h4*{*d* d* dsterxninare e eoxy?pozili*i fl*rei n*rrna}* a cavitfrliiI:ucale

Determinarea compozil iei f lorei normale a cavitSli i Ur..t" pune probleme de diagnostic

r Dificultdli legate de tehnica de recoltare

o Atagarea de substrat /Coagregarea / Coadeziunea

. Unele microorganisme din cavitatea bucali aderi str6ns de substat sau intre ele

' t:,,:;::::. t ' prelucrate trebuie disp,ersate fdri s5 iri piardi viabil itatea

. RecupereazS numdrul maxim de par t icu le d in probS

r Distruge spirochetele gi unele bacterii Gram negative (Fusobacterium spp.lVortexare

. Cea mai eficienti metodd pentru placa subgingivalS

. De preferat vortexare cu granule mici de sticld steri ld intr-un recipient cu gaz inert

o Cale de acces d i f ic i lS

o Contaminarea probelor cu flora normalS a caviti l i i bucale

r Dificultdli legate de identif icare

o Diversitate mare a specii lor care alcdtuiesc microflora cavitSli i bucale, mai ales cea a plScii dentare

' Unele specii se gSsesc doar in numSr foarte mic

o Bacterii strict anaerobe

' i l i pierd viabil itatea la contactul cu aerul

o Speci i greu cul t ivabi le / necul t ivabi le

o Crestere lentd

o Lipsa unor criteri i de identif icare

Recoltarea probelor

. Compozil ia microflorei orale poate varia de la un situs la altul, chiar dacd acestea sunt apropriate

o Se '"j"T:::ecoltarea unor cantitsl i mici de produs

' Raclarea mucoasei

Examenul microscopic

. Preparat nativ

o Mobil itate 9i morfologie

o FISH (fluorescent in situ hybridization) - metodd citologici (determini prezenla/absenta unor secvenle

specifice de ADN)r Microscopie confocalS - s t ructura b iof i lmulu i

-_t-

Metode de b io logie moleculard

r Amplif icare genicd 165 rARN

o FISH (fluorescent in situ hybridization)r DGGE (denatur ing gradient gel e lect rophorur i ir Tehnici de detectare de secvenle specific de AND

Cultivare, ldentif icare

o Necesiti transport la laborator in condil i i corespunz5toare

. Dispersarea probelor

r Tehnici cantitative

o Rearizareili:j:"lj:::il:"*,.,m produs pato,ogic

o Numdrarea coloni i lor pe medi i se lect ive/neselect ive

o ldentif icare prin metode specific (teste APl, etc)o Ant ib iogramd

$tabilirea nilffi5rului total de lactnbacili din lichidul bucal

Lactobacil i i sunt frecvent izolali din cavitatea bucali, in special din placa dentard 9i de pe l imbd.

c L. cosei, L. rhomnosus, L. fermentum, L. acidophilus, L. solivorius, L. plantarum, L. parocosei, L. gasseri,

.

L. oris

. Reprezint i mai pul in de7% din f lora cul t ivabi lS a cavi t5 l i i bucale

o Prevalenla lor cregte in cazul pacienli lor cu carii

r FermenteazS glucoza cu producere de lactat sau lactat gi acetat

o Se fo losesc medi i se lect ive pentru est imarea numiru lu i de lactobaci l i d in sal iv5

o Test pentru aprecierea activitSli i cariogene a microflorei bucale

o Cu toate ca aceste teste nu sunt foarte relevante, ele oferd informalii in legiturd cu dieta

ot t ' : " t ' ' ; ; " " rurde

ractobaci r ise corereazd cu aporrurde carbohidra l id in d ieta persoanei

Metoda clasicSRecol tarea l ich idulu i bucal

. in seara anterioari recoltdri i pacientul efectueazd o igienS riguroasi a cavitSli i bucale, apoi nu mai

consumi a l imente, l ich ide, etc .

o Dimineala, inainte de a m6nca, se clitegte cavitatea bucalS cu ser fiziologic steri l

r Dupd un repaus de 30 minute, se c ldtegte d in nou gura cu 20 ml ser f iz io logic s ter i l t imp de 2 min.

o Serul va fi colectat in recipient steri l

-2-

Tehnica de lucru

e Se efectueazd diluli i succesive L/LO, L/L00, L/Looo, U10000

e Din f iecare d i lu- t ie seinsdm6nleazd 1ml pr in inglobarein 10 ml mediu f lu id i f icat

r Se numirS coloni i le de lactobaci l i

o Coloni i R, cu margin i neregulate

o Se numi16 p l ic i le in care s-au dezvol tat ce l pul in 20-30 coloni i 9 i ce l mul t 300 coloni i

o Se corecteazi cu factoru l de d i lu l ie 9 i se apreciaz i numiru l de lactobaci l i /ml ' l ich id bucal

Metade rapidsCRT bacteria o

r Se fo losegte pentru determinarea numiru lu i de st reptococi mutans 9 i de lactobaci l i d in sal iv i

o Util izeazd medii selective

r Contra indical i i

o Tratament antibiotic

o utirizaret:;::*JT:j,T:ff':'j:0"""'deraincetareatratamenterorantibiotice

Metoda de lucru

Se real izeazS st imularea secre l ie i sa l ivare pr in mestecarea unor granule de paraf inS

Se recolteazi saliva in recipient steri l

Se umezesc ambele pdr l i a le mediu lu i cu sal ivd

o Saliva se va picura cu pipeta pentru a evita zg6rierea mediului

Se scurge excesul de salivd

Testul se plaseazi in recipient, se inchide ermetic

Se incubeazi la 37o C,48 ore, in pozil ie verticald

Citirea se face in comparalie cu etalonul

.

. t-

n { t , ,

,.-.) -"'1:;

-3-

b*nll$6**ll,utibr! $f|} trif '{ t!*# lsii.s:i&{ e

, ! * * : : :* * q r ' r * ,{"ru\ J

Fnnl*rlibntss br rs$l#*r ii!3$l.tp*x

' r * 1 f r d

r-1i tL-/

ffiffiffiffiWffiffiffi

sd utanr,bws{${tt,Szu.f r,'d sfi }tr$}

Lrfidhr(lHl teFUJ rfil 5&l*/*l

-4-

#enul taxdic{aSpecii importante

c Candida albicans

. Specii non-albicans: C. krusei, C. glabrato,. C. tropicolis, C. paropsilosis, C. guillermondii, C. famota, etc.

lmplicare in patologie

. membr i a i f lore i normale

r prolifereazi in prezenla unor factori de risc (imrinosupresie, tratament antibiotic, sarcini, diabetzaharat, prezenla cateterelor intravasculare, uti l izare de droguri intravenoase, expunere prelungiti etc.)cauz6nd infecti i oportuniste

o infecli i profunde (sepsis, endocarditd, diseminare cu abcese in diverse organe la pacienlineutropenici, infecli i de gunt, pericarditd postchirurgicalS)

o infecli i superficiale - tegumente, unghii, mucoase (vaginitS, esofagitS, soor bucal)o candidozd congenitali, candidozd sistemicd la nou-nisculi cu greutate micd la nagtere

Morfologie

r preparat nativ, frotiuri colorate Gram, cu albastru de metilen, Giemsa

o blastospo.l,r,"

rrr, (3-g u), sferice sau ovoide, inmugurite, Gram pozitive

" ot"':"t:"ul*

.,""rn" agezate cap ra cap, nedesprinse dupi diviziune

o clamidosll,t j ," u"r,." cu dubru contur, mai mari dec6t brastoiporii, se observi doar ra specia

C. albicans

Cultivare

. pe mediu l Sabouraud

o suplimentat cu cloramfenicol permite dezvoltarea levurilor gi inhibi multiplicarea bacterii lor

contaminante

. pe medi i cromogene

o Candiselect, Chromogenic Candida Agar - permit identif icarea unor specii de Candida (medii lecromogene conlin diverse substraturi care descompuse de enzime specifice ale unor specii de

Candida rezulti in colorarea colonii lor). incubare la 30-37oC, 24-48 de ore

-5-

ldentif icare

. caracteremorfotinctoriale(vezi morfologie)

. caractere de culturi '

o colonii de tip ,,S", alb-g5lbui, cremoase, mari, cu suprafala mati, miros de drojdie

o u n e | e t u l p i n i p o t p r e z e n t a m i c e I i i I a p e r i f e r i e s a u p o t f i r u g o a s eo pe medi i cromogene: se ident i f ic6 specia pe baza culor i i co loni i lor

. zimograma - identif icare pe baza studierea fermentSrii zaharurilor

. auxonograma - . ident i f icare pe baza studier i i as imi lSr i i zaharur i lor

. temperatura de crettere

o C. albicons creste la 45'C

o majoritatea cresc la 37-40"Co unele nu cresc la 37oC

. ureazi negativd

r testul f i lamentarii rapide - pentru identif larea speciei c. albicqns

o Se prepard o suspensie de 0,5 McFarland in ser fiziologic steri l din cultura de levuri testatS. La

0,5 ml suspensie levur icd se adaugd volum egal de ser sanguin de cal sau uman ) incubare in

baie de ap5 (36.C t imp de 2h) ) se agi t ; -> se eta leazE o p icaturS int re lami 9 i lamelS ) se

examineazd la microscoP.

o se observi tubi germinativi, f i lamente scurte care emerg din blastospor fdri strangulare (c.

al bica n s, C. d u bli nie nsi s\

r formarea clamidosporilor - pentru identif icarea speciei c. albicans

o C. olbicans formeazS clamidospori numai daci se cultivi pe medii speciale (agar cu fbini de

Porumb 9i Tween 80)

Specie Candida Colonie Blastospor i Pseudomicel i i Tubi germinal i Clamidospor i

olbicans Untoasi Ovalar i Da Da Da

dubliniensis UntoasS Ovalar i Da Da Daglabrato UntoasS Ovalari Nu N u N uguilliermondii Untoasi Ovalari Da Nu Nu

krusei Uscate Ci l indr ic i Da N u N uparapsilosis increlite Ovalari N u N u

tropicalis Untoase Ovalar i Da N u N u

o Metode automatizate de identif icare - Vitek2 Compact

r Tehnici moleculare - ldentif icare bazata pe secvenfierea ADN-ului ribozomal 18S, identif icare prin PCR

Testarea sensibil i t6li i la antifungice

. nu este recomandat de rut in i

o indicatd in cazul infecti i lor invazive, infecli i refractare la tratament

r determinarea concentra l ie i min ime inhib i tor i i pr in E- teste sau metoda d i lu l i i lor

-5-