. Principalele biomolecule din organismul uman Biomolecula ADN ARN proteine glucide lipide Uniti strucurale dezoxiribonucleotide ribonucleotide aminoacizi monozaharide Acizi grai i componeni Funcii Material genetic Model pentru sinteza proteinelor Funcii multiple Rezerv de energie ali Funcii multiple

Componenii minerali prezeni n organismul uman sunt apa i electroliii. Apa este constituientul major al tuturor organismelor vii. Organismul uman conine ntre 58 i 66% ap. O influen remarcabil asupra coninutului de ap al organismului o are vrsta. Coninutul de ap variaz i n funcie de sex, astfel femeile au un coninut de ap mai redus n comparaie cu brbaii. 4

Apa din organism este repartizat n vasele sanguine i limfatice, spaiile intercelulare i celule nsi. Apa din organism se gsete repartizat n dou compartimente i anume: compartimentul extracelular, care reprezint aproximativ 50% din greutatea corpului i compartimentul intracelular, care reprezint aproximativ 20% din greutatea corporal. Figura nr.1

Apa reprezint mediul ideal al reaciilor biochimice, vehiculul care asigur transportul i schimburile metabolice. Apa ocup cea mai mare parte din organism reprezentnd 2/3 (55%-75%) din greutatea corporal. Cantitatea total de ap din organism este n funcie de vrst, sex, adipozitate precum i de esutul exploatat : esutul nervos conine aproximativ 82-85%, plmnul, cordul, rinichiul 75-80%, osul 30%, iar dintele 10%. Apa total liber este repartizat n dou sectoare principale celular i extracelular. Apa celular: se gasete n citoplasm, nucleu, mitocondrii, lizozomi. Ea reprezint aproximativ 40% din greutatea corporal. Apa extracelular: este separat de cea celular prin membrane celulare, cantitatea ei se determin cu ajutorul unor substane care difuzeaz rapid prin membranele capilare, dar nu prin cele celulare 5

(manitol, inulin, tiocianat de sodiu). La adult, apa extracelular reprezint 20% din greutatea corporal. Ea este depozitat n mai multe compartimente: intravascular, interstiial, transcelular, i cel din esutul conjunctiv dens cartilaje i vase. a) Compartimentul intra vascular: conine plasma sanguin i limfa. Acesta reprezint 5% din greutatea corporal cantitatea lor poate fi determinat fie cu ajutorul unor substane colorante (albastru Evans, rosu de Congo) fie cu ajutorul albuminei marcate. b) Compartimentul interstiial: reprezint adevratul mediul intern al organismului. Este vorba de un ultrafiltrat plasmatic, care scald celulele, separat de compartimentul intravascular prin membranele capilare. Acestea permit o circulaie hidroelectrolitic liber, dar se opun ieirii proteinelor din vase. Cantitatea de ap din compartimentul interstiial este dedus prin scderea volumului plasmatic din cel extracelular. Se admite ca ea reprezint 15% din greutatea corporal. c) Compartimentul transcelular: se refer la lichidul cefalorahidian, la mediile lichidiene oculare i articulare i la lichidele din seroase i toate nsumeaz aproximativ 200 ml sau 1,5 % din greutatea corporal. n acelai compartiment sunt nglobate i secreiile glandelor digestive. Acestea, aproximate la un total zilnic de 6-8 l, se resorb aproape complet la nivelul diverselor segmente ale tubului digestiv. d) Compartimentul hidric din esutul conjunctiv dens : (cartilaje i oase) reprezint aproximativ 10% din greutatea corporal. Apa acestui compartiment se deplaseaz lent i are schimburi foarte reduse cu restul lichidelor organismului. Aportul de ap n organism poate avea o provenien : Exogen: din digestia apei ca atare sau sub forma apei coninute n alimente (aprox 2000ml / 24 ore). Endogen: din oxidarea principiilor mediate n cadrul metabolismului intermediar. Astfel din metabolismul - a 100 g proteine rezult 46 ml ap - a 100 g lipide rezult 107 ml ap - a 100 g glucide rezult 55 ml ap. Exist o interdependen ntre cantitatea de ap format i cea eliminat. Eliminarea apei se face pe cale : renal, cutanat, digestiv i pulmonar. a) prin perspiraie insensibil: ( saturarea cu vapori de ap a aerului expirat ) se pierd zilnic aproximativ 400 ml ap. Aceast cantitate este mult depasit n stri patologice nsoite de febr. b) prin perspiraie sensibil: (evaporare transcutanat ) se pierd zilnic ntre 200-500 ml ap. Intensitatea pierderilor prin perspiraie insensibil i sensibil nu poate fi reglat. c) prin eliminri hidrice digestive: Sunt minime la omul normal. Prin fecale se elimin aproximativ 150ml / 24 ore. d) prin eliminri hidrice renale: sunt egale n medie cu 1500 ml / 24 ore ( cu variaii ntre 7001700ml / 24 ore. Ele reprezint elementul reglabil i cel mai nobil al pierderilor lichidiene. Aceast eliminare de ap este reglat pe cale hormonal de ctre hormonul antidiuretic (ADH) i prin aldosteron.

6

Electroliii sunt reprezentai de cationi i anioni. Ei ndeplinesc n organism rol fizico- chimic, structural i catalitic. Distribuia cationilor n compartimentele intra i extracelulare este diferit. Tabelul 3. Distribuia cationilor intra- i extracelular n mEg/l. Cationi Na+ K+ Ca+2 Mg+2 intracelular 10 150 2 15 extracelular 145 5 2 2

O clas diferit de biocompui sunt vitaminele care sunt indispensabile pentru funciile lor biologice, dar pe care organismul nu le poate sintetiza.Ele reprezint componenii nutritivi eseniali. Hormonii sunt o alt clas de biomolecule cu rol major n procesele endocrine, care au loc n organism.

7

II. Nucleotide i structura covalent a acizilor nucleici Acidul dezoxiribonucleic (ADN) i ribonucleic (ARN) sunt macromolecule tip lan, care au funcia de a depozita i transmite informaia genetic. Acetia sunt componente majore n toate celulele, reprezentnd 5-15% din masa uscat a acestora. Acizii nucleici se gsesc i n virusuri, care sunt complexe infecioase protein-acid nucleic, capabile s se autoreplice n celula gazd. Dei denumirea acizilor nucleici vine de la faptul c ADN a fost izolat prima dat din nucleii celulari, ei se gsesc totui i n alte compartimente ale celulei. La fel cum aminoacizii sunt elementele constitutive ale proteinelor, aa nucleotidele sunt componenii de baz a acizilor nucleici. Structura general a nucleotidelor Unitile monomere ale ADN se numesc dezoxiribonucleotide, iar cele ale ARN se numesc ribonucleotide. Nucleotidele sunt formate din 3 componente caracteristice i anume: o baz azotat, o pentoz i molecul de acid fosforic. Bazele azotate care intr n structura nucleotidelor sunt de dou tipuri: baze purinice i baze pirimidinice. Bazele purinice prezint un nucleu de baz numit purina, de la care deriv cele dou baze purinice: adenina i guanina. N N N N H NH2 N N N N H H2N N N guanina Baz purinic O N N H

H adenina

Bazele pirimidinice prezint un nucleu de baz numit pirimidina, de la care deriv 3 baze pirimidinice, care int n structura acizilo nucleici, i anume: citozina, uracilul i timina. N N Baz pirimidinic NH2 H N O N O N N H uracilul O H O N N H timina O CH3

H citozina 8

Bazele azotate sunt compui slabi bazici, care pot exista n 2 sau mai multe forme tautomere n funcie de pH. Uracilul, de exemplu, exist n form de lactam i lactim. O H O N N H lactam HO N N lactim OH

Aceste forme, n special cea lactam, este responsabil de formarea legturilor cu celelalte componente din structura nucleotidei. Pe lng bazele obinuite, descrise mai sus, n acizii nucleici se mai gsesc n cantiti mici i alte baze, numite baze rare sau minore. NH N N CH3 N N H N6 metiladenina O H HC 3 HN N N N N H O N N H 5 hidroximetilcitozina O N N H 5 metilcitozina NH2 CH2 OH NH2 CH3

N3 metilguanina

A doua component care intr n structura nucleotidei este reprezentat de pentoz. Aceasta poate s fie D - riboza sau 2 dezoxi D riboza.

HO

HC 2 H

O HH

H OH

HO

HC 2 H

O H H

H OH

OH OHD riboza 9

OH H2 dezoxi D riboza

Prin ataarea unei pentoze la baza azotat rezult o nucleozid, care n funcie de natura pentozei poate s fie ribonucleozid sau dezoxiribonucleozid.

NH2 N HO N HC 2 H N N O H H H OH H2 dezoxiadenozina

NH2 N HO N HC 2 H N N O H H H OH OHadenozina

Prin ataarea unei molecule de acid fosforic la structura unei nucleozide se formeaz un nucleotid. NH2 N OH HO P O O OH P O O OH P O O N HC 2 H N N O H H H OH H AMP ADP AT P Deci, prin ataarea unei molecule de acid fosforic la o nucleozid se formeaz nucleozid monofosfatul (NMP), prin ataarea a 2 molecule de acid fosforic se formeaz nucleozid difosfatul (NDP), i prin ataarea a 3 molecule de acid fosforic se formeaz nucleozid trifosfatul (NTP). Componentele majore ale ADN sunt 4 dezoxiribonucleotide, care se deosebesc ntre ele prin baza azotat, care le d i numele. Cele 4 baze specifice dezoxiribonucleotidelor din ADN sunt: adenina i guanina (baze purinice) i citozina i timina (baze pirimidinice). Similar, pentru ribonucleotide, care sunt componente fundamentale pentru acizii ribonucletidici (ARN), bazele azotate care intr n compoziia lor sunt: adenina i guanina (baze purinice), citozina i uracilul (baze pirimidinice). Deci, timina se gsete numai n ADN, nu i n ARN, iar uracilul se gsete numai n ARN i nu i n ADN. O alt diferen ntre compoziiile celor dou tipuri de acizi nucleici este dat de pentoza din structura nucleotidului: 10

-

dezoxiribonucleotidele conin: 2 dezoxi D riboza ribonucleotidele conin: D riboza.

OH HO P O O HC 2 H baza azotat O HH H OH Hdezoxiribonucleotid

OH HO P O O HC 2 H baza azotat O HH H OH OHribonucleotid Nucleozidtrifosfaii prezint o serie de funcii importante. ATP este un transportor de grupri fosfat i pirofosfat n cteva recii enzimatice implicate n transferal energiei chimice. ADP ul rezultat prin defosforilarea ATP ului este refosforilat la ATP n procesul respiraiei. Sistemul ATP ADP este sistemul principal pentru transferul gruprilor fosfat n celul, dar i ceilali nucleozidtrifosfai, i anume: GTP, UTP i CTP au rolul de a canaliza energia chimic pe anumite biosinteze specifice. A doua funcie major a NTP i NDP este cea de transportori de energie, energie pe care o nmagazineaz sub form de legturi macroergice. NTP i d NTP sunt precursori bogai n energie n procesul de biosintez enzimatic a ADN i ARN. n acest proces NTP i d- NTP i pierd gruprile pirofosfat terminale, transformndu se n resturi de nucleozid monofosfai, care sunt elemente constitutive ale acizilor nucleici. O alt funcie major a NTP i NDP este cea de transportori energizani de tip coenzim ai anumitor elemente constitutive. De exemplu: UDP este un transportor pentru glucide n procesul de biosintez a polizaharidelor. n toate cele 3 funcii ale NTP i d NTP, energia chimic a legturilor fosfat i este folosit pentru formarea unor legturi covalente noi. Pe lng nucleozid 5 fosfaii descrii, n natur mai exist i nucleotide cu gruprile fosfat n alte poziii. Dou nucleotide foarte importante au un rol cheie n aciunea biochimic a unor hormoni: 3, 5 ciclic adenozin fosfatul (AMP ciclic) i guanozin 3,5 ciclic fosfatul (GMP ciclic).

11

NH2 N N O H2C O H H N N

H O P OH AMPc O OH

H

AMPc se formeaz n celulele eucariote, din ATP prin aciunea unei enzime din membrane celular, adenilat ciclaza, stimulat de anumii hormoni adui pe cale sanguin. AMPc mai este denumit i al doilea mesager, ntruct el transmite i amplific n celul semnalele chimice transmise pe calea sngelui de ctre hormoni, care sunt primii mesageri. ADN ul este format din lanuri de dezoxiribonucleotide legate covalent, iar ARN ul este compus din lanuri de ribonucleotide. Acizii dezoxiribonucleici i acizii ribonucleici prezint o serie de propriti fizice i chimice commune, ntruct n ambele molecule, nucleotidele succesive sunt legate covalent prin puni fosfodiesterice ntre gruparea 5 hidroxil a unei nucleotide i gruparea 3 hidroxil a urmtoarei nucleotide.

12

baz azotat H2C 5' O H H H 3' O O H P O 5' CH2 baz azotat O H H 3' H O H P O ADN O OH

H

HO

13

baz azotat H2C 5' O H H H 3' O O OH P O 5' CH2 baz azotat O H H 3' H O OH P O O OH

H

HO

ARN Astfel catena principal a ADN i ARN const n grupri fosforice alternnd cu radicali de pentoz, legtura fosfodiesteric asigurnd continuitatea covalent. Bazele purinice i pirimidinice din unitile nucleotidice nu fac parte din catena principal, ele formeaz catene distincte n acelai mod n care radicalii R ai aminoacizilor sunt catenele laterale distinctive ale polipeptidelor. Acidul dezoxiribonucleic (ADN) a fost izolat pentru prima dat din celulele i sperma de somon de ctre Friedrich Miesscher (1869). El a denumit produsul izolat nuclein, dat fiind prezena lui n nucleii celulari. De atunci au trecut peste 70 de ani de cercetri pn la definirea complet a elementelor constitutive i a structurii catenei principale a acizilor nucleici. Figura nr.2

14

Moleculele de ADN din diferite celule i virusuri se deosebesc prin raportul dintre cele 4 tipuri de monomeri nucleotidici, prin secvena nucleotidelor i prin masa molecular. Pe lng cele 4 tipuri de baze majore, n anumite tipuri de ADN, n deosebi de origine viral se gsesc cantiti mici de derivai metilai ai acestor baze. Acizii dezoxiribonucleici izolai din diferite organisme i virusuri au dou lanuri dispuse ntr-un aranjament complementar dublu elicoidal. n majoritatea celulelor moleculele de ADN sunt att de mari, nct este greu s le izolm sub form intact. n celulele procariote, care conin un singur cromozom, ntreaga cantitate de ADN este prezent ca unic macromolecul, o singur elice dubl, cu masa molecular de peste 2 x 109. n celulele eucariote, ce conin mai muli cromozomi, exist mai multe molecule de ADN. n bacterii, molecula de ADN care reprezint 1% din greutatea celulei se afl zona nuclear; de obicei ea este ataat printr-un singur punct de un pliu al membranei celulare, numit mezozom. Uneori, n citoplasma celulelor bacteriene se gsesc molecule mici de ADN extramitocondrial; aceste molecule de ADN, care poart doar cteva gene, se numesc plasmide sau epizomi, n funcie de relaia lor genetic cu ADN -ul cromozomial. n celulele eucariote diploide, aproape ntreaga cantitate de ADN se gsete n nucleu, combinat prin legturi ionice cu proteine bazice, numite histone. Pe lng ADN ul din nucleu n celulele eucariote diploide mai gsim cantiti foarte mici de ADN n mitocondrii, care difer de ADN ul nuclear prin bazele coninute i prin masa molecular. Acizii ribonucleici Cele 3 tipuri majore de acizi ribonucleici din celule sunt: ARNm, ARNr i ARNt. Toate cele 3 tipuri de ARN sunt lanuri monocatenare poliribonucleotidice, dar se deosebesc ntre ele prin domenii caracteristice de mase moleculare i de coeficieni de sedimentare. Fiecare dintre cele 3 tipuri majore de ARN exist n forme moleculare multiple. ARNr exist n cel puin 3 forme majore, ARNt exist n 60 de forme, iar ARNm exist n sute i poate mii de forme distincte. Majoritatea celulelor conin de 2- 8 ori mai mult ARN dect ADN. n celulele bacteriene, cea mai mare parte a ARN se afl n citoplasm, dar o anumit cantitate este ataat necovalent de ADN, pe msur ce se formeaz n procesul de transcripie. n celulele eucariote diferitele forme de ARN au o distribuie intracelular distinct.

Figura nr.3

15

ARNm conine doar cele 4 baze majore. El se sintetizeaz n nucleu n procesul de transcripie, prin care secvena bazelor dintr-un lan de ADN cromozomial este copiat enzimatic n lanul de ARNm. O anumit cantitate de ARNm se sintetizeaz i n mitocondrii. Secvena bazelor din lanul de ARNm este complementar celei din lanul de ADN ce se transcrie. Dup transcripie, ARNm trece n citoplasm i apoi la ribozomi, unde servete ca matri pentru ordonarea secvenial a aminoacizilor n procesul de biosintez a proteinelor. ARN ul mitocondrial reprezint doar o mic parte din ARN ul total din celul, dar el se afl n foarte multe forme distincte, care se deosebesc prin masa molecular i secvena bazelor azotate. Fiecare din miile de proteine diferite sintetizate n celula este codificat de ctre un ARNm. ARNm din celulele eucariote se caracterizeaz prin prezena la captul 3 terminal a unei secvene lungi de cca 200 de radicali adenilici, care pare s aib un rol n prelucrarea sau transportul ARNm de la nucleu la ribozomi. ARNt sunt molecule relativ mici, care funcioneaz ca transportori specifici ai cte unei molecule de aminoacizi n procesul de biosintez a proteinelor pe ribozomi. Ei au o mas molecular de 23000 28000 i un coeficient de sedimentare de 4S. Ei conin 75 90 de nucleotide. Fiecare dintre cei 20 de aminoacizi din proteine are cel puin un ARNt coerspunztor, iar unii au chiar mai muli ARNt. De exemplu: n celulele de Escherichia coli exist 5 ARNt diferii pentru transferul leucinei. Mai mult, n celulele eucariote unui anumit aminoacid i corespund ARNt mitocondriali diferii de ARNt citoplasmatici. Moleculele de ARNt prezint cteva trsturi comune. Toate tipurile de ARNt au la un capt al lanului polinucleotidic un acid guanilic terminal, iar la cellalt capt secvena terminal citidil citidil adenil (CCA). Gruparea 5 hidroxil a acidului adenilic terminal este legat de gruparea 3 hidroxil a acidului citidilic precedent print-o punte fosfodiesteric. Gruparea hidroxil liber din acidul adenilic terminal este acilat enzimatic cu aminoacidul specific, formnd aminoacil ARNt. Acest aminoacid este transferat enzimatic la captul lanului polipeptidic n curs de formare pe suprafaa ribozomilor, n procesul de biosintez proteic. ARNr reprezint 65% din masa ribozomilor. El se poate obine din ribozomii de E.coli ca molecule lineare, monocatenare, prezente n 3 forme caracteristice, cu coeficienii de sedimentare de 23S, 16S i respectiv 5S. Aceste 3 forme se deosebesc prin secvena i raportul bazelor. n celulele eucariote, care au ribozomi mai mari dect celulele procariote, exist 4 tipuri de ARNr: 5S, 7S, 18S i 28S. Dei ARNr reprezint o mare parte din ARN celular total, funcia lui n ribozomi nu este nc, bine elucidat. Sinteza proteinelor Procesul de sintez proteic const n polimerizarea aminoacizilor, n celule sau n vitro. ntr-o celul pot exista circa 10000 proteine care au rol esenial n funcionarea i reproducerea celulei i organismului. Biosinteza proteinelor se desfoar n urmtoarele momente. n primul moment are loc transcriptia, care const n sinteza mARN de ctre una dintre catenele de ADN dintr-o gen. Acest mARN are o structur complementar catenei de ADN matrice, reprezentnd o imagine n oglind a acestuia, o transcriere mecanic a codonilor catenei de ADN, respectiv a mesajului genetic, cu simboluri complementare. n al doilea moment are loc translaia care const n migrarea mARN n citoplasma i asocierea mARN cu ribozomii activi n sinteza proteic. Catena de mARN se fixeaz simultan prin absorbie pe mai muli ribozomi la distana ntre ei de 300-350A, formnd poliribozomi. n al treilea moment are loc activarea aminoacizilor, care const n reacia unui aminoacid cu adenozin-trifosfat (ATP) catalizat de aminoacil-ARN sinteza, i formarea de aminoacil-adenilat (aminoacil AMP), care se ataeaz de o molecul de tARN, determinnd apariia unui complex aminoacil-tARN. Acest complex este transportat n locul lui propriu n lanul proteic, determinat de mARN din polizomi. Pe catena mARN din polizom, se vor amplasa, la nivelul fiecrui ribozom, numai acele complexe aminoacil-tARN care, pe bucla central, reprezentnd anticodonul, posed o secven de trei ribonucleotizi complementar 16

codonilor mARN din complexul polizomului. n acest fel aminoacizii sunt legai enzimatic ntr-o ordine impus de ADN care a matriat mARN i care joac un rol direct n biosinteza proteinelor. n al patrulea moment are loc translata, polimerizarea sau asamblarea aminoacizilor. Legtura se realizeaz ntre gruparea COOH a primului aminoacil care reprezint punctul activ al biosintezei progresive, cu gruparea NH2, a celui de al doilea aminoacil, n prezena enzimei peptidpolimeraza, care catalizeaza formarea legaturilor peptidice ntre aminoacizi; ncorporarea aminoacizilor este ireversibil; iau astfel natere lanuri polipeptidice care se elibereaz de polizom, prin translocarea ultimului complex aminoacil-tARN de ultimul ribozom din polizom, cnd acesta a ajuns n urma rotirii la extremitatea matricei mARN de care se detaseaz. Un lant polipeptidic se sintetizeaz ntr-un minut.

Figura nr.4

17

Complexe supramoleculare acizi nucleici - proteine Unii acizi nucleici se afl n celule asociai necovalent cu proteine specifice, formnd complexe supramoleculare. Dintre aceste sisteme acid nucleic proteine, cu structuri i funcii biologice foarte complexe; ribozomii i virusurile sunt cele mai cunoscute. Cele mai complexe sisteme acid nucleic protein sunt probabil cromozomii din celulele eucariote. Ribozomii sunt particule ribonucleoproteice care se gsesc n toate tipurile de celule. Ei sunt eseniali n biosinteza proteinelor. Virusurile sunt structuri subcelulare la limit ntre lumea biotic i abiotic. Virusurile au capacitatea de a se antagoniza atunci cnd intr ntr-o celul gazd specific. Implicaiile medicaleale nucleotidelor Unele nucleotide naturale, precum i derivaii lor obinui prin sintez pot fi utilizate n terapie, fiind utilizate n: chimioterapia bolii maligne, tratamentul hiperuricemiei i gutei, n afeciuni virale, n hipertiroidism sau ca ageni imunosupresori, hipogliceminai, antifungici i antiparazitari. Mecanismul lor de aciune este variat: - nhib enzimele implicate n biosinteza acizilor nucleici, blocnd procesul - nhib enzimele care catalizeaz conversia xantinei n acid uric.

18

III. Proteine Proteinele sunt compui macromoleculari, respectiv biopolimeri rezultai din policondensarea aminoacizilor legai ntre ei prin legturi peptidice. Diferena ntre proteine i polipeptide se face pe baza dimensiunii moleculare, limita de delimitare fiind stabilit arbitrar la o greutate molecular de 8 x 10 Kd. Lanurile de peptide alctuite din sub 10 resturi de aminoacizi se numesc oligopeptide, iar cele de pn la 50 60 de resturi de aminoacizi se numesc polipeptide. Proteinele sunt formate din sute de resturi de aminoacizi, iar masa lor molecular poate urca la sute de mii de daltoni. Aminoacizii Aminoacizii sunt unitile structurale de baz din molecula proteinelor. Aminoacizii conin dou grupri funcionale comune tuturor aminoacizilor: o grupare aminic i o grupare carboxilic. Capacitatea unui aminoacid de a se condensa cu ali aminoacizi pentru a forma peptide este dependent de propritile chimice ale acestor dou grupri funcionale. Cea mai important proprietate a aminoacizilor este aceea de a servi ca subuniti monomerice pentru proteine, dar ei prezint i alte roluri importante pentru celul. De exemplu, glutationul este o tripeptid cu funcii importante, alte peptide mici au funcii de hormoni, sau n unele organisme au rol de antibiotice. Acidul glutamic are rol de neuro transmitor. Aminoacizii sunt precursorii unei variti de biomolecule (de exemplu: hitidina pentru histamin). Unii aminacizi sunt metabolizai i utilizai pentru producerea de glucoz (gluconeogenez). Deoarece nu exist rezerve de aminoacizi, cu excepia celor implicai n structura proteinelor, atunci cnd gluconeogeneza are nevoie de aminoacizi, acetia sunt eliberai prin decompunerea proteinelor. Structura aminoacizilor n proteinele tuturor speciilor procariote i eucariote a fost identificat un set de cca 20 de aminoacizi, marea majoritate aprinnd seriei sterice L. Toi aminoacizii, cu excepia prolinei, prezint aceeai strucutur general n sensul c atomul de carbon - este legat de o grupare COOH, de una NH2 i de un rest R rspunztor de proprietile diferite ale diferiilor aminoacizi. Formula general a unui aminoacid: R CH COO-

NH3+ n toi - aminoacizii, cu excepia glicinei, carbonul este optic activ. Izomerii posibili aparin seriei D sau L. S-a constatat c toi izomerii existeni n mod natural n constituia proteinelor aparin seriei sterice L. Sarcinile aprute n formulele aminoacizilor sunt cele care apar la pH 6-7. Ca urmare, la pH 6-7, un aminoacid poate s aib caracter acid sau bazic. Clasificare aminoacizilor Din punct de vedere structural aminoacizii se pot clasifica astfel: - aminoacizi alifatici HC 2 COOH H3C CH COOH

NH2 glicina ( glicocol, Gly) H3C CH CH COOH H3C

NH2 alanina (Ala) CH CH3 leucina (leu) CH2 CH NH2 COOH

CH3 NH2 valina (val) 19

H3C

CH 2

CH

CH NH2

COOH

CH3 Izoleucina (ile) -

aminoacizi hidroxilai

HO

CH2

CH NH2

COOH

H3C

CH OH

CH NH2

COOH

serina (ser) - aminoacizi cu sulf HS CH2 CH COOH NH2 cisteina (cys) aminoacizii dicarboxilici i amidele lor CH2 CH NH2 H2N CO CH2 COOH

treonina (thr)

H3C S

CH2

CH2

CH NH2

COOH

metionina (met)

HOOC

acidaspartic(asp) CH COOH NH2

asparagina ( asn) HOOC CH2 CH2 CH NH2 acid glutamic (glu) HN 2 CO CH2 CH2 CH NH2 glutamina (gln) aminoacizi cu dou grupri bazice COOH COOH

20

H2N CH2 lisina (lys) H2N C NH arginina (arg)

CH2

CH2

CH2

CH NH2

COOH

NH CH2

CH2

CH2

CH COOH NH2

CH2 N NH

CH NH2

COOH

histidina (his) aminoacizi aromatici

CH2

CH NH2

COOH

fenilalanina (phe) HO CH2 CH NH2 tirozina (tyr) CH2 N H triptofan (trp) COOH N H prolina (pro) 21 n funcie de polaritatea radicalului, aminoacizii se clasific, astfel: aminoacizi neutri: Gly,Ala, Ser, Cys, Thr, Asn, Gln care au radicalul polar, dar lipsit de sarcin electric la pH=7. aminoacizi hidrofili, cu caracter acid: Asp, Glu, Tyr care sunt aminoacizi ncrcai negative la pH fiziologic. aminoacizi hidrofili cu caracter bazic: Arg, Lys, His aminoacizi care la pH fiziologic sunt CH NH2 COOH

COOH

ncrcai cu sarcin pozitiv. - aminoacizi hidrofobi: Val, Leu, Ile, Met, Pro, Phe, Trp. Exist proteine care pe lng aceti 20 de aminoacizi eseniali sau de baz, conin i ali aminoacizi. Acetia pot s ia natere prin modificri ulterioare sintezei lanului polipeptidic, determinnd astfel caracteristici noi ale activitii biologice. Exemplu: - acetilarea captului N-terminal, crete rezistena la degradare - prin hidroxilarea resturilor de prolin i lizin se formreaz: hidroxiprolina i hidroxilizina, cu rol n stabilizarea fibrei de colagen - carboxiglutamatul are legtur cu aciunea vitaminei K - fosforilarea resturilor de: Ser, Thr, Tzr, se folosete ca mecanism de reglare a multor procese celulare. o Ali aminoacizi modificai se ntlnesc n structura unor peptide biologic active. Pe lng aminoacizii prezeni n proteine, exist aminoacizi, care liberi sau n combinaii ndeplinesc funcii importante n metabolism. De exemplu: - alanina, din stuctura coenzimei A i a unor peptide - homoserina i homocisteina sunt intermediari metabolici - citrulina i ornitina apar n biosinteza ureei - acidul - aminobutiric (GABA) este un mediator chimic nervos - 3,4 dioxifenilalanina (DOPA) este precursor al adrenalinei - acidul p- aminobenzoic intr n structura acidului folic. Proprietile aminoacizilor Aminoacizii sunt substane solide, cristaline i au puncte de topire sau de descompunere peste 2000C. Ei sunt mult mai solubili n ap dect n solveni nepolari. n reeaua cristalin, moleculele de aminoacizi sunt atrase prin fore electrostatice. Dac aminoacizii ar cristaliza ntr-o form neionic, datorit atraciei Van der Waals, atunci ar avea puncte de topire mult mai sczute. Toate acestea duc la concluzia c aminoacizii se gsesc n soluii apoase i n reeaua cristalin sub form de ioni dipolari sau amfioni. H2N R COOH HN 3+

R

COO-

Datorit caracterului lor amfoter, aminoacizii formeaz sruri att cu acizii ct i cu bazele. HN+

R R

COO- +H+ COO+ H2O

HN 3

+

R R

COOH COO- + H2O

HN 3

+

HN 2

Deci, n mediu acid, aminoacizii se comport ca baze, iar n mediu bazic se comport ca acizi. Datorit faptului c aminoacizii posed grupri carboxilice i grupri bazice, ei prezint proprieti datorate gruprilor carboxil i proprieti datorate gruprii aminice precum i proprieti determinate de ambele grupri.

22

PEPTIDE Cea mai important proprietate a aminoacizilor, este aceea de condensare, care duce la formarea de peptide. Peptidele se formeaz prin eliminarea unei molecule de ap ntre gruparea carboxil a unui aminoacid i gruparea aminic a unui alt aminoacid.H2N CH R1 COOH + H2N CH R2

COOH

H2N CH R1

CO

NH

CH COOH +H2O R2

Prin convenie, un lan polipeptidic se scrie ncepnd cu extremitatea ce are gruparea aminic liber, numit capt N- terminal i se ncheie cu captul C terminal, reprezentat de gruparea carboxilic a ultimului aminoacid. H2N CH R1 CO NH CH R2 CO ....... NH CH COOH Rn

n unele cazuri aceste capete sunt derivatizate. Oligopeptidele se clasific n di-, tri-, tetrapn la decapeptide, n funcie de numrul de resturi de aminoacizi prezeni n structura peptidei. Ca exemple de peptide cu rol biologic cunoscut amintim: - Dipeptidele: carnozina i anserina, cu rol n metabolismul muscular. CH2 N N R CH NH COOH CO CH 2 CH2 NH2

R = H carnozina = CH3 anserina - Tripeptide. Glutationul este o tripeptid format acid glutamic, cistein i glicin, motiv pentru care se numete i - glutamil-cisteinil-glicin.

HOOC CH NH2

CH2

CH2

CO

NH

CH CH2 SH

CO

NH

CH2

COOH

Glutationul se ntlnete n celulele animale, unde se gsete n concentraie ridicat. El funcioneaz ca un sistem redox i servete n transportul intercelular de aminoacizi.

23

2

Glu

Cys SH

Gly

- 2H +2H

Glu

Cys S S

Gly

(GSH) glutation redus

Glu

Cys

Gly

(GSSH) glutation oxidat

Interconversiunea formelor reduse i oxidate are loc sub aciunea unor enzime i servete n biosinteza eicosanoizilor, a dezoxiribonucleotidelor, n biotransformarea insulinei circulante, precum i n alte procese. Deoarece glutationul redus protejeaz gruprile tiol ale proteinelor, el este esenial pentru integritatea eritrocitului i deasemeni pentru meninerea Fe din hemoglobin n stare bivalent. Mecanismul implicat privete neutralizarea potenialului agresiv al peroxizilor rezultai n metabolismul aerob. glutation peroxidaza

2 GSH + R- O- OH

H GSSH + R- OH + 2O

Formarea unor astfel de peroxizi este favorizat de un numr de medicamente, la care pot s apar ca efecte adverse anemia hemolitic i methemoglobinemia. O alt tripeptid este hormonul de eliberare a tirotropine (TRH) de origine hipotalamic, care are ambele capete derivatizate. TRH se mai numete: piroglutamil- histidil- prolinamida. Glutamatul N-terminal apare ciclizat sub forma acidului piroglutamic, iar captul C terminal este reprezentat de prolinamid. Exist dou grupe de oligopeptide formate din 7- 10 resturi de aminoacizi cu aciune asupra musculaturii netede, care rezult din hidroliza enzimatic a unor proteine plasmatice. Angiotensinele provin din angiotensigen, o protein format din cca. 400 de aminoacizi. Angiotensinogen renina Angiotensina I (decapeptid) (proteina plasmatic) captopril enzima de conversie Angiotensina II (octapeptid) aminopeptidaza Angiotensina III (heptapetid) Angiotensinele acioneaz asupra vaselor, mai intens pe artere stimulnd secreia de aldosteron i eliberarea de prostaglandine. Angiotensina II este socotit cel mai puternic agent presor present n circulaia general. Aceasta pare a fi implicat n patogeneza hipertensiunii arteriale eseniale, dei sunt cazuri cu activitate reninic normal sau chiar sczut. Inhibitorii 24

sistemului renin- angiotensin, n care rolul central l are enzima de conversie, se utilizeaz n tratamentul hipertensiunii arteriale: de exemplu captoprilul. Un alt grup de polipetide este reprezentat de kininele plasmatice, formate din kininogeni sub aciunea enzimelor numite kalikreine. Plasmakininele, considerate i hormoni locali, produc vasodilataie arterial (efect hipotensor), dar determin contracia vaselor, musculaturii uterine, a intestinului i bronhoconstricie. Alte oligopeptide cu activitate biologic sunt encefalinele i hormonii neurohipofizari. Un alt exemplu de polipeptide naturale este reprezentat de vasopresin i oxitocin, care sunt peptide ciclice alctuite numai din aminoacizi. Aceste dou polipeptide au o structur foarte apropiat, fiind alctuite din 9 resturi de aminoacizi, dar prezint funcii fiziologice diferite. Vasopresina are efect antidiuretic, iar oxitocina acioneaz asupra musculaturii netede a uterului, producnd contracia uterului. Oxitocina stimuleaz i contracia musculaturii din jurul alveolelor mamare, determinnd astfel eliminarea laptelui din canalele glandei mamare, avnd aciune lactagog.

25

PROTEINE Proteinele i funciile lor biologice. Proteinele sunt cele mai rspndite molecule organice din celul. Masa molecular a proteinelor este foarte mare, dar prin hidroliz acid toate se transform n compui organici simpli, i anume L-aminoacizi. Proteinele se mpart, n funcie de compoziia lor n dou clase principale: - proteine simple - proteine conjugate Proteinele simple sunt acelea care prin hidroliz formeaz numai aminoacizi i nici un alt compus organic sau anorganic. Proteinele conjugate sunt acelea care prin hidroliz pun n libertate pe lng aminoacizi i ali compui organici sau anorganici. Partea conjugat a proteinei, care nu este aminoacid se numete grupare prostetic. n funcie de natura gruprii prostetice, proteinele conjugate se mpart n:Tipul proteinei - nucleoproteine - lipoproteine - glicoproteine Gruparea prostetic acizi nucleici: - ADN - ARN fosfolipide glucide: - hexozamine - galactoz - manoza - acid sialic fosfai esterificai cu radicali ai sernei hem metale FAD Locul n care se gsesc ribozomi virusul mozaicului tutunului lipoproteinele plasmatice lipide membranare globuline

- fosfoproteine - hemoproteine - flavoproteine - metaloproteine

cazeina hemoglobina citocromul C succinat dehidrogenaza feritina

Masa molecular a proteinelor se poate determina prin metode fizice i poate fi cuprins ntre 5000 i cteva milioane. Exemplu: - insulina: greutatea molecular de 5700 daltoni - virusul mozaicului tutunului: greutatea molecular de 40000000 de daltoni. Diversitatea funcional a proteinelor Proteinele ndeplinesc n organism multiple funcii, dintre care amintim urmtoarele: 1. Enzimele sunt proteine ce catalizeaz diverse reacii biochimice. Exemplu: hexokinaza, lactat dehidrogenaza 2. Proteinele de rezerv Exemplu: - ovalbumina proteina din albuul de ou - cazeina proteina din lapte - feritina proteina de depozitare a Fe n splin - zeina proteina din semine de porumb - gliadina proteina din gru 3. Proteine de transport Exemplu: 26

- hemoglobina proteina ce transport oxigenul n sngele vertebratelor - hemocianina proteina ce transport oxigenul din sngele nevertebratelor - mioglobina proteina ce transport oxigenul n celulele musculare - albumina seric proteina ce transport acizii grai n snge - 1-lipoproteina proteina ce transport lipidele n snge - ceruloplasmina proteina ce transport cuprul n snge Aceste proteine sunt capabile s lege i s transporte pe calea sngelui anumite tipuri de molecule. 4. Proteinele contractile sunt proteine cu rol esenial n fenomenul de contracie i n micare. Exemplu: - actina filamentele subiri din miofibrile - miozina filamentele groase din miofibrile - dineina proteinele din cili i flageli. n muchi, actina i miozina sunt aezate n iruri paralele, alunecnd unele pe lng altele n timpul contraciei. 5. Proteinele cu rol de protecie n sngele vertebratelor Exemplu: - anticorpii formeaz compleci cu proteinele strine - sistemul complement formeaz complexe cu anumite sisteme antigen-anticorp. - Fibrinogenul precursor al fibrinei n coagularea sngelui - Trombina particip la procesul de coagulare. Unele proteine au rol de aprare sau de protecie. Proteinele sanguine (trombina i fibrinogenul) particip la coagularea sngelui oprind astfel pierderile de snge n sistemul vascular al vertebratelor. Cele mai importante proteine cu rol de aprare a organismului sunt anticorpii sau globulinele imune, care se combin cu proteinele strine sau cu alte substane strine intrate ntmpltor n organism, neutralizndu-le. 6. Toxinele Exemplu: - toxina din Clostridium botulinum - toxina difteriei - veninul de arpe - ricinul - gossipina Toxinele sunt substane foarte toxice pentru organismul animalelor superioare, chiar i n cantiti foarte mici. 7. Hormoni Exist proteine care funcionez ca i hormoni. Exemplu: - insulina este secretat de anumite celule specializate din pancreas i regleaz metabolismul glucozei. - Hormonul adrenocorticotrop: hormonul de cetere sau somatotropina este un hormon al glandei hipofizare anterioare, care regleaz sinteza corticosteroizilor. 8. Proteinele structurale Exist o clas de proteine care servesc ca i elemente structurale. Exemplu: - proteinele din nveliul viral - glicoproteinele - - keratina - sclerotina - fibroina 27

-

colagenul elastina mucoproteinele.

Anticorpii i rspunsul imun. Specificitatea de specie a proteinelor. Anticorpii sau imunoglobulinele au o importan foarte mare n demonstrarea faptului c proteinele sunt specifice pentru fiecare specie. Moleculele de anticorpi apar n serul sanguin sau n anumite celule de vertebrate ca rspuns la introducerea unei proteine sau a unei alte macromolecule strine acelei specii. O astfel de macromolecul strin speciei respective se numete antigen. Moleculele specifice de anticorpi produse n acest mod se pot combina cu antigenul care a determinat formarea lor pentru a forma complexul antige-anticorp. Aceast reacie, numit rspuns imun, este baza ntregului domeniu al imunologiei. Imunitatea fa de o anumit boal infecioas poate fi adesea realizat prin injectarea unei cantiti foarte mici de componeni macromoleculari din microorganisme sau virusuri care provoac boala respectiv. Ca rspuns la antigenul strin se formeaz anticorpul specific, sau o imunoglobulin, care rmne n snge un timp ndelungat. Dac microorganismul va ptrunde mai trziu n snge sau n limf, aceti anticorpi specifici l vor putea inactiva sau chiar omor prin combinare cu componenii lor antigenici. Rspunsul imun este dat numai de vertebrate. Anticorpii sunt foarte specifici pentru moleculele strine care le produc. Un anticorp format de un iepure injectat cu ou de gin, de exemplu, se va combina cu acesta, dar nu i cu alte proteine, cum ar fi hemoglobina uman. Mai mult ei sunt specifici pentru structura tridimensional a albuminei native din oul de gin, astfel nct dac aceasta este denaturat prin nclzire sau prin alt mijloc, cu deplierea lanurilor polipeptidice componente sau este modificat chimic, anticorpii nu se vor mai combina cu ea. De aici putem trage urmtoarele concluzii: 1. Proteine cu funcii diferite aparinnd unei singure specii determin formarea unor anticorpi diferii. Astfel cnd se imunizeaz un iepure cu hemoglobin de cal, anticorpii vor precipita hemoglobina de cal i nu celelalte proteine de cal. 2. Proteine omoloage de la specii diferite nu sunt identice imunologic. 3. Specificitatea anticorpilor reflect relaia filogenetic. Exemplu: Proteinele omoloage a speciilor foarte nrudite sunt mult mai asemntoare ntre ele dect ale speciilor foarte ndeprtate. Astfel, anticorpii produi de iepure fa de hemoglobina de cal reacioneaz cel mai bine cu hemoglobina de cal. Ei reacioneaz, de asemenea puternic cu hemoglobina altor specii nrudite cu calul (zebra, vaca, porcul sau alte copitate) dar sunt mult mai puin reactivi cu hemoglobina roztoarelor, psrilor sau amfibienilor. Astfel cu ct dou specii sunt mai apropiate cu att mai asemntoare sunt i secvenele de aminoacizi ale proteinelor lor omoloage. Deci, secvena de aminoacizi ale proteinelor omoloage poate da informaii preioase despre evoluia diferitelor organisme i pentru legtura lor filogenetic.

28

Structura proteinelor Lanurile polipeptidice ale proteinelor se pliaz n diferite moduri, att n cadrul propriului lan, dar i ntre lanurile vecine, adic intracatenar i intercatenar. Acest mod de pliere este esenial pentru activitatea biologic a proteinelor i aceast organizare complicat este cea care trebuie conservat pe parcursul procedurilor implicate n purificarea proteinelor. Dei mult timp s-a considerat c modurile de pliere ale lanurilor polipeptidice sunt determinate numai de secvena aminoacizilor din lan, astzi s-a stabilit c proteinele avnd aceeai secven a aminoacizilor pot exista n forme diferite de mpachetare i c astfel de plieri pot fi influenate de prezena altor proteine. Structura proteinelor a fost imaginat ca avnd 4 nivele de organizare, i anume: structura primar, secundar, teriar i cuaternar.

Fig. . Principalele tipuri de structuri ale proteinelor

29

Structurile proteice sunt stabilizate de dou tipuri de legturi puternice: legtura peptidic i puntea disulfidic, precum i de trei tipuri de legturi slabe. Legtura disulfidic se stabilete ntre dou resturi de cistein, aparinnd sau nu aceluiai lan polipeptidic i este la fel de rezistent ca i legtura peptidic la aciunea agenilor denaturani uzuali ai proteinelor. Aceast legtur poate fi distrus prin oxidare cu acid performic sau prin reducere cu betamercatoetanol. Legturile disulfidice sunt prezente de obicei n proteinele extracelulare i aproape c lipsesc din cele intracelulare. Legturile slabe sunt reprezentate n general de legturile necovalente, i anume: legturi de hidrogen, ionice i hidrofobe. Legturile de hidrogen se stabilesc ntre grupri CO i NH aparinnd unitilor peptidice diferite, aflate n poziie adecvat.

30

R C O H N CH CH N H legtur de hidrogen O C

R Forele electrostatice se formeaz prin atracia gruprilor cu sarcin opus ce aparin aminoacizilor ionizai. Exemplu: - ntre un aminoacid dicarboxilic i gruparea aminic a lizinei. Un rol semnificativ n meninerea structuri l au deasemeni interaciunile hidrofobe prin care radicalii nepolari ai aminoacizilor hidrofobi tind s se asocieze. Proteinele n stare natural au o structur tridimensional unic, ce se exprim prin conformaia, care i determin de astfel i funcia. Structura primar n structura oricrei proteine sau peptide se distinge un element comun, reprezentat de axul covalent, care se formeaz prin repetarea gruprii peptidice i o parte a variabilei reprezentat de radicalii aminoacizilor constituieni. H2N CH R1 CO NH CH R2 CO ....... NH CH COOH Rn

Structura primar este definit ca secvena resturilor de aminoacizi ce deriv din policondensarea lor prin legturi - peptidice. Exist mai multe argumente n favoarea acestei structuri, dintre care amintim: - proteinele au puine grupri amino- i carboxil titrabile, iar numrul lor crete dup hidroliz - dau uor reacia biuretului - sinteza de proteine este posibil excusiv prin interaciuni peptidice - proteinele sunt substrate pentru peptidaze - identificarea aminoacizilor componeni prin difracie cu raze X i spectroscopie n infrarou (IR). Cunoaterea structurii primare a proteinei const n stabilirea naturii radicalilor, n ordinea nlnuirii i localizarea eventualelor puni disulfidice i stabilirea tuturor conexiunilor dintr-un lan polipeptidic. Pentru determinarea compoziiei, proteina este supus hidrolizei n cataliz acid, bazic sau enzimatic, urmat de separarea i identificarea aminoacizilor rezultai. Hidrolizatul obinut n urma reaciei de hidroliz este analizat prin cromatografie sau alte tehnici automatizate. Dup separarea aminoacizilor, cuatentificarea lor se face prin reacia de culoare cu ninhidrina sau fluoresceina, care sunt reacii de mare sensibilitate. Pentru determinarea succesiunii aminoacizilor dintr-un lan se folosesc tehnici manuale i automate bazate pe procese chimice i enzimatice. Dac catena polipeptidic este relativ scurt, se identific mai nti capetele N i C terminale i apoi secvena cuprins ntre ele. Pentru lanuri mai lungi, dup identicarea capetelor N i C terminale, fragmentul rmas ntre ele se scindeaz n fragmente de pn la 50 de resturi, care se separ prin cromatografie sau electroforez. Se determin structura primar a fiecrui fragment i apoi se potrivesc n ordinea lor iniial, fcndu-se reconstituirea lanului. Numrul 31

de grupri terminale gsite ofer informaii asupra numrului de lanuri ce compun proteina. Captul N terminal se poate identifica prin marcarea sa cu un compus care formeaz o legtur covalent, stabil n condiiile n care legturile peptidice sunt hidrolizate. n acest scop s-au utilizat 2,4 dinitrofluorbenzenul, clorura de Dansyl i clorura de Dabsyl. O alt metod enzimatic folosete aminopeptidaza, care hidrolizeaz legtura peptidic n care este cointeresat aminoacidul N terminal. Astfel, enzima va detaa pe rnd cte un aminoacid ce ajunge n poziie terminal. Dezavantajul acestei metode este c aciunea enzimei este foarte lent n cazul unor aminoacizi. Captul C terminal poate fi stabilit prin aciunea carboxipeptidazei, enzim ce scindeaz lanul peptidic cu un rest, ncepnd dinspre aminoacidul cu gruparea carboxilic liber. Dup un timp de reacie se separ i se identific aminoacizii eliberai. Odat ce fragmentele rezultate din lanul iniial au structura primar descifrat, urmez rezolvarea succesiunii lor n lan, pentru care se folosete tehnica peptidelor suprapuse. Lanul peptidic original se scindeaz prin dou sau mai multe metode diferite de hidroliz specific i din compararea seturilor de peptide obinute se deduce integral secvena iniial. Pentru proteinele mari, cu peste 1000 de resturi de aminoacizi, secvenarea lanului devine o operaie dificil i care cere mult timp. A aprut ns, tehnologia ADN-ului recombinat, care a permis o nou modalitate de abordare experimental n chimia proteinelor. Semnificaia structurii primare Prima protein a crei structur primar a fost identificat este insulina. S-a dovedit c structura primar a proteinelor este determinat genetic i c proteinele din toate organismele sunt sintetizate printr-un mecanism comun.S-a constatat c secvena de aminoacizi este veriga ntre mesajul genetic cuprins n ADN i structura tridimensional responsabil de funcia biologic a proteinei. Cunoaterea secvenei de aminoacizi aduce informaii eseniale pentru descifrarea conformaiei i mecanismului de aciune, cu privire la nrudirea proteinelor, n legtur cu evoluia filogenetic a speciilor precum i cu domeniul patologiei moleculare. Activitatea biologic a unei proteine poate depinde direct i indirect de structura ei primar. Modificri minore, ca nlocuirea, pierderea sau inseria unui aminoacid se traduc biochimic prin polimorfismul proteinelor n cadrul speciei conferind individualitate organismelor prin specificitatea de specie i prin boli genetice consecutive alterrii sau pierderii funciei. Structura secundar a proteinelor Structura secundar a proteinelor se refer la dispunerea spaial a resturilor de aminoacizi nvecinai n secvena liniar, ce poate fi ordonat sau dimpotriv cu puine neregulariti. Prin difracie cu raze X a fost confirmat existena conformaiilor ordonate i au fost observate structuri ce se repet periodic. Tot prin tehnica cristalografic cu raze X a fost stabilit caracterul planar, rigid al legturii peptidice, datorat conjugrii.

Figura . Coplanaritatea celor 4 atomi Consecinele formrii acestui sistem puternic conjugat sunt coplanaritatea celor 4 atomi, ceea ce presupune imposibiliatea rotirii i existenei formelor cis i trans. S-a observat c izomerul trans este favorizat, deoarece este mai srac n energie. Scheletul lanului polipeptidic apare, deci ca o succesiune de planuri rigide unite prin atomii de C ai aminoacizilor constitutivi. Dou treimi dintre atomii lanului poilpeptidic se afl n poziii fixe unul fa de altul, dar de o parte i de alta a fiacrei legturi peptidice exist o libertate de micare. Astfel 2 planuri succesive se pot roti n jurul aceluiai C. Prezena unor radicali mai mult sau puin voluminoi va impune amplitudinea rotaiilor, 32

astfel c unghiurile nu pot avea valori ntmpltoare, ci sunt caracteristice diferitelor tipuri de structuri secundare. Structura secundar prezint 2 modele, i anume: modelul -helix i foaie pliat. Modelul -helix Modelul -helix reprezint un tip de structur secundar ce presupune ca lanul s se nfoare strns pe o direcie spiralat, formnd un cilindru cu interiorul aproape plin, din care radicalii aminoacizilor apar nt-o dispunere helicoidal. Figura . Modelul de -helix Ca sens de rsucire n proteine a fost identificat helix pe dreapta. Stabilitatea helixului este meninut prin legturi de H ce se formeaz ntre gruprile carbonil i aminice din lanul spiralat aflate fa n fa la o distan adecvat. La -helix fiecare aminoacid avanseaz spirala cu 1,5A0 la o rotire de 1000, pe fiecare spiral existnd 3,6 resturi, deci pasul spiralei este de 5,4A0. Aceste dimensiuni arat formarea legturii de H ntre gruprile CO i NH din cadrul lanului polipeptidic. Exist unii aminoacizi care sunt nefavorabili structurii de -helix. Acetia sunt aminoacizi ce stabilizeaz structura de -helix. Exemplu: - prolina poate s rup spirala. Aminoacizii cu resturi laterale voluminoase (arg, ile, lys, asp, glu) destabilizeaz helixul prin interferne fizice sau electrostatice. Coninutul de -helix n proteine cu structur spaial este variabil. Lungimea i repartizarea segmentelor de -helix depinde de distribuia resturilor favorabile sau destabilizatoare n lungul lanurilor. n mioglobin i hemoglobin apare ca motiv structural major, iar n altele lipsete chimotripsina. La majoritatea proteinelor se gsete ca helix singular pe distane scurte (40 A 0), rar pe zone extinse de 1000A0. Dou sau cteva -helixuri se pot mpleti ca uviele unui nur, aa cum apar n proteinele fibroase: -keratina din pr, miozina, fibroina, care ndeplinesc un rol mecanic de formare a mnunchiurilor rezistente de fibre.

33

Moelul sau foia pliat Structura de foaie pliat a fost studiat tot de Pauling i Corey, curnd dup -helix, de aceea au numit-o structura . Cele 2 modele difer n primul rnd prin faptul c lanul polipeptidic n conformaia este mai relaxat, fiind aproape complet extins. Distana axial ntre dou resturi succesive este de 3,5A0 fa de 1,5A0 n -helix, cu o periodicitate decorespunznd la cca 7A0. Lanurile polipeptidice sunt aezate n foi pliate, care sunt legate ntre ele prin legturi de hidrogen. Radicalii aminoacizilor se situeaz deasupra i dedesubtul planului foii. Dac sensul de desfurare a lanului n poriunile adiacente coincide, foaia este numit paralel. Aranjamentul alternativ n foaia antiparalel este favorabil, succesiunea gruprilor CO i NH fiind complementare.

Figura nr.. Strucura de foaie pliat. Aminoacizi mici: gly, ala, avantajeaz foaia pliat, iar cei cu radical mare sau cu sarcin stnjenesc aranjamentul. Ca i modelul de -helix, structura se ntlnete n multe proteine globulare sau fibroase. Asocieri de lanuri paralele apar n fibroina (mtase) i antiparalele apar n -keratina. Un exemplu de protein fibrilar prezent la animlaele superioare este colagenul din esutul 34

conjunctiv, fiind cea mai rspndit protein dintre proteinele vertebratelor superioare. Cu ct un animal este mai mare i mai greu, cu att proporia de colagen este mai mare. Fibrele de colagen sunt aranjate n moduri diferite, depinznd de sarcina biologic pe care o are de ndeplinit proteina. Structura teriar a proteinelor Structura teriar a proteinelor reprezint aranjamentul spaial general al moleculei, rezultat prin asocierea dintre diferite regiuni ale aceluiai lan, a cror structur secundar poate sau nu varia. Aranjamentul spaial al proteinelor s-a studiat cu raze X. Printre proteinele globulare ale cror structur teriar este binecunoscut sunt: mioglobina, hemoglobina, lizozomii, ribonucleaza, citocromul c, lactat dehidrogenaza. Reprezentantul clasic al structurii teriare este mioglobina. Mioglobina este o protein globular relativ mic, care conine un singur lan polipeptidic format din 153 resturi de aminoacizi, a cror secven nc nu se cunoate. Mioglobina conine o feroprotein, sau hem, grupare identic cu cea a hemoglobinei, fiind i ea capabil s se oxigeneze i s se deoxigeneze. Mioglobina se gsete n celulele muchilor scheletici i este deosebit de abundent la mamiferele acvatice, cum ar fi: balena, foca sau morsa, a cror muchi sunt att de bogai n mioglobin nct sunt colorai n brun nchis. Scheletul moleculei de mioglobin este format din opt segmente aproximativ drepte, unite prin poriuni curbate. Fiecare segment drept este un -helix, cel mai lung fiind constituit din 23 de aminoacizi, iar cel mai scurt este format din numai 7 aminoacizi i toi au sensul de rsucire spre dreapta. Aceste regiuni - helicoidale reprezint 70% din aminoacizii din molecul. Dei structura mioglobinei pare neregulat i asimetric, ea nu este deloc ntmpltoare. Toate moleculele de mioglobin au aceeai configuraie.

Figura nr. . Structura mioglobinei Alte aspecte structurale legate de structura mioglobinei sunt urmtoarele: 1. Molecula este foarte compact, n interiorul ei rmne spaiu pentru patru molecule de ap. 2. Toate gruprile R polare ale resturilor de aminoacizi sunt localizate pe suprafaa extern a moleculei i sunt hidratate. 3. Aproape toate gruprile R nepolare sau hidrofobe se afl n interiorul moleculei, ferite de expunerea la ap. 4. Resturile de prolin se gsesc numai n zonele de curbur, care conin, deasemenea aminoacizi care nu formeaz cu uurin -helix, de exemplu: izoleucina i serina. 5. Conformaia de ansamblu a lanului polipeptidic este aparent aceeai la mioglobina tuturor speciilor speciilor studiate, dei ele difer oarecum n compoziia de aminoacizi. Astfel, 35

resturile constante de secven pot fi implicate n determinarea poziiei curburilor i a direciei segmentelor drepte. Ribonucleaza, este o enzim pancreatic ce depolimerizeaz molecula de ARN i exemplific un model diferit de mpachetare tridimensional a lanului. Catena ei este format din 124 de aminoacizi i este organizat n proporie de 40% ca foaie pliat antiparalel, 15% n -helix, restul lanului gsindu-se sub form de bucle. n structura teriar forma general a moleculei amintete de cochilia unui melc, la a crei stabilitate contribuie i 4 puni disulfidice. Structura cuaternar Structura cuaternar apare la proteinele alctuite din dou sau mai multe lanuri polipeptidice care se asociaz formnd o unitate de sine stttoare, cu form spaial bine definit i posednd o anumit activitate biologic. Structura cuaternar se refer la felul, numrul i aranjamentul lanurilor polipeptidice ncluznd i natura contactelor dintre ele. Cele mai multe proteine oligomer sunt formate dintr-un numr mic i par de lanuri, care se numesc subuniti sau protomeri. Subunitile identice sau diferite au fiecare structura sa spaial; ele se pot aeza succesiv pe direcie liniar, circular sau mai compact suprapuse n forme geometrice diferite. Aceste posibiliti de aranjare se refer la protomeri identici sau foarte puin diferii. Ansamblul prezint simetrie, suprafeele de contact sunt complementare, sugernd gradul nalt de specificitate al structurii cuaternare. Monomerii realizeaz interaciuni slabe: (legturi saline, legturi de hidrogen, fore Wan der Waals, legturi hidrofobe), proteina putnd astfel disocia reversibil. Lanurile izolate sunt lipsite de activitate, funcia fiind rezultatul ansamblului cu structur cuaternar. Exemple de proteine cu structur cuaternar: - creatin kinaza, lactat dehidrogenaza, glutamat dehidrogenaza, enzime, proteine neenzimatice: hemoglobina , imunoglobulina G. Alte exemple de proteine cu structur cuaternar sunt enzimele allosterice. Noiunea de structur cuaternar se poate extinde i la unele heteroproteine. Printre cele mai simple proteine oligomere este hemoglobina, care este format din 4 lanuri polipetidice. Hemoglobina conine 2 lanuri formate din 141 de resturi de aminoacizi i 2 lanuri formate din 146 de resturi de aminoacizi; fiecare dintre acestea avnd ataat printr-o legtur necovalent cte un radical hem. Molecula a fost studiat n forma sa oxigenat, care are o structur sferic, compact, cu dimensiuni de: 6,4/5,5/5,0mm. n hemoglobin, ntre cele 2 lanuri , ca i ntre cele dou lanuri exist foarte puine contacte, n schimb, numeroase grupri R fac legtura ntre perechile de lanuri care nu sunt asemenea.

36

Figura nr.. Structura hemoglobinei Un inters deosebit l prezint aezarea pe fiecare subunitate a cte uneia dintre cele 4 grupri hem, care leag cele 4 molecule de oxigen. Aceste grupri hem, molecule plane, n care atomii de fier formeaz compleci de coordinare plan-ptrai, sunt destul de ndeprtate ntre ele i sunt situate la anumite ungliuri unele de altele. n molecula hemoglobinei rmne o cavitate cental, mrginit de grupri cu radical R polare.

Figura nr.. Formarea hemoglobinei

n sngele uman adult s-au identificat trei hemoglobine a cror prezen este constant,i anume hemoglobinele A1, A2 i F. Rolul fiziologic al hemoglobinei A2 nu este bine definit nc, iar n ceea ce privete hemoglobina F fetal aceasta reprezint un tip de hemoglobin adaptat pentru condiiile de oxigenare din uter. Dup natere hemoglobina F este nlocuit cu hemoglobina A1. Hemoglobina are proprietatea de a accepta oxigenul , proprietate dublat de posibilitatea de 37

a l transporta organism. Acest lucru sete posibil datorit structurii tetramerice ce permite att acceptarea unei cantiti mari de oxigen n plmn, ct i posibilitatea de eliberare a acestuia n mod treptat, n funcie de presiunea de oxigen din esutul respectiv. Legarea oxigenului de hemoglobin se face la nivelul celor 4 atomi de fier coninui n cele 4 molecule de hem ale lanurilor i . Fierul din hemoglobin nu i schimb valena n urma fixrii oxigenului el rmne deci sub form de ion feros. Ia natere astfel oxihemoglobina, compus labil care la presiune sczut de oxigen la nivelul esuturilor pune n libertate oxigenul cu reformarea hemoglobinei. Legarea oxigenului de hemoglobin i eliberarea sa constituie un model de adaptare biologic fa de o anumit necesitate a organismelor superior organizate. Combinarea gradat i controlat a hemoglobinei cu oxigenul, precum i existena unor forme parial saturate cu oxigen, permite oxigenarea tuturor celulelor, indiferent de presiunea de oxigen existent la nivelul lor. n afar de oxigen hemoglobinele se pot uni reversibili cu alte gaze, iar valena fierului n compuii care rezult este cai n oxihemoglobin i anume +2. Gazul pentru care hemoglobina are o afinitate mare este oxidul de carbon, formndu se carboxihemoglobina mai stabil ca i oxihemoglobina. Acest lucru este motivul pentru care ntr un mediu saturat oxid de carbon pot s apar intoxicaii grave. Ambele forme oxi i carboxihemoglobina se pot transforma prin desfacerea oxigenului respectiv a oxidului de carbon simultan cu o oxidare a ionului feros la feric, ntr un compus numit methemoglobin. Acest lucru are loc n mod continuu n eritrocit unde se gsete ntr o concentraie de 0,4% dintotalul hemoglobinei, constituid o etap preliminar catabolizrii sale. O cantitate limitat de methemoglobin se poate transforma n hemoglobin sub aciunea unei enzime numit methemoglobinreductaz. Concentraia methemoglobinei nu crete mai mult de 0,4% din totalul hemoglobinei eritrocitare numai prin introducerea n organism de oxidani ca fericianura i azotii sau chiar a unor medicamente cum ar fi antipirina. Combinaia hemoglobinei cu gazele au spectre de absorbie caracteristice care permit identificarea fiecareia dintre ele. Denaturarea proteinelor Denaturarea proteinelor reprezint perturbarea structurii lor native, nalt organizate, trecerea la o form ntmpltoare cu creterea entalpiei sistemului, astfel c activitatea biologic este compromis. Denaturarea proteinelor are loc sub aciunea unor ageni denaturani. Agenii denaturani sunt: temperatura, acizii, bazele, oxidanii, unele metale, ureea, guanidina, solvenii organici. Agenii denaturani acioneaz distrugnd legturile ce dau stabilitate structurii tridimensionale. Fenomenul de denaturare privete nivelele de structur secundar, teriar i cuaternar, meninute prin legturi slabe, fr afectarea structurii primare. Procesul de denaturare poate s fie pn la un punct reversibil. ns, dac agentul denaturant acioneaz mai energic, proteina se denatureaz ireversibil. n cazul unui proces reversibil, dup ndeprtarea agentului cauzant, proteina se renatureaz, redobndind structura nativ. Aceasta se explic prin dependena structurii spaiale de cea primar.

38

Figura nr.. Procesul de denaturare i renaturare a proteinelor Proteinele denaturate i schimb proprietile fizice, cum ar fi: activitatea optic i vscozitatea. Deasemenea solubilitatea n ap scade producnd precipitarea lor. Acest fenomen de precipitare este exploatat n biochimia analitic la cercetarea proteinelor din lichidele biologice n scopul deproteinizrii. Alte aplicaii ale fenomenului de denaturare sunt: procedeele de purificare a proteinelor i operaia de sterilizare.

39

IV. Enzime Enzimele sunt proteine ce posed o funcie nalt specializat i anume aceea de biocataliz i se deosebesc de catalizatorii din lumea nevie prin cteva proprieti care le definesc. Enzimele se caracterizeaz prin urmtoarele proprieti: - capacitatea catalitic mare, eficiena catalitic crete cu un factor de 106 1012 fa de reacia necatalizat. - Specificitatea superioar de reacie elimin formarea de produi secundari - Activitile catalitice enzimatice sunt reglate prin mecanisme diferite, care privesc fie aciunea lor, fie cantitatea de enzim sintetizat. Controlul enzimatic are semnificaie major pentru reglarea metabolismului celular. - Enzimele acioneaz n condiii foarte blnde i anume la temperatura celulelor vii, la pH aproape neutru i la presiune atmosferic. Nomenclatur i clasificare Mult vreme enzimele au fost denumite prin adugarea sufixului aza la numele substratului. Ex. Amilaza, ureeza, alcool dehidrogenaza. Unele denumiri ns nu includeau nici substratul, nici reacia catalizat. Ex. Tripsina, pepsina, catalaza. Datorit faptului c numrul de enzime este n continu cretere, nomenclatura veche crea confuzii, astfel c s-a impus introducerea unei terminologii unitare i a unei clasificri adecvate. n 1961, Comisia de Enzime a Uniunii Internaionale de Biochimie, adopt o claisficare i o nomenclatur sistematic, bazat pe natura reaciei chimice catalizate. Astfel, enzimele au fost clasificate n 6 clase, fiecare cuprinznd un numr de subclase i, respectiv subsubclase. 1. Oxidoreductaze enzime ce catalizeaz reaciile de oxidoreducere. 2. Transferaze enzime ce catalizeaz reaciile de transfer de grupri funcionale. 3. Hidrolaze enzime ce catalizeaz reaciile de hidroliz. 4. Liaze enzime ce catalizeaz reaciile de descompunere a substratului prin alte mecanisme dect cele de oxidare i hidroliz. 5. Izomeraze enzime ce catalizeaz reacii de interconversiune a izomerilor. 6. Ligaze enzime ce catalizeaz reacii de formare a legturii C-O, C-C, C-S, C-N, cuplat cu scindarea unui compus macroergic (ATP). Pentru a defini o enzim, fiecruia i se atribuie un numr sistematic format din numele substratelor, urmat de cuvntul ce indic tipul de reacie catalizat, la care adaug sufixul aza. Deasemenea, fiecrei enzime i se atribuie un cod determinat de poziia pe care enzima o ocup n sistemul zecimal. Exemplu: Acest numr de clasificare este alctuit din iniialele EC (Comisia de enzime) i 4 cifre. Prima cifr indic clasa din care face parte enzima, a doua indic subclasa, determinat de felul gruprii implicate n reacie, a treia cifr reprezint subsubclasa , adic natura particular a substratelor din grupul respectiv, iar a patra cifr reprezint poziia ocupat de enzim n subsubclas. - alcool dehidrogenaza: E.C. 1.1.1.1. - glucozooxidaza: E.C. 1.1.3.4. Structura enzimelor n cea mai mare parte, enzimele sunt proteine globulare. Excepie face ribonucleaza P. O mic proporie de enzime sunt proteine simple (pepsina, chimotripsina, lizozim), iar celelalte sunt heteroproteine (metaloenzime, dehidrogenaze piridinice). Unele enzime sunt alctuite 40

sunt alctuite dintr-un singur lan polipeptidic (ribonucleaza), altele din mai multe lanuri identice sau diferite. Masa molecular a enzimelor este extrem de variabil datorit lungimii lanurilor polipeptidicre componente, ct i datorit asocierii unui numr diferit de subuniti, ca n cazul enzimelor oligomer. Pe lng aceste aspecte legate de structur, la enzime mai apar anumite caracteristici specifice lor: - identificarea centrului catalitic, i, la enzimele allosterice i a centrilor allosterici. - Cunoaterea cofactorilor enzimatici ct i locul lor n ansamblul structural enzimatic. Cofactorii enzimatici sunt componente micromoleculare indispensabile activitii unui numr mare de enzime. Cofactorul poate s fie un ion metalic sau o molecul organic specific, uneori sunt cerui ambii i foarte rar cofactorul este un anion anorganic. 1. Metalele n cataliza enzimatic Un numr mare de enzime cer pentru a-i manifesta activitatea ioni metalici.Zn+2 , Mn+2 , Mo+2 , Co+3 , Fe+3 , Cu+2 , Mg+2 , K+ , Na+ , Ca+2 . Unele enzime care conin o cantitate definit de ion metalic funcional, fiind strns legat n structura lor se numesc metalo-enzime, iar altele care leag slab metalu se numesc enzime metalo-activate. Exemple: - anhidraza carbonic: Zn+2 - enzimele heminice: Fe+3 - piruvat kinaza : Mg+2 , K+ 2.Cofactorii de natur organic sunt sisteme conjugate n care mobilitatea electronic este foarte mare, ceea ce explic puterea lor catalitic. Cofactorii slab legai de enzim sau ataai temporar se numesc coenzime. Exemplu: acid lipoic, coenzima Q, biopterinele, NAD+, NADP+, FAD, CoA. Centrul activ al enzimei ( centrul catalitic) Centrul activ al enzimei este o zon restrns din structura enzimei responsabil direct de funcia ei catalitic, aceea de legare i transformare a substratului. Aceast regiune reprezint la majoritatea enzimelor cca 5% din total. Ca entitate tridimensional centrul activ poate cuprinde o poriune sau mai multe din acelai lan, ori din lanuri diferite, apropiate spaial. Exemplu: Din centrul activ al ribonucleazei fac parte: His12, His119, Lys41. Aceti aminoacizi dei sunt situai la distan n structura liniar, sunt apropiai n structura teriar, datorit plierii lanului. Centrii activi conin resturi de aminoacizi i eventual cofactori cu rol de a recunoate i lega substratul sau care particip n transformarea lor chimic, uneori aceti aminoacizi ndeplinind ambele funcii. Ali aminoacizi aflai la distane variabile de centrul activ contribuie la stabilitatea structurii proteice, sunt resturi structurale, considerate alturi de resturile catalitice i de legare ca eseniale pentru activitatea enzimei. De fapt, n procesul catalitic particip indirect ntreaga molecul. Activitatea este condiionat de existena conformaiei native a structurii enzimatice. Aminoacizii care nu particip n nici un fel la actul catalitic sunt numii resturi neeseniale, ele conferind moleculei anumite proprieti fizico- chimice. Mecanismul de aciune al enzimelor Procesul catalitic const n formarea complexului cu substratul sau substratele, ceea ce determin o scdere a energiei strii de tranziie, transformarea chimic i eliberarea produilor. Se 41

cunosc urmtoarele mecanisme de aciune ale enzimelor: Cataliza prin distorsie implic interaciuni care deformeaz legturile i unghiurile acestora n molecula substratului. n unele cazuri, contorsia, poate fi consecina atarii covalente a substratului de enzim. Cataliza acido-bazic se datoreaz radicalilor aminoacizilor din centrul activ care pot funciona ca acizi sau baze Bronsted sau ca acizi sau baze Lewis. Cataliza prin orientarea reactanilor. Enzima are rolul de a dispune substratele ntr-o poziie favorabil reaciei. Specificitatea catalizei enzimatice Specificitatea unei enzime reprezint capacitatea unei enzime de a selecta dintr-un numr de compui substratul particular i a-l transforma printr-o reacie de un anume tip. Se distinge : specificitatea de aciune ( de reacie), i specificitatea de substrat. Specificitatea de recie. Spre deosebire de catalizatorii neproteici, care accelereaz o varietate de reacii, o enzim catalizeaz, de regul, un singur tip de reacie. Exemplu: - o reacie de hidroliz - o reacie redox - formarea unei legturi. Exist, ns unele proteine, puine la numr, cu activiti polienzimatice. n acest caz proteina posed centri catalitici independeni, responsabili de reacii diferite ce decurg prin mecanism deosebit. Specificitatea de substrat reprezint calitatea enzimei de a forma complexul enzimsubstrat ca prima etap obligatorie n transformarea acestuia. Dac enzima acioneaz asupra unei varieti de compui avem de-a face cu o specificitate relativ (de grup), n care caz enzima are capacitatea de a transforma un numr de substrate nrudite chimic. Exemplu: - hidrolaze: - esteraze - peptidaze - glicozidaze - proteaze: - exopeptidaze - endopeptidaze. Specificitatea relativ are importan n biochimia analitic, deoarece permite introducerea de substrate artificiale la determinri enzimatice. Se cunosc i enzime cu specificitate absolut. Acestea sunt inactive fa de analogii structurali ai substratului, ceea ce presupune recunoaterea integral a unei molecule, precum i o rigiditate a centrului activ, n conformitate cu modelul cheie- broasc. Exemplu: - ureaza - arginaza - anhidraza carbonic - fructozo-1,6-difosfataza. Stereospecificitatea enzimelor. Stereospecificitatea enzimelor este un caz de specificitate absolut. Exist un numr mare de substrate care se caracterizeaz prin asimetrie structural, iar n procesele metabolice adeseori se ntlnete unul din izomerii posibili. Exemplu: - L i D aminoacid oxidazele sunt specifice pentru stereoizomerii respectivi. - Alte enzime recunosc numai izomerii geometrici: succinat dehidrogenaza, fumaraza. 42

Factorii care influeneaz activitatea enzimatic n reaciile enzimatice viteza de reacie se msoar fie prin cantitatea de substrat transformat, fie prin cantitatea de produs format, exprimat n molaritate, iar timpul se exprim n minute. Viteza unei reacii enzimatice poate fi influenat de un numr de factori, dintre care amintim: concentraia de enzim, concentraia de substrat, temperatura, pH, inhibitori. 1. Influena concentraiei de enzim Viteza unei reacii enzimatice arat o dependen liniar de concentraia enzimei, n condiiile n care concentraia de substrat este fix.

V

[ E] Dependena vitezei de reacie de concentraia de enzim Abaterile de la liniaritate se datoreaz erorilor tehnice sau existenei unui inhibitor ce acioneaz numai la o anumit concentraie.

2. Influena concentraiei de substrat.teoria Michaelis-Menten De exemplu s presupunem urmtoarea reacie catalizat de enzim: E+S k1 k2 ES k3 E+P

Pentru enzimele michaeliene, dependena vitezei de reacie de concentraia de substrat este descris ca o hiperbol, la o concentraie de enzim constant. Astfel viteza de reacie crete la nceput rapid i liniar, dup care dependena nu mai este liniar, iar la o anumit concentraie de substrat curba tinde spre o valoare maxim. 43

V Vmax

Vm/2

Km

[ S]

V0 = Vmax = [S] / [S] + Km V - viteza iniial de reacie Vmax capacitatea catalitic maxim a enzimei viteza maxim realizat [ S ] concentraia de substrat Km Constanta lui Michaelis Menten, reprezint concentraia de de substrat pentru care viteza de reacie atinge jumtatea valorii maxime. Dozrile de activitate enzimatic se efectueaz la concentraii mari, saturante de substrat pentru a asigura o cinetic de ordinul zero. Ecuaia Michaelis-Menten este fundamental n studiile de cinetic enzimatic, permind analiza cantitativ a majoritii reaciilor enzimatice. Pe lng utilitatea la interpretarea mecanismului reaciilor enzimatice i a aciunii inhibitorilor, cei doi parametri cinetici ( Vmax, Km ) au importan la determinarea de enzime, inclusiv n laboratorul clinic. 3. Inhibitorii enzimelor Inhibiia reprezint scderea parial sau pierderea activitii enzimatice ca urmare a legrii de enzim a unui compus numit inhibitor. Inhibiia poate s fie un proces reversibil sau ireversibil. a. Inhibiia reversibil n cazul inhibiiei reversibile inhibitorul se combin cu enzima sau cu complexul ES, iar prin ndeprtarea inhibitorului activitatea enzimei se restabilete. E+I k1 k2 ES + I Ki EI Ki = ESI [ E] [ I] [ EI]

Eficiena unui inhibitor se msoar prin Ki. Cu ct valoarea Ki este mai mic cu att inhibitorul este mai efficient. Inhibiia reversibil este de dou tipuri competitiv i necompetitiv.

44

Inhibiia competitiv n cazul inhibiiei competitive inhibitorul intr n competiie cu substratul pentru acelai loc de legare la situsul activ al enzimei. E+P E+P

E+S E+I

ES EI

Ki =

[E][I] [ EI]

n cazul inhibiiei competitive inhibitorul este un analog structural al substratului. Exemplu:

CH2 CH2

COOH COOH

+ FAD -

HC HOOC CH

COOH

FADH2

Enzima succinat dehidrogenaza, care catalizeaz aceast reacie, este inhibat competitiv de analogi structurali, ca de exemplu: acid malonic, acid oxalilacetic, acid oxalic. Aceti acizi dicarboxilici se pot lega de centrul activ al enzimei la fel ca i succinatul. Inhibiia necompetitiv are loc prin legarea inhibitorului la un loc diferit de centrul activ al enzimei, rezultnd un complex ternar ESI. Inhibitorul poate interaciona fie cu enzima liber, fie cu complexul ES. E+P ES E+S

+ I Ki EI + S

+ I Ki ESI V 'max =

V max 1 + [I]/Ki

Pe de alt parte substratul se poate lega i de complexul EI. Spre deosebire de inhibiia competitiv efectul inhibitorului necompetitiv nu este influenat de creterea concentraiei de substrat.

45

1/v Inhibiie competitiv inhibiie necompetitiv 1/Vm Reacie fr inhibitor

1/Vm

-1/Km

-1/Km

1/S

Un alt tip de inhibiie reversibil este inhibiia necompetitiv (incompetitiv ), care are loc atunci cnd se formeaz complexul ternar ESI, ca urmare a interaciunii I cu complexul ES, cnd are loc scderea valorii Km i Vmax. b. Inhibiia ireversibil Inhibiia ireversibil este consecina legrii covalente a inhibitorului de enzim sau de complexul ES, el neputnd fi ndeprtat. E+P ES E+S + I + I

EI inactivi

ESI

Capacitatea inhibitorului ireversibil este msurat printr-o constant de vitez care exprim fraciunea de enzim inhibat ntr-o perioad definit de timp la o anumit concentraie de inhibitor. Inhibitorii ireversibili sunt toxici, fiind numii i otrvuri enzimatice. Exemplu: metalele grele, agenii oxidani, organofosforicele, compui ai arseniului. Semnificaia i importana practic a inhibiiei enzimatice 1. Inhibiia enzimatic este o modalitate important de control metabolic. 2. Unele toxice i exercit aciunea datorit calitii lor de inhibitori enzimatici ireversibili. Exemplu: insecticidele 3. Inhibitorii enzimatici au aplicabilitate n toxicologia clinic, servind ca antidoturi. Exemplu: etanolul este folosit ca antidot n intoxicaiile cu metanol i etilenglicol. 4. Utilizarea inhibitorilor n enzimologie pentru identificarea mecanismului de aciune i a 46

centrilor activi. 5. Inhibiia enzimatic este un instrument terapeutic polivalent. Exemplu: agenii chimioterapici, antiinflamatoarele nesteroidiene. 4. Influena temperaturii asupra activitii enzimatice Viteza reaciei enzimatice crete odat cu temperatura, n intervalul n care enzima respectiv este stabil, datorit creterii energiei cinetice a reactanilor. n multe procese biologice o cretere a temperaturii cu 100 C duce la dublarea sau triplarea vitezei de reacie. Temperatura optim pentru majoritatea enzimelor este temperatura celulelor n care acestea se gsesc. Peste temperatura de 50 600 C majoritatea enzimelor sunt inactive. Excepie fac unele microorganisme termofile ale cror enzime sunt active i la 800C. 5. Efectul pH-ului asupra activitii enzimatice. Enzimele sunt stabile ntr-un domeniu relativ ngust de pH, domeniu n care se gsete o valoare, numit pH optim, pentru care activitatea unei enzime este maxim. Majoritatea enzimelor au pH-ul optim n jurul pH-ului fiziologic de 7,4. Excepii fac enzimele digestive pentru care pH-ul optim este cel acid, monoaminooxidazele din membrana mitocondrial extern care au pH optim aproximativ 10. Exist unele enzime a cror activitate este independent de pH ( pepsina ). Reglarea activitii enzimatice Reglarea activitii enzimatice este o component esenial a procesului de control i de coordonare a metabolismului, n direct legtur cu meninerea homeostaziei. Fluxul reaciei enzimatice poate fi influenat prin 3 mecanisme generale: - variaii n cantitatea absolut de enzim - modificarea fondului metabolic celular de substrate i cofactori, condiionate i de transportul prin membrane - schimbri n eficiena catalitic a enzimelor. Enzimele allosterice Enzimele allosterice sunt alctuite din subuniti care interacioneaz n cursul procesului catalitic, fenomen ce se numete cooperativitate. Activitatea acestor enzime este controlat prin legarea necovalent a unor metabolii specifici n locuri distincte de centrul activ, locuri ce se numesc centri alosterici. Deci, proteinele (enzimele) allosterice sunt oligomeri alctuii din monomeri identici sau nu, aflai n numr par. Fiecare monomer posed un centru activ i locuri separate i diferite de situsul activ numite centri alosterici. O enzim allosteric catalizeaz de obicei o etap iniial din secvena multienzimatic a unei ci metabolice. Reaciile enzimelor allosterice sunt ireversibile sau cu grad redus de reversibilitate, reprezennd astfel puncte de control pentru ntregul lan de reacii. Astfel, cnd produsul final al cii metabolice se acumuleaz peste concentaia necesar, el funcioneaz ca modulator negativ al enzimei. Acest efect se numete inhibiie prin produs final, inhibiie feedback sau retroinhibiie. Exemplu:

47

S

E1

S1

E2

S2

P

P inhiba enzima aspartat transcarbamilaza, enzim ce catalizeaz prima reacie din procesul de sintez a ribonucleotidelor pirimidinice.

Importana biomedical i farmaceutic Enzimologia aduce un aport important att n problemele de diagnostic ct i n ceea ce privete terapia cu enzime. I. Diagnosticul enzimatic Diagnosticul enzimatic se bazeaz pe informaiile furnizate de dozarea enzimelor din ser. Determinrile enzimatice din hematii i leucocite, precum i din material bioptic sunt mai puin abordate. Se mai urmresc unele enzime i n urin, suc gastric i suc duodenal. n funcie de locul de producere i modul n care ajung n snge, enzimele serice se clasific astfel: 9. Enzime secretate activ; se produc n ficat i se elibereaz n plasm, unde ndeplinesc un anumit rol fiziologic. Exemplu: lipoproteinlipaza, pseudocolinesteraza, lecitin colesterol- acil- transferaza. 10. Enzime ale secreiilor exocrine. Acestea se produc n diferite organe i difuzeaz pasiv n plasm. Exemplu: amilaza salivar i pancreatic, lipaza pancreatic, fosfataza acid prostatic, fosfataza alcalin. 11. Enzime celulare. Aceste enzime se gsesc n plasm n cantiti de sute de ori mai mici dect n esuturi. Exemplu: lactat dehidrogenaza, creatin kinaza, transaminazele. 12. Enzimele inductibile, sintetizate n exces ca rspuns la un agent imductor, i ca atare mbogesc plasma. Exemplu: - glutamil transpeptidaza, enzimele de hidroxilare, glicuronozil-transferaza. Izoenzimele Izoenzimele sunt enzime ce ndeplinesc acelai rol catalitic, dar difer prin proprietile structurale, fizice, chimice, cinetice i imunologice. Din punct de vedere structural sunt oligomeri alctuii din subuniti identice sau diferite. Exemplu: 1. lactat dehidrogenaza prezint 5 izoenzime LDH, care se deosebesc prin proporia n care sunt distribuite. Cele 5 izoenzime rezult prin combinarea difert a 2 tipuri de lanuri, notate cu H (subunitate de origine miocardic) i M (subunitate ce provine din muchi). LDH1 : H4 LDH2 : H 3M LDH3: H 2M2 LDH4 : HM3 LDH5 : M4 Aceste enzime se dozeaz n studiul leziunii de organ i anume n boli cu citoliz. 2. Creatin kinaza prezint 3 izoenzime, i anume: 48

CK1 : BB CK2. BM CK3 : MM Aceste izoenzime sunt dozate n infarctul miocardic Terapia cu enzime. Pentru multe medicamente att aciunea principal ct i efectele secundare sunt n legtur direct cu diferite activiti enzimatice. Enzimele sunt ageni terapeutici unici ce produc efecte importante i specifice. Enzimele sunt introduse n terapie din aproximativ 1930. Medicamentul enzimatic apare n diferite forme solide, soluii buvabile, soluii injectabile precum i preparate destinate uzului local. Terapia cu enzime este indicat n afeciuni digestive i boli genetice, boli cardio-vasculare, neoplazii sau ca medicamente antiinflamatoare n dermatologie, oftalmologie, ORL, reumatologie, afeciuni bronice. Metode i surse de obinere a enzimelor terapeutice: - Extragerea din diferite esuturi sau lichide biologice umane (placenta, snge, urin) sau animal i purificarea corespunztoare. - Culturi de celule mamifere sau bacterii din sol. - Surse vegetale - n ultimul timp tehnologia ADN-ului recombinat. Exemplu: - streptokinaza, urokinaza, enzime ce se obin prin biotehnologie. Aceste enzime reduc mortalitatea prin infarctul de miocard.

49

V. VITAMINE Vitaminele sunt biomolecule indispensabile vieuitoarelor pentru creterea, ntreinerea troficitii i funciei esuturilor. Organismul uman nu le poate sintetiza sau produce n cantiti insuficiente. Vitaminele sunt necesare organismului n cantiti mici de ordinul miligramelor sau mai puin, cu excepia vitaminei C care este necesar n cantiti de aproximativ 75 mg pe zi. Deci, vitaminele pot fi considerate factori eseniali. Carena unei vitamine genereaz stri patologice, cu manifestri specifice. Deficienele vitaminice reflect dezechilibru dintre aport i necesiti. Ele sunt cauzate: Primar : - prin lipsa de aport alimentar - de afeciuni digestive ce se repercut asupra absorbiei - datorit disbiozei pentru vitaminele ce sunt produse de flora intestinal, aceasta este afectat prin administrarea oral de antibiotice sau sulfamide. Secundar : - datorit cerinelor crescute ce apar n anumite stri. Necesarul pentru o vitamin sau alta depinde de: - vrst - de starea fiziologic, de exemplu: sarcina - de starea de sntate - efortul fizic - temperatura ambiant - administrarea unor medicamente. Strile careniale sunt numite avitaminoze (apar astzi la populaia malnutrit din rile subdezvoltate) i hipovitaminoze, cu manifestri policareniale. Unele vitamine au provitamine, care sunt compui nrudii structural, inactivi sau slab activi, pe care organismul i transfer n forma activ n forma activ de vitamin. Au mai fost identificai i ali compui numii antivitamine, care sunt capabili s-i diminuie sau s-i suprime activitatea unei anumite vitamine. Unele antivitamine au utilizri terapeutice, dar prezin dezavantajul de a induce simptome careniale. Clasificarea vitaminelor Exist o clasificare care are la baz criteriul solubilitii n ap sau solveni nepolari. Astfel vitaminele se mpart n: - vitamine hidrosolubile: B1, B2, B6, B12, PP, acid folic, C, biotina, acidul pantotenic. - vitamine liposolubile: A,D,E,K. Unii autori admit i o categorie de pseudovitamine care cuprind compui care au parial trsturi de vitamine (vitaminoide). De exemplu: - flavonoizii numii i vitamina P - acizii grai eseniali sau vitamina F - mezoinozitolul - colina

Mecanismul de aciune al vitaminelor Multe vitamine acioneaz dup o prealabil biotransformare, iar altele rmn nemodificate i funcioneaz ca i coenzime, participnd la o multitudine de procese biochimice. Alte vitamine ca de exemplu vitaminele A sau D folosesc ci de aciune ce amintesc de mecanismele hormonale. Vitaminele E sau tocoferolii funcioneaz ca sisteme antioxidante fa de agresiunea peroxidic. 50

Exist, deasemenea i modaliti particulare de aciune, cum ar fi de exemplu: retinalul i acidul retinoic. n general vitaminele prezint i un important rol catalitic. Implicaii terapeutice n terapie, vitaminele sunt utile ca medicaie specific pentru combaterea sau profilaxia strilor careniale. Preparatele pot s conin o singur vitamin sau as