43. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Bacillus anthracis Genul Bacillus aparine familiei Bacillaceae i cuprinde un numr foarte mare de specii, dintre care n patologie sunt mai frecvent implicate B. anthracis, B. cereus i B. subtilis. Germenii din specia B. anthracis se prezint sub form de bacili gram pozitivi, de dimensiuni mari, imobili, sporulai, cu sau fr capsul. Sunt aerobi facultativ anaerobi.Manifestrile clinice ale infeciilor determinate de bacilul antraxului sunt reprezentate de antraxul cutanat (forma cel mai frecvent ntlnit la om), antraxul pulmonar i respectiv antraxul gastrointestinal; n toate formele poate avea loc diseminarea infeciei. De menionat c B. anthracis infecteaz n special animalele i poate produce ocazional infecii umane. n ultima perioad se discut frecvent despre implicarea acestui microorganism n bioterorism.Diagnosticul de laborator n antrax este bacteriologic, direct i trebuie realizat ct mai rapid; sunt urmate etapele cunoscute dar exist anumite particulariti.Diagnosticul unui caz de antrax pornete de la datele clinice i epidemiologice. Examenul bacteriologic va confirma diagnosticul.1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de secreii de la nivelul leziunilor cutanate dar se pot recolta i aspirat din edemul local i / sau din ganglionii regionali, sput, materii fecale, alimente incriminate, lichid cefalorahidian, probe necroptice, snge (pentru hemoculturi) etc, n funcie de forma clinic. n cazul n care este de presupus c p.p. este contaminat se pot folosi o serie de metode, spre ex. utilizarea mediilor selective, tratarea termic sau tratarea cu alcool a p.p. n cazul mediilor selective, agentul selectiv mai frecvent utilizat este polimixina B. n cazul celei de a treia variante, utilizm etanol steril de 95. Vom suspensiona p.p. n proporie egal n etanol pentru o durat de 30-60 minute, la temperatura camerei, dup care vom preleva circa 0.25 ml din suspensie pe care o cultivm pe mediul de cultur ales. n cazul n care estimm c transportul ctre laborator va dura mai mult de 60 minute, asigurm o temperatur de transport de 2-8 C. Trebuie s menionm faptul c atunci cnd presupunem diagnosticul de antrax, trebuie luate msuri de biosecuritate speciale.2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unor frotiuri care se coloreaz cu albastru de metilen i Gram; cel puin un frotiu se va pstra de rezerv. Se mai pot utiliza albastru de metilen policrom (McFadyean) sau coloraia imunofluorescent, pentru evidenierea capsulei bacteriene. n p.p. se pot remarca structuri tisulare, leucocite i bacili gram pozitivi, cu capetele tiate drept, de dimensiuni mari (1-1,5mm / 3-10mm), capsulai, dispui izolat, n perechi sau lanuri scurte, inclui ntr-o capsul comun. n coloraia cu albastru de metilen policrom bacilii apar albatri iar capsula apare ca un halo de culoare roz.3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Putem utiliza geloz nutritiv sau geloz snge, n condiii de aerobioz, la o temperatur de 37 C (dei se poate multiplica ntre 15 i 42 C). n cazul n care este de presupus c p.p. este contaminat se pot folosi metodele menionate mai sus. Pentru izolarea B. anthracis se poate folosi un mediu cu polimixin B, lizozim, EDTA i acetat de thaliu, mediul PLET.4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-pozitivicu dimensiuni de 1-1,5m / 3-8m, formnd lanuri lungi; ncepe procesul de sporogenez (sporul este oval, situat central, mai mic dect grosimea bacilului respectiv). Caractere de cultur: Pe medii simple produc colonii de tip R, mari, cu diametrul de 2-5 mm; marginile sunt neregulate, cu prelungiri laterale filamentoase care au permis asemnarea acestora cu capul de meduz sau coama de leu; pe mediile cu snge, poate aprea o zon discret de b-hemoliz dei n mod caracteristic B. anthracis este non-hemolitic. Pe medii speciale se poate stimula dezvoltarea capsulei polipeptidice (vezi mai jos). Pe mediul PLET produc colonii mici, de tip S. Caractere biochimice: Bacillus anthracis este catalazo pozitiv, produce lecitinaz i este sensibil la penicilin (fa de majoritatea speciilor din genul Bacillus, rezistente la penicilin); exist i alte teste biochimice care sunt efectuate la nivelul centrului de referin Un alt caracter care trebuie investigat se refer la motilitate, absent n cazul B. anthracis i prezent la majoritatea speciilor din genul Bacillus. n acest scop putem nsmna o coloan de geloz moale, cu incubare la 37 C pentru 1-4 zile i urmrim dezvoltarea culturii fa de traseul pe care am nsmnat asemntor cu interpretarea mediului MIU n cazul enterobacteriilor Caractere de patogenitate: Testarea producerii capsulei in vitro, caracteristic tulpinilor virulente de B. anthracis se poate realiza prin cultivare (repicare) pe un mediu care conine bicarbonat de sodiu (0,7%), la 37 C i n prezena unui procent crescut de CO2; dup 24 de ore, tulpinile capsulate vor produce colonii mucoide iar prezena capsulei se va demonstra microscopic (ex. coloraia McFadyean sau Giemsa). Testarea patogenitii la oarecele alb (vezi capitolul 11) Testarea sensibilitii la bacteriofagul g Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin: diferite alte teste biochimice examene microscopice (frotiuri colorate cu negru Sudan pentru identificarea prezenei globulelor lipidice de b-hidroxibutirat) alte teste pentru demonstrarea sensibilitii la penicilin (ex. testul colierului de perle) tehnici ale biologiei moleculare (depistarea prezenei plasmidelor pX01 i pX02).5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice) nu este necesar. Bacillus anthracis este sensibil la penicilin, eritromicin, tetraciclin, cloramfenicol, ciprofloxacin etc.n ceea ce privete diagnosticul imunobiologic, n Romnia a fost pus la punct tehnica IDR cu antraxin (Blteanu-Toma).Trebuie menionat faptul c este de o deosebit importan punerea diagnosticului de antrax la animale (n special ierbivore), principalul rezervor pentru Bacillus anthracis.n acest scop, se pot utilizat tehnici ale diagnosticului bacteriologic (evidenierea microscopic a bacililor n leziuni, obinerea de culturi, identificarea antigenelor prin reacii de precipitare sau tehnici de tip ELISA; pentru reacia Ascoli, vezi capitolul 16) sau ale diagnosticului imunologic (intradermoreacia cu antraxin)44. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul ClostridiumGenul Clostridium include peste 100 de specii care se gsesc n intestinul animalelor i se pot elimina n mediul exterior prin materiile fecale, sporulnd. Sunt bacili gram pozitivi (uneori la limit), de dimensiuni mari, aezai n perechi sau lanuri, mobili cu cili peritrichi (cu excepia C. perfringens). Multe dintre specii sintetizeaz exotoxine. n cele ce urmeaz vom discuta despre speciile care produc tetanos, botulism i gangrena gazoas.Tetanosul este produs de Clostridium tetani patogen prin multiplicare la poarta de intrare i toxinogenez (produce o exotoxin neurotrop). Neuronii motori spinali sunt de obicei inhibai de ctre glicin i acidul g aminobutiric. Toxina blocheaz eliberarea acestor mediatori ceea ce determin excitarea neuronilor motori spinali, cu apariia de spasme severe i dureroase ale musculaturii striate (paralizie spastic). Contiena este pstrat. Toxina poate ajunge la nivelul SNC i retrograd prin propagare pe cale axonal de la poarta de intrare sau pe cale sangvin. Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale musculaturii din zona contaminat, apoi ale muchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura nu se mai poate deschide) i facies de tip risus sardonicus (spasme ale musculaturii faciale). Orice stimul extern precipit un atac de tetanos. Moartea se poate produce prin asfixie; mortalitatea este de circa 50%.Botulismul apare de obicei prin ingestia de alimente care conin toxina produs de Clostridium botulinum, fiind o toxiinfecie alimentar de tip toxic (toxin preformat n aliment). Toxina botulinic este cea mai puternic otrav cunoscut; doza letal pentru om este de circa 1-2 mg. Dup ingerare, toxina se resoarbe la nivel intestinal, ajunge n circulaie, iar pe aceast cale la nivelul plcilor neuromotorii unde mpiedic eliberarea de acetilcolin (determin paralizie flasc). Paralizia ncepe la extremitatea cefalic (ex. paralizia muchilor globilor oculari care apare la 18-24 ore de la ingestie i se manifest prin diplopie) i evolueaz descendent. Decesul poate surveni prin asfixie (datorit paraliziei muchilor respiratori). Botulismul infantil (posibil i la aduli) este urmare a formrii toxinei botulinice prin germinarea la nivel intestinal a sporilor ingerai. Mortalitatea n botulismul neo-natal este foarte mare. Botulismul plgilor poate apreala persoane care folosesc droguri injectate intravenos sau prezint leziuni contaminate cu pmnt.Gangrena gazoas este produs de dou sau mai multe dintre urmtoarele specii: C. perfringens, C. novyi (C. oedematiens), C. septicum, C. histolyticum i C. sporogenes. Sporii clostridieni ajung la nivel tisular prin contaminarea unor leziuni (traume). n condiii de anaerobioz sporii germineaz, formele vegetative se multiplic, fermenteaz zaharuri i apare gaz. Distensia tisular, obstrucia mecanic a structurilor vasculare n conjuncie cu sinteza de toxine favorizeaz diseminarea infeciei. Enzimele (toxinele) produse contribuie i la alterarea grav a strii generale. Gangrena gazoas este caracterizat prin edeme dure, crepitante (datorit prezenei de gaz) i necroz. Necroza tisular se extinde, multiplicarea bacterian se amplific, apare anemie hemolitic, toxemie i evoluie (n 20-80% din cazuri) ctre deces.nainte de a discuta cteva aspecte legate de diagnosticul infeciilor produse de clostridii dorim s menionm faptul c exist i alte microorganisme anaerobe de interes medical (bacili gram pozitivi nesporulai, bacili gram negativi, coci gram pozitivi i gram negativi, spirochete). Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de germenii anaerobi este laborios, costisitor i de regul poate fi definitivat numai n laboratoare specializate; sunt necesare dotri speciale i un personal medical cu experien.n continuare vom prezenta cteva aspecte privind diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganismele din genul Clostridium.1. Etapa de recoltare i transport a p.p. este esenial; trebuie meninute condiiile de anaerobioz.2. Din punct de vedere macroscopic am putea meniona mirosul putrid al p.p., prezena unor fragmente de esut necrotic, a unor secreii de culoare nchis, existena de snge i puroi n plag etc.Examenul microscopic are rol orientativ (pentru majoritatea laboratoarelor este i ultima activitate care poate fi realizat atunci cnd agentul etiologic este un microorganism anaerob). C. tetani are dimensiuni de 0,5-2 mm / 2-18 mm i poate prezenta un spor rotund localizat terminal, C. botulinum are dimensiuni de 0,5-1,5 mm / 3-20 mm i poate prezenta un spor oval localizat central sau subterminal iar C. perfringens are dimensiuni de 0,5-1,5 mm / 1,5-19 mm i poate prezenta un spor oval localizat subterminal. Examenul microscopic poate permite n acelai timp un control al calitii p.p. (evideniind prezena celulelor inflamatorii i a celulelor lezate) i ar putea servi la alegerea terapiei antimicrobiene.3. Pentru cultivarea p.p. vom pregti cel puin 3 medii de cultur: bulion VF (viande-foi) cu acid tioglicolic i albastru de metilen (care testeaz digestia crnii de ctre clostridii), mediul geloz - snge suplimentat cu neomicin 100 mg / ml incubat n anaerobioz i mediul geloz - snge incubat n condiii aerobe. Pentru p.p. provenite din abcese sau din plgi care sugereaz gangrena gazoas am putea folosi i mediul Nagler (cu glbenu de ou) care permite evaluarea producerii de lecitinaz i lipaz.Pentru a distruge formele vegetative i a reine sporii putem proceda aa cum am artat n capitolul 10 (tehnici de izolare speciale).Incubarea n condiii de anaerobioz dureaz 24-48 de ore la 35-37 C.nainte de a trece la etapa de identificare trebuie s ncercm s dovedim c am izolat germeni anaerobi i s verificm puritatea culturii care urmeaz a fi identificat. n condiiile n care p.p. a fost nsmnat pe 2 plci cu geloz - snge incubate aerob i anaerob, este util s realizm examenul microscopic al coloniilor. Dac apar colonii asemntoare n ambele plci iar din punct de vedere microscopic prezint caractere similare, este vorba de microorganisme facultativ anaerobe. Dac pe frotiurile din coloniile izolate pe mediul incubat n anaerobioz apar i alte tipuri morfologice, nseamn c exist microorganisme strict anaerobe. Pentru a verifica puritatea culturii obinute, nainte de a trece la etapa de identificare, repicm coloniile suspecte n bulion VF regenerat (prelevm colonia prin decupare cu geloza subiacent). Incubm timp de 24 ore la 35-37 C. n cazul n care exist multiplicare bacterian procedm la a. realizarea unui frotiu colorat Gram (i comparm rezultatele cu cele obinute anterior); b. repicarea pe o pant de geloz nutritiv cu incubare n aerobioz (nu trebuie s apar cultur bacterian n cazul n care bacteriile izolate anterior sunt anaerobe). Dac rezultatele sunt corecte, trecem la identificarea microorganismelor.4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere, aa cum am discutat i n capitolele precedente. Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-pozitivicu dimensiunile menionate mai sus. n culturi nvechite bacteriile pot fi gram negative i se pot detecta endosporii (deformeaz bacilii). n cazul n care la examenul microscopic nu evideniem spori vom repica pe mediul Nagler, cu incubare 48 de ore la 35-36 C i apoi la temperatura camerei. Urmrim sporularea pe un nou frotiu colorat Gram. Putem evalua fenomenul de sporogenez i prin metode de cultur (vezi mai jos). Caractere de cultur: Speciile mobile (marea majoritate) formeaz la suprafaa mediului colonii de tip S, cu margini ondulate, neregulate, cu tendin de invadare a mediului (datorit mobilitii). n jurul coloniilor remarcm prezena b-hemolizei. Dac a avut loc inocularea i n profunzimea mediului, coloniile au aspect pufos. Clostridium perfringens (specia imobil) formeaz colonii de dimensiuni mari, de tip S, rotunde, cu margini regulate, convexe dar care pot avea i aspect rugos. Majoritatea tulpinilor produc hemoliz dubl (zona intern, de b-hemoliz, este mai ngust n timp ce zona extern, de a-hemoliz este mai larg); exist i tulpini care produc zone foarte largi de hemoliz precum i tulpini slab hemolitice. Aa cum am menionat, prin cultivare putem s evalum fenomenul de sporogenez (cunoscut fiind c sporii rezist timp de 10 minute la temperatura de 80 C). Dac pe frotiul din cultur colorat Gram nu evideniem spori, pregtim 2 tuburi cu bulion pepton, glucoz, amidon i extract de levur. Repicm coloniile suspecte n cele 2 tuburi iar unul dintre tuburi n supunem unei temperaturi de 80 C, 10 minute. Incubm cele 2 tuburi la 35-37 C pn apare multiplicarea bacterian. Dac bacteriile se dezvolt n ambele tuburi, am dovedit existena sporilor. Dac dup o incubare de cel mult 10 zile nu apare multiplicare bacterian n tubul supus la temperatur, nu exist spori. Caractere biochimice: Exist numeroase caractere biochimice care pot fi utile n diferenierea speciilor de clostridii. n identificarea microorganismelor din acest gen utilizm iniial testarea producerii de lecitinaz i lipaz. Pe mediul Nagler inoculm tulpina n striu (se pot testa concomitent mai multe tulpini). Pentru aprecierea producerii de lecitinaz incubarea dureaz 48 de ore. n cazul n care testul este pozitiv (precipitat opac n mediul din jurul striului de cultur) poate fi vorba de o tulpin de C. perfringens. Testul este negativ pentru C. tetani sau pentru C. botulinum. Pentru tulpinile lecitinaz pozitive, la nivelul centrului de referin se mai pot testa mobilitatea, fermentarea lactozei, producerea de lipaz, ureaz, hidroliza gelatinei, digestia crnii etc. Pentru aprecierea producerii de lipaz incubarea dureaz 1 sptmn. n cazul n care testul este pozitiv (film perlat, iridescent la nivelul striului de cultur i n mediul adiacent) poate fi vorba de o tulpin de C. botulinum. Testul este negativ pentru C. tetani i C. perfringens. Testul plcilor semineutralizate poate fi practicat la nivelul centrului de referin. Folosim o plac cu mediul Nagler. Pe jumtate din plac etalm anti-toxin (lecitinaz). Dup uscarea plcii inoculm n striuri o tulpin martor pozitiv, o tulpin martor negativ i cteva tulpini de testat. Incubm timp de 18-24 de ore la 35-37 C n anaerobioz. C. perfringens (ca i tulpina M+) d un rezultat pozitiv doar pe jumtatea de plac fr anti-toxin. Creterea n lapte turnesolat sau cu bromcrezol purpur (C. perfringens produce cheag alveolar n laptele turnesolat). Clostridiile sunt sensibilie la vancomicin i rezistente la colistin. Ali autori propun testarea sensibilitii la metronidazol. Caractere antigenice: pot fi testate n centrele de referin. Alte teste care pot fi efectuate la nivelul centrelor de referin Demonstrarea prezenei tetanospasminei prin seroneutralizare la oareci (un animal este protejat cu 1-2 ore nainte de test prin injectare subcutanat a 1000 de UAI de anti-toxin tetanic; injectm la ambele animale 0,5 ml din cultura pe mediu lichid; animalul protejat supravieuiete, iar cellalt va prezenta semne tipice de tetanos) Testarea (la om) a prezenei anti-toxinei tetanice n titruri protective prin ELISA sau hemaglutinare (T 0,01 UAI / ml). Demonstrarea prezenei toxinei botulinice n alimente, materii fecale, ser sau n medii de cultur. Spre ex. prelevm din bulionul VF pe care am identificat multiplicarea bacterian, centrifugm iar supernatantul l mprim n 2 tuburi. Unul dintre tuburi l supunem temperaturii de 100 C (toxina botulinic este termosensibil). Inoculm intraperitoneal p.p. la dou loturi de oareci. Dac oarecii injectai cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba de toxina botulinic. Urmrim oarecii timp de 2-4 zile pentru a remarca apariia semnelor de botulism (reducerea mobilitii, respiraii ample, contracii ale muchilor abdominali urmate de convulsii i deces). Prezena toxinei botulinice poate fi confirmat prin seroneutralizare (protejm spre ex. un animal de laborator cu anti-toxin de tip A i un alt animal de laborator cu anti-toxin de tip B dup care i injectm cu p.p. respectiv; dac animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A supravieuiete iar cellalt animal moare cu semne caracteristice pentru botulism, n mediul de cultur a existat C. botulinum de tip A) Titrarea toxinei botulinice, prin metoda DL50 (folosind injectarea p.p. n vena cozii i curbe standard pentru interpretare, pentru fiecare serotip) Titrarea toxinei botulinice printr-o tehnic de tip ELISA (poate detecta 10 pg) Testul inhibiiei sialidazei, pozitiv n 2-6 ore pentru C. perfringens etc.5. Antibiograma de regul nu se realizeaz. Clostridiile sunt sensibile la penicilin, cefalosporine, vancomicin, tetracicline, metronidazol etc, ns tratamentul este mult mai complex; n unele dintre bolile clostridiene nu a fost eficacitatea tratamentului cu antibiotice sau chimioterapice nu a fost dovedit.