1

ACADEMIA ROMÂNĂ

INSTITUTUL DE VIRUSOLOGIE ŞTEFAN S. NICOLAU

BUCUREŞTI

TEZA DE DOCTORAT

„ROLUL UNOR PROTEINAZE ÎN ANGIOGENEZĂ ȘI

PROLIFERAREA TUMORALĂ”

- REZUMAT -

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC:

Dr. Lorelei Irina Braşoveanu, CS I

DOCTORAND:

Daniela Glăvan

BUCUREŞTI

- 2019-

2

ROMANIAN ACADEMY

ŞTEFAN S. NICOLAU INSTITUTE OF VIROLOGY

BUCHAREST

PhD Thesys

”THE ROLE OF PROTEINASES IN ANGIOGENESIS

AND TUMOUR PROLIFERATION”

SUMMARY

PhD Advisor:

Dr. Lorelei Irina Braşoveanu, CS I

PhD fellow:

Daniela Glăvan

BUCHAREST

- 2019 -

3

CUPRINS Pag.

Introducere 4

Scopul, obiectivele şi originalitatea tezei 7

Prezentarea structurii tezei 8

Cercetari personale 9

Materiale şi metode 9

Rezultate şi discuţii 11

Concluzii 28

Bibliografie selectivă 32

4

INTRODUCERE

Cancerul reprezintă a doua cauză de deces la nivel mondial, după bolile

cardiovasculare. În ciuda progreselor permanente care au loc în domeniul oncologiei, a

programelor de screening a populației, incidența și mortalitatea datorate acestei boli, rămâne

extrem de ridicată. În 2018, conform programului GLOBOCAN (Global Cancer Statistics), au

fost estimate 18,1 milioane de cazuri noi de cancer (Bray F., 2018).

La femei, cancerul de sân este cel mai frecvent tip de cancer diagnosticat, reprezentând

totodată şi principala cauză de deces, urmat de cancerul colorectal, pulmonar şi cel de col

uterin. În Europa, cancerul mamar este cel mai frecvent tip de cancer care afectează femeile,

cu peste 450.000 de noi cazuri diagnosticate în fiecare an și 143.000 de decese. România,

alături de Grecia şi Slovacia, sunt singurele ţări din Uniunea Europeană care nu au un

program naţional de screenig pentru cancerul mamar, în condiţiile în care în ţara noastră,

cancerul de sân are o mortalitate cu 25% mai mare decât în Uniunea Europeană. În fiecare an,

în România sunt diagnosticate peste 8.900 de cazuri noi de cancer mamar, dintre care 1.800

sunt în stadii avansate ale bolii. În România, comparativ cu alte state europene, depistarea

cancerului mamar se face în stadiile III-IV (58,4% dintre paciente), în timp ce în alte țări,

depistarea cazurilor noi de cancer se face în stadiile incipiente ale bolii.

De aceea, în ultimii ani, s-au dedicat numeroase studii înțelegerii acestei boli la nivel

molecular, identificării de biomarkeri noi, care intervin în diferite etape ale inițierii și

progresiei tumorale, dar și în metastazare. Cauzele cancerului mamar nu sunt inca pe deplin

elucidate. Studiile epidemiologice privind etiologia cancerului de sân, împart factorii

etiologici în două categorii: exogeni şi endogeni. Dintre factorii exogeni amintim: dieta,

alcoolul, procedurile medicale, radiaţiile ultraviolete, comportamentul sexual şi reproductiv.

În categoria factorilor endogeni sunt incluse: vârsta pacientei, istoricul familial, densitatea

sânilor, menarha, numarul de sarcini, terapia de substituție hormonală.

Încadrarea în clasificarea TNM (”Tumor-Node-Metastasis”) se face numai după

analiza tuturor ţesuturilor prelevate. Examenul histopatologic postoperator a tumorii excizate

trebuie să conțină: tipul histologic, gradul de diferențiere al tumorii (G), mărimea tumorii,

numărul total al ganglionilor limfatici excizați, și dintre aceștia câți sunt invadați, statusul

5

receptorilor estrogenici (ER), progesteronici (PgR) și a receptorilor HER2, precum și

evaluarea marginilor de rezecție.

Carcinogeneza este un proces care are loc în mai multe etape în care se produc

modificări distincte, atât moleculare, cât și celulare și presupune trei etape: inițierea, promoția

și progresia tumorala. Proliferarea este o etapă importantă a dezvoltării și progresiei

cancerului. Aceasta se manifestă prin alterarea expresiei și/sau a activității proteinelor legate

de ciclul celular. Activarea mai multor căi de transducție a semnalului stimulează de

asemenea creșterea celulelor. Etapele inițiale ale dezvoltării tumorale sunt asociate cu un

răspuns fibrinogenic și dezvoltarea unui mediu hipoxic care favorizează supraviețuirea și

proliferarea celulelor stem canceroase. O parte din strategia de supraviețuire a acestor celule

se poate manifsta prin modificări ale metabolismului celular. După apariția tumorilor,

creșterea și metastazarea pot fi susținute printr-o supraproducție de hormoni (în cancerele

hormon dependente), prin promovarea angiogenezei, declanșarea autofagiei (Feitelson M.A.,

2015).

Angiogeneza este un proces complex, multistadial, care include interacțiunea dintre

celulele endoteliale, celulele neoplazice și componenţi ai matricei extracelulare. Baza

moleculară a acestui mecanism poate fi creșterea producției de factori angiogenici sau poate fi

pierderea inhibitorilor de angiogeneză. Trecerea la un fenotip angiogenic este reglată de o

schimbare a echilibrului între reglatorii pozitivi și cei negativi (Yadav L. și colab., 2016). În

condiții normale, balanța înclină spre fenotipul anti-angiogenic. Hipoxia reprezintă pricipalul

stimul al “switch-ului” angiogenic. Angiogeneza este reglată de factori de creștere, citokine

proangiogenice, modulatori ai angiogenezei și inhibitori ai neovascularizației.

Glicozilarea aberantă este adesea considerată o “amprentă a cancerului”, jucand un rol

fundamental în dezvoltarea tumorilor și în progresie. Astfel, glicanii au un rol important în

semnalizarea celulelor canceroase, în disocierea și invazia celulelor tumorale, în interacțiunile

celulă- matrix, precum și în angiogeneză, metastazare și modularea imunității. Rezistența la

tratament, scăparea de sub controlul sistemului imun al gazdei, invazia tumorală și

angiogeneza, metastazarea, sunt strâns legate de sialilarea aberantă a glicoproteinelor și

glicolipidelor

Biomarkerii tumorali fac posibilă detectarea și diagnosticul cancerelor încă din

primele stadii de dezvoltare a tumorii. Aceștia pot fi proteine, imunoglobuline, hormoni,

enzime, cu concentrații mult mai mari decât în mod obișnuit.

Perturbarea membranei bazale este o caracteristică a malignității. Matrix

metaloproteinazele (MMP) sunt o familie de endopeptidaze, enzime care joacă un rol

6

important în invazie și metastazare prin degradarea proteolitică a matrixului extracelular, în

migrare și angiogeneză, prin distrugerea adeziunilor celulă-celulă și celulă-matrix. Nivelurile

MMP crescute se corelează cu invazia, metastazele și prognosticul rezervat în multe tipuri de

cancer, iar modelele animale dau dovadă pentru rolul cauzal al activității MMP în progresia

cancerului. Un alt biomarker studiat pentru rolul său în stimularea creșterii și proliferării

celulelor canceroase, precum și la formarea metastazelor, este o altă proteinază, catepsina D,

factor de prognostic în cancer de sân și endometru.

Stresul oxidativ a fost descris pentru prima dată în anul 1985 și se referă la dezechilibrul

dintre radicalii liberi care formează sistemul pro-oxidant și antioxidanții endogeni, fie din

cauza acțiunii exagerate a oxidanților, fie din cauza reducerii capacității de luptă a sistemului

endogen. Rolul speciilor reactive de oxigen (ROS) în cancer a fost investigat intens în ultimii

ani, deoarece acumularea de specii reactive în celulele canceroase, au un rol important în

inițierea și evoluția acestei boli (Dayem A.A. și colab., 2010). ROS reglează fiecare etapă a

dezvoltării tumorii, inclusiv transformarea, supraviețuirea, proliferarea, invazia, metastazarea

și angiogeneza (Prasad S. și colab, 2016). Stresul oxidativ poate provoca angiogeneza în

cadrul carcinomului mamar, deoarece radicalii de oxigen măresc producția de factori

angiogenici (IL-8 și VEGF), promovează secreția de MMP-1, o colagenază care ajută

creșterea vaselor în micromediul tumoral (Brown N.S. și colab., 2000) și activează MMP-2,

posibil prin reacţia radicalilor de oxigen cu grupările tiol din cadrul MMP-2 (Rajagopalan S.,

1996). Rolurile contradictorii ale ROS și stresului oxidativ în cancerul mamar, fie de inducere

și progresie tumorală, fie de prevenire a tumorigenezei prin alte mecanisme, au determinat

diverse grupuri de cercetare să investigheze potențiali modulatori de stres oxidativ, utili în noi

strategii anticanceroase (Gurer-Oslan H. și colab., 2017). Utilizarea antioxidanților exogeni ar

putea îmbunătăți efectele terapeutice potențând activitatea antitumorală a citostaticelor, cât și

reducând toxicitatea acestora asupra țesuturilor sănătoase (Jaiswell A.K., 1994). In plus,

utilizarea imunoterapiei de tipul anticorpilor monoclonali ce țintesc specific celulele maligne,

micro-vasculatura tumoală existentă (ex. Bevacizumab/ Avastin) împreună cu citostatice și

agenți biologici ar putea îmbunătăți răspunsul la terapie atât în cancerul mamar primar, cât și

în cel metastatic.

Medicina translațională, personalizată, completată de noile descoperiri din domeniul

medicinei de precizie, reprezintă o punte de legatură între cercetarea fundamentală și cea

clinică, permițând pe de o parte ca descoperirile cercetătorilor din laborator să fie transferate

în clinică și folosite în diferite trialuri clinice, iar pe de altă parte, datele clinice obținute în

7

diferite studii clinice să poată fi folosite pentru abordări complexe ale unor teme de cercetare,

unor studii in vitro în laboratoarele de cercetare.

SCOPUL, OBIECTIVELE SI ORIGINALIZATEA TEZEI

Scopul tezei de doctorat a constat în evaluarea expresiei unor biomarkeri solubili asociați

proceselor de proliferare celulară, angiogeneză și stres oxidativ în cancerul mamar, care să

poată fi utilizați în clinica oncologica pentru îmbunătățirea procedurilor de diagnostic,

prognostic, evidențierea riscului de metastazare, precum și monitorizarea tratamentului. In

plus, s-a urmarit in vitro efectul modularii de catre agenți chimioterapeutici și/sau biocompuși

a expresiei biomarkerilor luați în studiu.

Obiectivele generale ale studiului au constat în:

utilizarea unei palete largi de teste biochimice, în vederea analizării unui lot selecționat

de paciente cu cancer mamar, pentru evidențierea timpurie a metastazelor și evaluarea

răspunsului la tratament;

studiul in vitro și in vivo a profilului biomarkerilor solubili asociați proceselor de

proliferare tumorală, angiogeneză și stres oxidativ printr-o paletă largă de tehnici

moderne, optimizate și adaptate scopului urmărit (culturi celulare, teste de proliferare și

citotoxicitate, analize celulare în timp real, metode spectrofotometrice, teste imuno-

enzimatice),

elaborarea unor modele experimentale in vitro pentru studiul modulării expresiei unor

biomarkeri solubili asociați proceselor de progresie tumorală, angiogeneză și stres

oxidativ de către agenți terapeutici și compuși bioactivi

analize de corelație a rezultatelor obținute.

Originalitatea lucrării a constat în:

- Implementarea unui model experimental in vivo de șobolani purtători de carcinosarcom

Walker 256, supus unei monitorizari biochimice multiparametrice, în dinamica creșterii

tumorale, pentru evidențierea apariției matastazelor;

- Implementarea a două modele experimentale in vitro, uman și murin, utilizate în

experimente de modulare de către tratamente cu citostatice și/sau compuși biologic activi a

expresiei unor biomarkeri solubili asociați proceselor de proliferare tumorală, angiogeneză si

stres oxidativ.

8

STRUCTURA TEZEI

Teza de doctorat „Rolul unor proteinaze în angiogeneză și proliferarea tumorală”

este structurată în 10 capitole, și cuprinde două părți: Partea teoretică, în care sunt discutate

succinct, pe baza unei bogate bibliografii, reperele știintifice ale subiectului abordat, și partea

experimentală, ce constă în cercetarile originale, realizate in vitro sau in vivo.

Fundamentarea științifică s-a realizat pe parcursul a 6 capitole teoretice și cuprinde 65

de pagini. In „Biologia tumorilor mamare” au fost descrise pe scurt aspecte legate de

epidemiologia, factori etiologici implicați, aspecte anatomo- patologice și stadializarea

cancerului mamar. In al-2-lea capitol („Progresia tumorală”) sunt descrise aspecte

referitoare la etapele carcinogenezei, angiogeneza tumorală, etapele sale și factorii modulatori

(activatori și inhibitori) ai acestui proces. Capitolul trei „Glicozilarea în cancer” prezintă

informații despre rolul glicozilării în cancer, precum și asocierea acesteia cu procesul de

metastazare, fiind urmat de capitolul patru, „Proteinaze in cancer”, în care sunt descrise

tipurile de proteinaze implicate în cancer, cascada proteolitică, fiind în detaliu descrisă

implicarea catepsinei D și metaloproteinazelor în cancerul mamar. Capitolul consacrat

Stresului oxidativ abordează pe scurt aspecte legate de rolul speciilor reactive de oxigen în

cancer, hipoxie, peroxidarea lipidică și rolul tiolilor albuminici în tratamentul cu citostatice.

Partea teoretică a tezei se încheie cu capitolul șase „Abordări terapeutice în cancerul

mamar” în care sunt menționați agenții chimio- sau imuno-terapeutici administrați în

cancerul mamar, și caracterizați compușii bioactivi utilizați pe parcursului realizării studiilor

descrise în teza de doctorat.

Partea experimentală cuprinde 4 capitole bazate pe determinări și modele

experimentale realizate in vivo și in vitro. Fiecare capitol cuprinde detalii ale metodologiei

utilizate (principiul metodei, material biologic, reactivi și materiale, aparatura, modul de

lucru), urmate de prezentarea și discutarea rezutatelor obținute, ca și concluziile studiilor

efectuate. Acestea din urmă sunt sintetizate în capitolul de „Concluzii generale”, care sunt

urmate de o listă de abrevieri, lista referințelor bibliografice consultate, precum lista tabelelor

și a figurilor incluse in teza de doctorat.

9

PARTEA EXPERIMENTALĂ

METODOLOGIE

Material biologic și tehnici de culturi celulare:

1) În scopul realizării unor testelor de evaluare a expresiei unor biomarkeri cu rol in

diagnosticul, prognosticul și monitorizarea tratamentului la paciente cu cancer mamar cu risc

crescut de recidivă și/sau metastazare.s-a utilizat un lot de 70 de paciente cu cancer mamar, de

la care s-au prelevat fragmente de ţesut tumoral și sânge, în vederea determinărilor enzimatice

şi de stres oxidativ. În plus, în acest studiu a fost inclus un lot de 20 donatoare sănătoase,

cărora li s-au recoltat probe de sânge, care au servit drept control.

2) Pentru realizarea modelului experimental in vivo s-au folosit 60 șobolani Wistar albino,

normali, sănătoşi, cu o greutate medie de 200 g, în vârstă de 8 săptămâni proveniți din

Biobaza Institutului Oncologic ”Prof. Dr. Alex. Trestioreanu” București (I.O.B). Procedurile

experimentale (inoculare cu celule tumorale de carcinosarcom Walker – forma ascitică,

tratamente, sacrificare) au fost aprobate de către Comisia de etică a I.O.B.

3) Pentru realizarea modelelor experimentale in vitro s-au folosit : a) linia celulara murină de

carcinom LLC-Walker 256, cultivată în mediu de cultură TC199 suplimentat cu 2mM L-

glutamină și 10% ser fetal bovin (FBS) decomplementat, 2mM L-glutamina și 1 mM

HEPES;. b) linia celulară umană de adenocarcinom mamar MCF-7 (ECACC), cultivată în

mediu de cultură DMEM:F12 suplimentat cu 2mM L-glutamină și 10% ser fetal bovin (FBS)

decomplementat, 2mM L-glutamina și 1 mM HEPES.

4) Tratarea liniilor celulare cu citostatice sau agenți biologici, biocompuși: liniile celulare

aflate în cultură au fost tratate pentru perioade de timp variate cu diferite concentrații de

agenți chimioterapeutici (Epirubucina/EPI, Endoxan/EDX), anti-angiogenici (Bevacizumab/

Avastin (AVA), mAb anti-VEGF) sau biocompuși (quercetina/QCT, resveratrol/RSV sau

curcumina/CRM). Apoi, supernatantele au fost recoltate, prelucrate și stocate la -800C.

Monitorizarea proliferarii celulare vs citotoxicitate:

a) În scopul evaluării capacității citotoxice a unor agenţi chimioterapeutici şi a unor

biocompuși, în liniile celulare standardizate luate în studiu (LLC-WRC 256 și MCF-7) s-a

folosit metoda colorimetrica MTS și kit-ul “CellTiter 96® AQueous One Solution Cell

Proliferation Assay” (Promega, SUA).

b) Testarea citotoxicității agenților chimioterapeutici și biocompușilor s-a realizat prin analiza

celulară în timp real (RTCA, utilizând analizorul RTCA-DP și a tehnologiei xCELLigence.

10

Tehnici de laborator utilizate pentru evaluarea expresiei biomarkerilor în seruri sau

supernatante de culturi celulare

- Evaluarea catepsinei D în seruri sau supernatante de cultură s-a făcut după metoda

colorimetrică adaptată dupa metoda lui Capony F. și colab. (1987). În urma hidrolizei

hemoglobinei, în prezența catepsinei D, se eliberează în mediul de reacție produși de hidroliză

solubili în acid tricloracetic, al căror conținut de catepsină D poate fi determinat

spectrofotometric, la = 280 nm.

- Dozarea acidului sialic a fost adaptată după metoda lui după Kattermann&Kriegel

(1981) și se bazează pe oxidarea cu acid periodic, rezultă formarea acidului β-formilpiruvic,

acesta reacționează cu două molecule de acid tiobarbituric și rezultă un cromofor roz, cu

maximul de absorbanță la = 549 nm .

- Determinarea concentrației produșilor de peroxidare lipidică s-a făcut după o metodă

adaptată după Janero D.R. (1990) și se bazează pe reacția MDA cu acidul tiobarbituric, în

urma căreia rezultă un aduct colorat în roșu care prezintă un maxim de absorbție la =535 nm.

- Determinarea concentrației tiolilor albuminici s-a făcut după o metodă adaptată după

Albini A. (1990). Grupările tiol (-SH) se pot cuantifica în urma reacţiei acestora cu acidul

5,5`-ditio-bis (2-nitrobenzoic) - reactivul Ellman.

- Determinarea antioxidanților totali s-a făcut după o metodă adaptată după Benzie

&Strain ( 1996).

Analiza statistică a datelor s-a realizat utilizând programul GraphPad sau Student t test.

Analiza corelațiilor s-a facut prin regresie liniară (indici de corelatie r2, statistic semnificativi

pentru p<0.05).

11

REZULTATE ȘI DISCUȚII

I. EVALUAREA EXPRESIEI UNOR BIOMARKERI SOLUBILI LA PACIENTELE

CU CANCER MAMAR

1. Caracterizarea clinico-patologică a pacientelor cu cancer mamar

Studiul a inclus în lot un numar de 70 de subiecţi (paciente cu carcinom mamar)

caracterizate din punct de vedere histopatologic. Dintre acestea, un număr de 29 paciente au

avut vârsta până în 50 ani, iar 41 de paciente au avut vârsta peste 50 ani.

Din punct de vedere histopatologic, toate pacientele incluse în studiu au fost

diagnosticate cu carcinom invaziv ductal (carcinom glanduliform și trabecular), cu invazia

țesutului gras peritumoral. În ceea ce privește gradul de diferențiere, 6 paciente au avut tumori

cu gradul G1, 54 paciente cu gradul G2 și 10 paciente cu gradul G3. Nici o pacientă luată în

studiu nu prezenta semne clinice sau radiografice de metastaze la distanță. Cele mai multe

paciente au avut o tumoră mamară mai mare de 2 cm, iar in ceea ce privește numărul de

ganglioni invadați 49% nu au avut nici un ganglion invadat, 24% au avut intre 1-3, iar 18%

peste 3 ganglioni invadati.

2. Evaluarea catepsinei D în serurile pacientelor cu cancer mamar

Evaluarea catepsinei D, proteinaza cu rol prognostic important în cancerul mamar, a

evidențiat o creștere a concentrației catepsinei D în serurile pacientelor incluse în studiu, față

de lotul sănătos. Creșterea nivelurilor catepsinei D s-a corelat cu creșterea gradului de

diferențiere tumorală, media valorilor catepsinei D în serurile pacientelor fiind de 28,31 nM.

Astfel, media nivelurilor de catepsina D in serurile testate a fost de 25 nM în grupul

pacientelor G1, 28,13 nM pentru G2 și 31 nM pentru G3, comparativ cu media valorilor din

serurile donatoarelor sanatoase, de 6,65 nM. Concentrația a variat ușor în funcție de vârsta

pacientelor, în grupul de peste 50 de ani fiind de 51,32 nM, față de 46,42 nM în grupul

pacientelor până în 50 de ani. Testarea catepsinei D în serurile pacientelor cu cancer mamar s-

a realizat în dinamică, înainte de intervenția chirurgicală și la 6 luni după intervenție. In

ambele grupuri de vârstă s-a constatat reducerea nivelurilor de catepsină D dupa intervenție,

de la 46,42 nM la 28,9 nM pentru pacientele până în 50 de ani, și de la 51,32 nM la 27,14 nM

pentru pacientele peste 50 de ani (Figura 1).

12

Figura 1. Concentrația catepsinei D în serurile pacientelor cu cancer mamar

În analizele multiparametrice, un nivel ridicat de catepsină D a fost cel mai important

factor independent în prezicerea supraviețuirii globale la pacientele fără noduli invadați.

Supraexprimarea catepsinei D în cancerul mamar, a fost asociată cu un risc crescut de

recurență și moarte. (Kabel A.M., 2017). Determinarea catepsinei D ar putea contribui atât la

selectarea pacientelor cu risc de metastazare, cât și pentru personalizarea tratamentului.

3. Determinarea acidului sialic la pacientele cu cancer mamar

Dozarea acidului sialic, adaptată după metoda lui după Kattermann&Kriegel (1981),

se bazează pe oxidarea cu acid periodic, rezultand formarea acidului β-formilpiruvic, care

reacționează cu două molecule de acid tiobarbituric și rezultă un cromofor roz, cu maximul de

absorbanță la lungimea de undă = 549 nm.

Evaluarea acidului sialic (AS), marker al glicozilarii aberante în cancerul mamar, a

evidențiat o creștere a concentrației în serurile pacientelor incluse în studiu, față de lotul

sănătos. Creșterea nivelurilor AS s-a corelat cu creșterea gradului de diferentiere tumorală.

Astfel, media nivelurilor de AS în serurile pacientelor incluse în studiu a fost de 2,72 mM,

distribuite astfel: o medie de 2,49 mM în grupul pacientelor aflate în faza G1, 2,71 mM pentru

G2 și 2,82 mM pentru G3, comparativ cu media valorilor AS din serurile donatoarelor

sănătoase, de 1,92 mM (Figura 2, panel A).

Concentrația AS a variat usor și functie de vârsta pacientelor, în grupul de peste 50 de

ani fiind de 2,55 mM, față de 2,7 mM în grupul pacientelor până în 50 de ani. Testarea AS în

serurile pacientelor cu cancer mamar în dinamică, înainte de intervenția chirurgicală și la 6

luni dupa intervenție, a arătat pentru ambele grupuri de vârstă o ușoară reducere a nivelurilor

dupa intervenție, de la 2,7 mM la 2,1 mM pentru pacientele până în 50 de ani, și de la 2,55

mM la 2 mM pentru pacientele peste 50 de ani (Figura 2, panel B).

13

Figura 2. Nivelurile de acidul sialic in serurile pacientelor cu cancer mamar

O valoare mărită a acidului sialic, care se menține în timp, se corelează cu un

prognostic rezervat. Acest lucru este arătat în alte studii, în care s-a constatat că acidul sialic

este un marker pentru malignitate, a cărui valoare apare crescută în mai multe tipuri de

cancere, inclusiv în cancerul mamar. Cu toate că nivelul acidului sialic seric apare mărit și în

stări benigne, în condiții inflamatorii, limitând determinarea acidului sialic în screening, în

combinație cu alți markeri poate fi util în diagnosticare, în stadializare și în monitorizarea

răspunsului terapeutic (Zhang Z., 2018).

4. Evaluarea statusului oxidativ în serurile pacientelor cu cancer mamar

Rolul speciilor reactive de oxigen la nivel celular este unul dual. Când ROS sunt în

concentrație mică, ele au un rol în semnalizarea celulară, convertind fenotipul celular la

angiogeneză și neovascularizație, care contribuie la creșterea și proliferarea tumorii. Pe de altă

parte, când producția de ROS este în exces, aceasta devine distructivă și lezează celulele

tumorale. Generarea stresului oxidativ în cursul procesului de creștere și dezvoltare tumorală

este evidențiată în special prin stimularea peroxidarii lipidice, proces în urma căruia sunt

generate numeroase aldehide cu caracter electrofil, compuși stabili care pot difuza în

interiorul celulei exercitând mai multe efecte citotoxice .

a) Determinarea concentrației produșilor de peroxidare lipidică (dupa Janero D.R., 1990)

Peroxizii lipidici (PX) sunt molecule care se formează prin atacul radicalilor liberi,

cum ar fi ROS sau a speciilor reactive de azot (RNS), asupra reziduurilor de acizi grași

polinesaturați (PUFA) sau asupra fosfolipidelor membranare. Investigarea reacției de

14

peroxidare lipidică prin măsurarea produsului final malondialdehida (MDA) a relevat o serie

de rezultate individuale grupate în funcție de gradul de difererențiere.

Nivelurilor PX au crescut usor, odată cu creșterea gradului de diferențiere tumorală.

Astfel, media nivelurilor de PX în serurile testate a fost de 5,75 M/100 mL în grupul

pacientelor G1, 5,95 M/100 mL pentru G2 și 6,05 M/100 mL pentru G3, comparativ cu

media valorilor din serurile donatoarelor sanatoase, de 2,11 M/100 mL (Figura 3). Per

ansamblu, media PX în întreg lotul de paciente cu cancer mamar a fost de 5,96 M/100 mL.

Valorile crescute se asociază cu dimensiunea tumorală, dar și cu gradul de diferențiere,

sugerând că tumora este un factor de stres oxidativ.

Generarea stresului oxidativ în cursul procesului de creștere și dezvoltare tumorală

este evidențiată în special prin stimularea peroxidarii lipidice, proces în urma căruia sunt

generate numeroase aldehide cu caracter electrofil, compuși stabili care pot difuza în

interiorul celulei exercitând mai multe efecte citotoxice. Peroxizii lipidici sunt molecule care

se formează prin atacul radicalilor liberi, cum ar fi ROS sau a speciilor reactive de azot

(RNS), asupra reziduurilor de acizi grași polinesaturați (PUFA) sau asupra fosfolipidelor

membranare.

Aceste rezultate sugerează instalarea unui stres oxidativ asociat prezenței tumorale și

incapacitatea sistemelor antioxidante endogene să neutralizeze și să capteze moleculele active

și reactive de oxigen produse de tumoră. Produșii de peroxidare lipidică ar putea fi

responsabili de blocarea ciclului celular și/ sau a mecanismelor apoptotice ducând la scăderea

eficacității terapeutice și instalarea rezistenței la tratament. Excesul de produși de peroxidare

lipidică poate inhiba progresia ciclului celular prin blocarea kinazelor dependente de cicline

menținând celulele tumorale în faza G0, prelungirea fazei G1 și întârzierea intrării în faza S,

reducându-se rata de proliferare a celulelor tumorale. Deși stresul oxidativ intens ar putea fi

eficient în inducerea citotoxicității tumorale, stresul oxidativ moderat indus ar putea avea

efecte contrare contribuind la dezvoltarea mecanismelor de rezistență si scăzând eficacitatea

terapeutică. Mai mult, numeroase studii in vivo și in vitro susțin că celulele și țesuturile

tumorale suferă un stres oxidativ intens, cronic, subletal, comparativ cu celulele normale,

chiar și în lipsa unor stimulări exogene prealabile, fiind absolut necesară pentru viabilitatea și

creșterea tumorală. Stresul oxidativ intens intratumoral poate juca un rol important în procesul

de invazie tumorală și metastazare.

15

b) Determinarea concentraţiei tiolilor albuminici (dupa Albini A., 1990).

Pentru a defini în continuare termenii de stres oxidativ s-a urmărit și modul în care

speciile reactive de oxigen acționează asupra proteinelor, știindu-se că ținta primară o

reprezintă lipidele, iar speciile radicalice extrem de reactive aflate încă în circulație și produse

în exces atacă și dublele legături din structura proteinelor. Tiolii (SH) obținuți în urma acestui

atac pot reprezenta extensia degradării oxidative proteice și astfel, indirect, să fie o măsură a

stresului oxidativ.

Spre deosebire de PX, nivelurilor SH au scăzut în serurile pacientelor cu cancer

mamar comparativ cu lotul martor, atingând valoarea medie de 366,92 mM, scăderea fiind

corelată invers cu creșterea gradului de diferentiere tumorală. Astfel, media nivelurilor SH în

serurile testate a fost de 398,8 mM în grupul pacientelor G1, 372,63 mM pentru G2 și 327,92

mM pentru G3, comparativ cu media valorilor din serurile donatoarelor sănatoase, de 415,27

mM. Acțiunea metaboliților activi ai oxigenului la nivelul proteinelor structurale sau

enzimatice determină denaturarea acestora. Un factor hotărâtor în această reacție de oxidare a

grupărilor –SH proteice de către SRO, este cel steric. Expunerea grupărilor tiolice din proteine

este esențială. Așa se explică creșterea sensibilității la oxidare a proteinelor denaturate

(aceasta proprietate este utilizată ca o metodă eficientă de identificare a conținutului în grupări

tiolice, precum și pentru identificarea structurii secundare și terțiare a proteinelor).

Prin degradarea oxidativă se inhibă activitatea enzimatică, ca urmare a modificării

centrului catalitic activ (datorită oxidarii grupărilor tiolice sau hemului, dar și prin degradari

oxidative ale ciclurilor aromatice din structura unor aminoacizi).

Figura 3. Nivelurile serice ale parametrilor de stres oxidativ la pacientele cu cancer

mamar

c) Determinarea antioxidanților totali (AO) (după Benzie &Strain, 1996)

Balanța stresului oxidativ în cazul pacientelor cu cancer mamar este înclinată spre

producerea speciilor active în detrimentul captării acestora. Aceste valori se asociază în

16

general cu starea clinică a pacientelor, cu modul de alimentație, stil de viață și putem afirma

că parametrii investigați pot completa tabloul markerilor utili în monitorizarea eficienței

tratamentului și a evoluției bolii.

Nivelurile AO sunt crescute în serurile pacientelor cu cancer mamar comparativ cu

lotul martor. Testele efectuate au evidențiat o valoare medie a AO de 1368,2 mM, crescută

comparativ cu media valorilor din serurile donatoarelor sanatoase, de 1260 mM. Aceasta

creștere se înregistrează în grupurile pacientelor cu gradul 1 sau 2 de diferențiere. Astfel,

media nivelurilor AO în serurile testate a fost de 1546,6 mM pentru G1 și 1426,48 mM pentru

G2. Media valorilor de AO determinate în serurile pacientelor în G3 a fost de 1001 mM

(Figura 3). Trebuie însă avut în vedere faptul că acest grup a cuprins un numar mic de cazuri.

În foarte multe afecțiuni umane, stresul oxidativ este doar o consecință, nu o cauză a

procesului patologic al bolii. În celula neoplazică, instalarea dezechilibrului dintre producția

de specii reactive de oxigen și eliminarea radicalilor liberi conduce la o stare de stres oxidativ

și la distrugerea unor componente esențiale ale celulei Mai multe studii atestă faptul că

stresul oxidativ rezultat din acest dezechilibru, are un rol cauzator dar este și o consecință a

carcinogenezei, interferând cu toate fazele acestui proces, cum ar fi inițierea, promovarea,

progresia, invazia și metastazarea.

II. MODEL EXPERIMENTAL IN VIVO (tumora Walker 256)

Carcinosarcomul Walker 256 este o tumoră standard utilizată în screening-ul

preclinic al substanţelor antitumorale, precum şi în diferite modele experimentale de chimio-

radio-imunoterapie. Este un carcinom transplantabil la şobolan, cu ritm rapid de creştere,

apărut spontan la nivelul glandei mamare a unei şobolance gestante (semnalat în 1928). În

faza timpurie de dezvoltare, tumora are aspect carcinomatos (bine vascularizat), pentru ca în

fază mai avansată de creştere să îmbrace un aspect sarcomatos (Comişel V., 1999).

Studiul a fost efectuat pe 60 șobolani Wistar albino, normali, sănătoşi, cu o greutate

medie de 200 g, în vârstă de 8 săptămâni proveniți din Biobaza Institutului Oncologic”Prof.

Dr. Alex. Trestioreanu” București (I.O.B). Procedurile experimentale (inoculare, tratamente,

sacrificare) au fost aprobate de către Comisia de etică a I.O.B.

Au fost menținute condiții standard de temperatură, umiditate, hrana a fost granulată și

apă ad libitum. Procentul de prindere a grefelor tumorale subcutane este de 80-90%, cu

variaţii sezoniere; tumora metastazează rar, iar invazia ganglionilor loco-regionali are loc în

faza terminală de creştere a tumorii, când fenomenele de necroză tumorală sunt accentuate.

17

De asemenea, unele studii indică prezenţa metastazelor hepatice şi pulmonare, în faza finală a

bolii.

Varianta ascitică a tumorii Walker 256 a fost obţinută de Warren şi Gates (1936),

Planinşek (1965), Agostino şi Cliffton (1959), Comişel (1976), fiind întreţinută şi la ora

actuală, prin pasaje intraperitoneale seriate la şobolani Wistar.

In vederea efectuării experimentelor in vivo pe șololanii purtători de tumoră Walker, s-

au format 2 loturi de șobolani.

Câte 10 șobolani au fost sacrificaţi la 7, 14, 21, 28 şi 35 de zile de la grefă, momente

în care s-a evaluat tumora primară şi s-au recoltat probe biologice: ţesut tumoral, în vederea

obținerii frotiurilor și probe de sânge, în vederea obţinerii serului utilizat în dozările

ulterioare.

Tumora locală a fost măsurată cu ajutorul unui șubler, măsurînd cele două diametre şi

s-a calculat volumul tumoral după formula:

V=1/2LxW²

L=diametrul longitudinal al tumorii (mm)

W=diametrul transversal al tumorii (mm)

Figura 4. Variația volumului tumoral în diverse momente după inoculare

Astfel, în urma sacrificării a câte 10 șobolani la interval de câte o săptamană de la

inoculare, se constată inducerea tumorilor. Creșterea cea mai rapidă are loc în prima

saptamană, când volumul tumoral ajunge pana la 25 mm3. Volumul tumorii crește în

continuare, după 14 zile acesta atingând 34 mm3, iar dupa 21 de zile 40 mm

3. Dupa 5

săptamâni aceasta ajunge până la 35 mm3,

Proteazele joacă un rol important în invazie și metastazare. Studii din literatură au

arătat că anumite grupe de proteinaze sunt secretate de celulele tumorale și răspund de

0 zile

7 zile

14 zile

21 zile28 zile

35 zile

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

vo

lum

tu

mo

ral m

m3

1nr zile de la inoculare

Variatia volumului tumoral in carcinosarcomul Walker 256

18

cascada proteolitică din timpul invaziei. Catepsina D a avut o valoare crescătoare în cursul

evoluției carcinosarcomului Walker 256., ceea ce este în concordanță cu datele din literatură,

care sugerează că această enzimă joacă un rol direct sau reglator în metastazarea tumorală.

Figura 5. Activitatea catepsinei D și valorile acidului sialic pe parcursul creșterii

tumorii

Odată cu creșterea tumorii are loc o creștere a activității catepsinei D comparativ cu

lotul martor de șobolani neinoculați. Astfel, la o săptamână de la inoculare nivelurile

catepsinei D, ating valoarea medie de 13,37nM, comparativ cu 11,26 nM la lotul martor.

După încă o săptamână, valoarea catepsinei D aproape se dubleză 25,62 nM, urmând ca apoi

creșterea să nu mai fie atât de accentuată, astfel încât la 5 săptamâni să atinga valoarea de

28,32 nM.

Același profil de creștere în corelație cu volumul tumorii îl are și acidul sialic. S-a

constatat că nivelul acidului sialic seric, crește odată cu evoluția tumorii, atingând valori

aproape duble, la 35 zile de la inoculare (3,21 mM), față de momentul inoculării (1,81mM),

ceea sugerează că sunt prezente metastaze. La 2 săptamâni de la inoculare nivelurile de acid

sialic sunt de 2,62 mM, iar după alte 2 săptamâni nivelul acidului sialic atinge valoarea de

3,15 nM.

Evaluarea statusului oxidativ în serurile șobolanilor cu tumoră Walker 256

În continuare a fost realizat un model experimental care să urmarească in vivo

metabolizarea oxigenului și determinarea speciilor reactive de oxigen în contextul dezvoltării

procesului de angiogeneză. Tumora Walker 256 inoculată șobolanilor Wistar albino

reprezintă un model experimental apropiat unui model „ideal”. Susținem afirmația prin

caracteristicile acestei tumori comparativ cu altele, aflate și dezvoltate în Biobaza Institutului

Oncologic București.

Rezultatele obținute indică o creștere a reacțiilor de oxidare manifestată asupra

lipidelor, prin creșterea valorilor malondialdehidei (MDA) de peste 2 ori. Creșterea este în

dinamică, proporțională cu dezvoltarea tumorii și sugerează încă o dată faptul că tumora este

19

inductoare de specii active de oxigen. Aceasta se datorează faptului că lipidele au o distribuție

mare în organism și în membrana celulară, primul atac al radicalilor liberi de oxigen fiind la

acest nivel. In ceea ce privește nivelul tiolilor albuminici (SH) se înregistrează o mărire a

valorilor determinate cu o rată mai mică decât cea a degradarii oxidative a proteinelor,

sugerând și în același timp confirmând datele noastre prin care afirmăm că ținta primară a

atacului oxidativ o reprezintă lipidele și abia apoi, odată cu intensificarea reacțiilor în lanț ,

când se produc în exces radicali liberi, sunt atacate și moleculele proteice.

Ca reacție la creșterea stresului oxidativ de la nivel celular, tumora produce în exces

aceste proteine cu sulf (glutation, cisteină, thioredoxină, etc.) ca și măsură de protecție,

endogenă. Drept urmare, creșterea oxidării proteice la nivel tumoral nu este întotdeauna

recepționată de către organism ca un factor de stres oxidativ și nu se activează concomitent

sistemele naturale de protecție antioxidantă.

Scopul lucrării în această etapă a cercetării a fost să identificăm rolului speciilor

reactive de oxigen în cascada de semnalizare a procesului de angiogeneză. Pentru început, a

fost realizat un model experimental in vivo care a constat în inducerea carcinomului Walker

256 la șobolanii Wistar urmărindu-se parametrii biochimici de stres oxidativ în dinamica

creșterii tumorale.

Determinarea concentrației produșilor SRO

Prima etapă a fost reprezentată de urmărirea creșterii şi dezvoltării tumorale, care

implică în primul rând determinările metrologice macroscopice ale animalelor de laborator

prezentate anterior.

Rata de succes a transferului tumoral a fost bună, existând însă și câteva cazuri de

rejecții în limita marjei de rejecții spontane. Creșterea tumorală înregistrată a fost de până la

60% față de valoarea de la 7 zile post-implant.

La fel ca și în cazul activării catepsinei D, ca și a acidului sialic, mediile valorilor

peroxizilor lipidici cresc de la 5,42 mM/100 mL (înainte de inoculare) la 6,18 mM/100 mL la

7 zile post-implant și 8,75 mM/100 mL la 14 zile dupa inoculare. Rezultatele obținute indică o

creștere a reacțiilor de oxidare manifestată asupra lipidelor, prin creșterea valorilor

malondialdehidei de peste 2 ori. Creșterea este în dinamică, proporțională cu dezvoltarea

tumorii și sugerează încă o dată faptul că tumora este inductoare de specii active de oxigen.

Aceasta se datorează faptului că lipidele au o distribuție mare în organism și în membrana

celulară, primul atac al radicalilor liberi de oxigen fiind la acest nivel.

Intensificarea stresului oxidativ se observă și prin creșterea nivelurilor tiolilor în

sânge. Aceștia care sunt secretați de către tumoră și nivelurile lor sunt direct corelați cu

20

creșterea volumului tumoral și a numărului de zile de la implant. Astfel, la o săptamână după

inoculare, SH crește de la 311 uM la 335 uM, la 14 zile atingând valoarea de 375 uM.

Tumora are un comportament aparte, prin eludarea mecanismelor de control al

creșterii, ea reușește să elaboreze o serie de mecanisme adaptative la factorii de stres.

Odată formate, speciile reactive de oxigen sunt rapid descompuse de către sistemele

antioxidante. Ca si in cazul PX și SH, creșterea AO cea mai accentuată are loc în prima

săptamână de la inoculare, de la 0,66 mM la 0,99 mM. Sistemele naturale de captare au fost

activate ca urmare a instalarii unui stres oxidativ. Ele nu sunt la intensitatea necesară

neutralizarii tuturor reactivilor nou creați. Drept urmare, balanța este în continuare înclinată în

favoarea părții oxidante, în defavoarea antioxidanților.

In concluzie, în această etapă am avut drept scop demonstrarea, validarea ipotezei

conform căreia tumora induce un stres oxidativ crescut, alterează procesele de metabolizare

aerobă consecutiv angiogenezei. Tumora este un factor de stres oxidativ și se supune unei

relații duale de tip cauză-efect. Nu putem afirma dacă stresul oxidativ creat este o cauză sau o

consecință a prezenței tumorii maligne.

III. MODEL EXPERIMENTAL IN VITRO UTILIZÂND LINIA LLC-WRC 256

1. Tratarea liniei celulare LLC- WRC 256 cu agenți chimioterapeurici și biocompuși

Linia celulară LLC-WRC 256 este o linie derivată din carcinom epitelial de șobolan Walker,

țesutul de origine fiind necunoscut. Această linie este aderentă, prezintă o morfologie de tip

epitelial și are un înalt potențial tumorigenic la șobolanii nou-născuți. Menținerea în cultură a

liniilor celulare standardizate s-a realizat respectând protocoalele și utilizând mediile

recomandate de băncile de celule ATCC/ ECACC. Pasajul celulelor se realizează atunci când

acestea ajung la o confluență de aproximativ 80%, verificată prin vizualizarea la microscop a

plăcilor de cultură. In vederea efectuării testelor de modulare a nivelului de biomarkeri

eliberați de către celule în mediul de cultură, celulele ajunse la o densitate de aprox. 50% au

fost tratate cu diferite concentrații de agenți chimioterapeutici sau biocompusi. Supernatantele

au fost apoi recoltate, centrifugate și stocate în vederea efectuării testelor biochimice.

Concentrațiile de lucru au fost alese pe baza datelor furnizate de catre testele colorimetrice de

citotoxicitate cu MTS sau RTCA.

1.1. Testarea citotoxicității agenților chimioterapeutici și biocompușilor prin analiza

celulară în timp real (RTCA)

Valorile impedanței oferă informații cantitative despre statusul biologic al celulelor,

incluzând numărul de celule, viabilitatea acestora și morfologia, dar si informații despre

21

funcțiile celulare (adeziune, proliferare, apoptoză, transmitere de semnale). Metoda prezintă

avantaje majore faţă de tehnicile convenţionale deoarece nu necesită marcarea celulelor; este

asigurată cinetica în timp real, se poate controla calitatea celulelor vii, oferă un conţinut

informatic crescut. În plus, tehnica are o sensibilitate şi reproductibilitate mare și permite

monitorizarea întregii populaţii celulare. În urma derulării testelor, am obtinut informaţii

despre statusul biologic al celulelor cum ar fi proliferarea/ moartea celulară, blocarea într-o

fază a ciclului celular, modificări morfologice, apoptoza, transmitere de semnale,

citotoxicitate mediată celular sau de către compuși chimici, extracte naturale, compuși

biologic activi. Curbele de creștere în timp real au demonstrat modularea proliferării celulare

de către concentrații scalare de agenți chimioteraputici sau biocompuși. Astfel,

experimentele RTCA s-au realizat pentru celule tratate cu concentrații cuprinse între 1 uM-

100 uM epirubucina (EPI), 10-1000 uM endoxan (EDX) sau 12,5-200uM biocompuși

(quercetina/OCT, resveratrol/RSV sau curcumina/CRM). Datele obținute au permis stabilirea

concentrațiilor și timpilor de lucru.

1.2. Testarea citotoxicității agenților chimioterapeutici și biocompușilor prin metode

colorimetrice (MTS) s-a realizat prin tratarea celulelor cu aceleasi concentrații, ca și în cazul

RTCA, pentru 72h. Datele obținute concordă cu datele obținute prin RTCA. În scopul

evaluarii capacității citotoxice a unor agenţi chimioterapeutici şi a unor biocompuși în liniile

celulare standardizate luate în studiu (LLC-WRC 256 și MCF-7) s-a folosit metoda

colorimetrica MTS. Datele obținute au permis stabiliarea concentrațiilor de lucru pentru

tratarea liniilor celulare, în scopul modularii expresiei și funcțiilor unor biomarkeri. În acest

scop s-a utilizat kit-ul “CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay”

(Promega, SUA).

22

Figura 6. Citotoxicitatea agenților chimioterapeutici

Tratamentele de 72 de ore cu citostatice și Avastin au determinat creșterea procentelor

de liză celulară, și implicit scăderea viabilității celulare. Astfel, tratamentele cu epirubicină

(EPI) au indus o scădere a numărului de celule viabile de la 98,46% pentru concentrația de 1

uM până la 66,22% pentru tratamentele cu 100 uM. Eficiența endoxanului s-a dovedit a fi mai

redusă la concentrații mici, doar concentrația de 100 uM putând induce o liză celulară sub

15%. Avastinul a demostrat o acțiune citotoxicică mai redusă, 25 ug/mL determinând o

viabiliate de 98%, iar 100 uM inducând moartea a 25,17% dintre celule.

2. Modularea expresiei biomarkerilor solubili de către tratamentele cu citostatice și/ sau

compuși biologic activi

Proteinazele sunt implicate în distrucția și remodelarea țesutului normal. În modelele

tumorale s-au găsit corelații între activitatea diferitelor proteinaze și potențialul metastatic al

tumorilor. Cercetări recente au arătat că atât inhibitorii, cât și anticorpii antiproteinaze inhibă

metastazarea în modelele experimentale.

Tratamentul combinat cu EPI și EDX determină o activare mai puternică a catepsinei D,

comparativ cu efectul tratamentului singular cu 10 uM EPI. Adaugarea unui biocompus, cum

este RSV, a determinat o creștere a nivelului de catepsină D eliberată în supernatantele de

cultură.

Creșterea expresiei VEGF a fost raportată că s-a corelat cu prognosticul rezervat pentru

pacienții cu cancer. De asemenea, s-a sugerat că VEGF este un marker prognostic care

determină un risc ridicat de recidivă a bolii și dacă pacienții au noduli invadați sau nu.

Expresia VEGF se corelează cu densitatea microvasculară, indicând implicarea directă a

23

VEGF în angiogeneză. (Stathopoulos J., 2010). Studii realizate de Oh J.H. și colab.

demonstrează că Quercetina poate avea potențial terapeutic pentru tratamentul cancerului

mamar rezistent la Tamoxifen prin inhibarea Pin1 (Oh J.H. și colab., 2010).

Studiul nostru a arătat că Quercetina administrată înaintea citostaticelor are ca efect

scăderea concentrației de VEGF, deci scăderea angiogenezei. Rezultatele sunt în concordanță

cu cele obținute de Oh J.H. și colab.,

Curcumina, un polifenol natural din turmeric, care prezintă proprietăți puternice

antioxidante, antiinflamatorii și antiseptic, inhibă angiogeneza mediată de VEGF în celulele

endoteliale intestinale uman prin inhibarea COX-2 și MAPK. În plus, s-a constatat că

Curcumina inhibă producția de VEGF de la diferite celule tumorale. (Lin H. și colab., 2015).

Liu Z. și colab. au constatat că efectul inhibitor al Resveratrolului asupra proliferării

celulare crește odată cu creșterea concentrației de Resveratrol. De asemenea, efectul inhibitor

a crescut cu timpul. Resveratrolul a avut un efect inhibitor asupra exprimării VEGF și a

inhibat semnificativ proliferarea celulelor tumorale. Resveratrolul poate exercita un efect

antitumoral prin inhibarea expresiei VEGF în celulele tumorale (Liu Z., Li Y., Yang R.,

2014). În studiul nostru, la concentrația de lucru, Resveratrolul nu a avut o influență marcantă

asupra VEGF, poate probabil trebuia mărită concentrația acestuia.

Curcumina, un polifenol natural din turmeric, care prezintă proprietăți puternice

antioxidante, antiinflamatorii și antiseptice, a fost folosită de secole pentru tratarea

inflamației, a tumorilor și a altor boli. Dovezile acumulate sugerează că curcumina își

manifestă activitatea anti-tumorală prin modularea diferitelor ținte, fie prin interacțiune

directă, fie prin modularea expresiei genelor. S-a demonstrat că posedă activitate

antiangiogenică directă in vitro și in vivo.

Matrix metaloproteinaza- 2 (MMP-2) este o enzimă cu funcții importante în invazia

cancerului mamar și în metastaze, dar nu este clar încă, dacă nivelurile de MMP-2 circulante,

pot prezice riscul de cancer mamar. (Aroner S.A. și colab., 2015). Alți cercetători au

concluzionat că MMP-2 și MMP-9 sunt supraexprimate în cancerul mamar și sunt strâns

legate de metastazarea ganglionilor limfatici și stadializarea tumorii. Astfel, aceste proteinaze

pot fi utilizate ca indicatori de referință pentru ghidarea tratamentului cancerului mamar și

estimarea prognosticului. (Li H. și colab., 2017). În studiul nostru, am constatat că tratamentul

cu Quercetină timp de 24 h a scăzut nivelul de MMP-2 , dar apoi , la 72 h nu a mai avut nici

un efect inhibitor asupra MMP-2. Resveratrolul a avut efect inhibitor asupra MMP-2 la 24 h

de tratament, ca si QCT. Nivelul proteinei MMP-2 a fost examinat în celulele martor,

netratate și celulele tratate cu Quercetină. După tratamentul cu Quercetină de 36 de ore,

24

celulele tratate cu Quercetină (40 µmol) au exprimat un nivel mult mai scăzut al proteinelor

MMP-2 decât celulele martor (0 µmol). Pe baza acestor rezultate, Quercetina a inhibat

nivelurile de proteine p-Akt1, MMP-2 și MMP-9 în linia celulară HCCLM3. (Jun L. și colab.,

2018).

Tang F. și colaboratorii în studiile lor, nu au observat efecte inhibitorii ale

Resveratrolului asupra exprimării MMP-2, migrației și invaziei celulelor canceroase mamare

(Tang F. și colab., 2008).

TIMP-1 este un biomarker care indică un prognostic nesatisfăcător la pacientele cu

cancer mamar triplu negative și țintirea TIMP-1 poate oferi o intervenție terapeutică atractivă

în special pentru aceste paciente. (Cheng G. și colab, 2016).

In ceea ce privește SRO, în urma rezultatelor obținute prin tratarea celulelor cultivate în

mediul specific cu citostatice dedicate tratamentului în cancerul de sân, se observă, așa cum

anticipasem, o creștere a peroxidarii lipidice induse de epirubicină funcție de timp, obținându-

se o relație doză-efect. Endoxanul nu induce oxidare specifică, dar combinația celor doi

compuși crește citotoxicitatea față de celulele normale netratate. Prezența Quercetinei, a

Resveratrolului și a Curcuminei, determină scăderea oxidării lipidelor tot într-un mod

dependent de timp. Cel mai important răspuns este legat de momentul administrării

antioxidanților. Introducerea în mediul de cultură al antioxidanților înaintea citostaticelor,

determină scăderea producerii de metaboliți activi ai oxigenului, ceea ce din punct de vedere

terapeutic, nu reprezintă un beneficiu real citostatic.

Administrarea antioxidanților în cultură după citostatice, nu influențează semnificativ

distrugerea lipidelor prin peroxidare, dar cu siguranță aceste rezultate sunt de real folos în

modelul in vivo și eventual la pacienți, antioxidanții administrați după chimioterapie, pot

diminua efectele secundare asociate.

Rezultatele obținute în același model experimental și care vizează degradarea

oxidativă a proteinelor sunt asemănătoare ca în cazul lipidelor. În dinamica tratamentului

citostatic are loc o degradare oxidativă a proteinelor crescând nivelul tiolilor serici funcție de

timp, adică creșterea concentrației determină efectele scontate citotoxice. Se înregistrează

aceeași relație doză-efect, dată de combinația Epirubicină-Endoxan. Quercetina, Resveratrolul

și Curcumina, au efecte antioxidante doar în concentrație mare, administrate înaintea

citostaticelor.

Măsurarea nivelului antioxidanților totali prin tehnicile mai sus menționate

demonstrează abilitatea Quercetinei, Resveratrolului și Curcuminei să diminueze nivelele

crescute în urma tratamentului cu citostatice. .De altfel această diminuare are loc, așa cum

25

reiese din datele obținute doar când sunt administrate înaintea compușilor chimici cu acțiune

citotoxică.

IV. MODEL EXPERIMENTAL IN VITRO UTILIZÂND LINIA MCF- 7

1. Tratarea liniei celulare MCF-7 cu agenți chimioterapeurici și biocompuși

Linia celulară MCF-7 este izolată din lichidul pleural al unei paciente de 69 de ani, de

rasă caucaziană, cu carcinom invaziv ductal mamar. Această linie este aderentă și prezintă o

morfologie de tip epitelial. Linia celulară utilizată a fost obținută de la banca internațională de

celule “European Collection of Authenticated Cell Cultures” – ECACC, provenind de la

“American Typed Culture Collection”- ATCC.

2. Testarea citotoxicității agenților chimioterapeutici și biocompușilor prin metode

colorimetrice (MTS)

Figura 7. Citotoxicitatea agenților chimioterapeutici

Ca și în cazul liniei LLC-WRC 256, tratamentele prelungite, de 72 de ore, cu

citostatice și Avastin au determinat scăderea viabilitătii celulare, odată cu creșterea

procentelor de liză celulară. Astfel, tratamentele cu epirubicină (EPI) au indus o scădere a

numărului de celule viabile de la 96,15% pentru concentrația de 1 uM până la 66,53% pentru

tratamentele cu 100 uM. Eficiența endoxanului s-a dovedit a fi mai redusă la concentrații

mici, doar concentrația de 100 uM putând induce o liză celulară sub 5%. Avastinul a

26

demostrat o acțiune citotoxicică mai redusă, 25 ug/ml determinând o viabiliate de 91,04%, iar

tratamentul cu 100uM determinând scăderea viabilitătii până la 66,53%% dintre celule.

3. Testarea citotoxicității agenților chimioterapeutici și biocompușilor prin analiza

celulară în timp real ( RTCA)

Ca și în cazul LLC-WRC-256, Curbele de proliferare vs. citotoxicitate obținute în

urma tratarii celulelor cu aceleași concentrații de citostatice sau compuși bioactivi au permis

selecționarea concentrațiilor, timpilor de tratament. Rezultatele obținute au fost confirmate de

cele efectuate folosind testul MTS.

4. Modularea expresiei biomarkerilor solubili de către tratamentele cu citostatice și/ sau

compuși biologic activi

Date din literatură au arătat că nivelurile crescute de catepsină D se corelează cu un

prognostic slab. În experimentul nostru, am constatat că cea mai mare concentrație de

catepsină D au avut-o celulele netratate, la 72 h. În ceea ce privește tratamentele aplicate am

constatat că atunci când sunt administrate în combinație citostaticele, au avut ca efect, o

scădere a concentrației catepsinei D, decât atunci când au fost administrate în monoterapie.

Catepsina D s-a dovedit a fi un marker al prognosticului negativ atunci când se găsește

în niveluri ridicate în tumorile mamare primare. S-a sugerat că acest lucru se datorează

faptului că producerea de catepsină D crește potențialul invaziv al celulelor tumorale,

crescând astfel probabilitatea metastazelor. În urma deteterminărilor de Catepsină D, pe linia

celulară MCF-7, se constată o creștere foarte mare a concentrației de catepsină D, la celulele

netratate, la 72h de la cultivare. Aceste date întăresc de asemenea opinia că prognosticul

nefavorabil în cancerul de sân clinic, legat de nivelurile ridicate ale catepsinei D, se datorează

probabil nivelurilor ridicate de catepsină D în componentele stromale ale tumorii, cum ar fi

infiltrarea celulelor inflamatorii.

Acidul sialic este un reactant de fază acută, este implicat în mascarea structurii

antigenice. Este prezent atât în tumoră, cât și în circulația purtătorului de tumoră, înainte ca

masa tumorală să poată fi detectată. Acidul sialic poate fi considerat un marker al invazivității

și metastazării. Se constată un nivel ridicat al acidului sialic, la celule netratate de 72 h, fapt

care este în acord cu datele din literatură.

Rezultatele obținute asupra SRO sunt asemănătoare experimentelor efectuate in

modelul murin, valorile sunt ușor modificate datorită specificității celulare. Peroxidarea

lipidică crește în dinamica creșterii celulare. Administrarea antioxidanților duce la scăderea

27

intensității degradării oxidative a lipidelor. Momentul introducerii în cultură a compușilor

flavonoidici influențează diminuarea stresului oxidativ.

Nu sunt încă elucidate pe deplin mecanismele prin care Quercetina își exercită

activitățile anti-proliferative. Posibilele explicații sunt legate de proprietățile sale antioxidante

și capacitații sale de a inhiba diferite substraturi enzimatice, de a neutraliza agenții anti-

cancerigeni și de a interfera cu căile de semnalizare atât la nivelul transducției semnalului cât

și la nivelul receptorilor celulari. Studii anterioare au demonstrat că acest flavonoid în

concentrații mici este antioxidant, dar poate deveni pro-oxidant atunci când este administrat

în exces. Aceasta constatare este valabilă pentru toți compușii cu structură polifenolică și este

deosebit de important a se avea în vedere momentul în care reacțiile de oxido-reducere în

echilibru, se schimbă.

28

CONCLUZII

1. În scopul realizării unor teste de evaluare a expresiei unor biomarkeri cu rol in diagnosticul,

prognosticul si monitorizarea tratamentului la paciente cu cancer mamar cu risc crescut de

recidivă și/sau metastazare, s-a implementat un studiu pe un lot de 70 de paciente cu cancer

mamar, de la care s-au prelevat fragmente de ţesut tumoral si sânge, în vederea determinărilor

enzimatice şi de stres oxidativ.

2. Pentru realizarea modelului experimental in vivo s-au folosit 60 șobolani Wistar albino,

normali, sănătoşi, cu o greutate medie de 200 g, în vârstă de 8 săptămâni proveniți din

Biobaza Institutului Oncologic ”Prof. Dr. Alex. Trestioreanu” București (I.O.B).

3. S-au implementat doua modelele experimentale in vitro: linia celulară murină de carcinom

LLC-Walker 256 si linia celulara umană de adenocarcinom mamar MCF-7 (ECACC).

4. Pe modelele in vitro implementate s-a efectuat modularea eliberării unor biomarkeri ai

proliferării celulare, angiogenezei și stresului oxidativ de către tratamente singulare de

citostatice și biocompuși, precum și combinații ale acestora.

5. În scopul evaluării capacității citotoxice a unor agenţi chimioterapeutici şi a unor

biocompuși, în liniile celulare standardizate luate în studiu (LLC-WRC 256 și MCF-7) s-a

realizat analiza celulara în timp real (RTCA) cu ajutorul tehnologiei xCELLigence,

detectându-se momentul și concentrațiile optime de aplicare a tratamentului.

6. Din punct de vedere histopatologic, toate pacientele incluse în studiu au fost diagnosticate

cu carcinom invaziv ductal (carcinom glanduliform și trabecular), cu invazia țesutului gras

peritumoral. În ceea ce privește gradul de diferențiere, 6 paciente au avut tumori cu gradul

G1, 54 paciente cu gradul G2 și 10 paciente cu gradul G3. Nici o pacientă luată în studiu nu

prezenta semne clinice sau radiografice de metastaze la distanță.

7. Creșterea nivelurilor catepsinei D s-a corelat cu creșterea gradului de diferențiere tumorală,

media valorilor catepsinei D în serurile pacientelor fiind de 28,31 nM. Astfel, media

nivelurilor de catepsină D în serurile testate a fost de 25 nM în grupul pacientelor G1, 28,13

nM pentru G2 și 31 nM pentru G3, comparativ cu media valorilor din serurile donatoarelor

sănatoase, de 6,65 nM. Concentrația a variat ușor și funcție de vârsta pacientelor, în grupul de

peste 50 de ani fiind de 51,32 nM, față de 46,42 nM în grupul pacientelor până în 50 de ani.

8. Testarea catepsinei D în serurile pacientelor cu cancer mamar s-a realizat în dinamică,

înainte de intervenția chirurgicală și la 6 luni după intervenție. In ambele grupuri de vârstă s-a

constatat reducerea nivelurilor de catepsină D dupa intervenție, de la 46,42 nM la 28,9 nM

29

pentru pacientele până in 50 de ani, și de la 51,32 nM la 27,14 nM pentru pacientele peste 50

de ani.

9. Evaluarea acidului sialic (AS), marker al glicozilării aberante în cancerul mamar, a

evidențiat o creștere a concentrației în serurile pacientelor incluse în studiu, față de lotul

sănătos. Creșterea nivelurilor AS s-a corelat cu cresterea gradului de diferențiere tumorală.

Astfel, media nivelurilor de AS în serurile pacientelor incluse în studiu a fost de 2,72 mM,

distribuite astfel: o medie de 2,49 mM în grupul pacientelor aflate în faza G1, 2,71 mM pentru

G2 și 2,82 mM pentru G3, comparativ cu media valorilor AS din serurile donatoarelor

sănătoase, de 1,92 mM.

10. Nivelurilor PX au crescut ușor, odată cu creșterea gradului de diferențiere tumorală.

Astfel, media nivelurilor de PX în serurile testate a fost de 5,75 M/100 mL în grupul

pacientelor G1, 5,95 M/100 mL pentru G2 și 6,05 M/100 mL pentru G3, comparativ cu

media valorilor din serurile donatoarelor sănătoase, de 2,11 M/100 mL. Per ansamblu, media

PX în întreg lotul de paciente cu cancer mamar a fost de 5,96 M/100 mL. Valorile crescute

se asociază cu dimensiunea tumorală, dar și cu gradul de diferențiere, sugerând că tumora este

un factor de stres oxidativ.

11. Aceste rezultate sugerează instalarea unui stres oxidativ asociat prezenței tumorale și

incapacitatea sistemelor antioxidante endogene să neutralizeze și să capteze moleculele active

și reactive de oxigen produse de tumoră. Produșii de peroxidare lipidică ar putea fi

responsabili de blocarea ciclului celular și/ sau a mecanismelor apoptotice ducând la scăderea

eficacității terapeutice și instalarea rezistenței la tratament.

12. Nivelurile AO sunt crescute în serurile pacientelor cu cancer mamar comparativ cu lotul

martor. Testele efectuate au evidențiat o valoare medie a AO de 1368,2 mM, crescută

comparativ cu media valorilor din serurile donatoarelor sănătoase, de 1260 mM. Aceasta

creștere se înregistrează în grupurile pacientelor cu gradul 1 sau 2 de diferențiere. Astfel,

media nivelurilor AO în serurile testate a fost de 1546,6 mM pentru G1 și 1426,48 mM pentru

G2. Media valorilor de AO determinate în serurile pacientelor în G3 a fost de 1001 mM.

13. În foarte multe afecțiuni umane, stresul oxidativ este doar o consecință, nu o cauză a

procesului patologic al bolii. În celula neoplazică, instalarea dezechilibrului dintre producția

de specii reactive de oxigen și eliminarea radicalilor liberi conduce la o stare de stres oxidativ

și la distrugerea unor componente esențiale ale celulei Mai multe studii atestă faptul că

stresul oxidativ rezultat din acest dezechilibru, are un rol cauzator dar este și o consecință a

30

carcinogenezei, interferând cu toate fazele acestui proces, cum ar fi inițierea, promovarea,

progresia, invazia și metastazarea.

14. Odată cu creșterea tumorii are loc o creștere a concentrației catepsinei D comparativ cu

lotul martor de șobolani neinoculați. Astfel, la o săptamână de la inoculare nivelurile

catepsinei D, ating valoarea medie de 13,37nM, comparativ cu 11,26 nM la lotul martor.

După încă o săptamână, concentrația Catepsinei D aproape se dubleza 25,62 nM, urmând ca

apoi creșterea să nu mai fie atât de accentuată, astfel încat la 5 săptamâni să atingă valoarea de

28,32 nM.

15. Același profil de creștere în corelație cu volumul tumorii îl are și acidul sialic. S-a

constatat că nivelul acidului sialic seric, crește odată cu evoluția tumorii, atingând valori

aproape duble, la 35 zile de la inoculare (3,21 mM), față de momentul inoculării (1,81mM).

La 2 săptamâni de la inoculare nivelurile de acid sialic sunt de 2,62 mM, iar după alte 2

săptamâni nivelul acidului sialic atingă valoarea de 3,15 nM, ceea ce sugerează că sunt

prezente metastaze.

16. Tumorile induc un stres oxidativ crescut, alterează procesele de metabolizare aerobă

consecutiv angiogenezei. Tumora este un factor de stres oxidativ și se supune unei relații

duale de tip cauză-efect. Nu putem afirma dacă stresul oxidativ creat este o cauză sau o

consecință a prezenței tumorii maligne.

17. Odată formate, speciile reactive de oxigen sunt rapid descompuse de către sistemele

antioxidante. Ca și în cazul PX și SH, creșterea AO cea mai accentuată are loc în prima

săptamână de la inoculare, de la 0,66 mM la 0,99 mM. Sistemele naturale de captare au fost

activate ca urmare a instalarii unui stres oxidativ. Ele nu sunt la intensitatea necesară

neutralizarii tuturor reactivilor nou creați. Drept urmare, balanța este în continuare înclinată în

favoarea părții oxidante, în defavoarea antioxidanților.

18. Curbele de creștere în timp real (RTCA) au demonstrat modularea proliferării celulare de

către concentrații scalare de agenți chimioterapeutici sau biocompuși. Experimentele RTCA s-

au realizat pentru celule tratate cu concentrații cuprinse între 1 uM-100 uM epirubucină (EPI),

10-1000 uM endoxan (EDX) sau 12,5-200uM biocompuși (quercetina/OCT, resveratrol/RSV

sau curcumina/CRM). Datele obținute au permis stabilirea concentrațiilor și timpilor de lucru.

19. Tratamentele de 72 de ore cu citostatice și Avastin au determinat creșterea procentelor de

liza celulară, și implicit scăderea viabilității celulare. Astfel, tratamentele cu epirubucină

(EPI) au indus o scădere a numărului de celule viabile de la 98,46% pentru concentrația de 1

uM până la 66,22% pentru tratamentele cu 100 uM. Eficiența endoxanului s-a dovedit a fi mai

redusă la concentrații mici, doar concentrația de 100 uM putând induce o liză celulară sub

31

15%. Avastinul a demostrat o acțiune citotoxică mai redusă, 25 ug/mL determinând o

viabiliate de 98%, iar 100 uM inducând moartea a 25,17% dintre celule.

20. Tratamentul combinat cu EPI si EDX determină o activare mai puternică a catepsinei D,

comparativ cu efectul tratamentului singular cu 10 uM EPI, în ambele modele in vitro

implementate. Adaugarea unui biocompus, cum este RSV, a determinat o creștere a nivelului

de catepsină D eliberată în supernatantele de cultură.

21. Măsurarea nivelului antioxidanților totali prin tehnicile mai sus menționate demonstrează

abilitatea Quercetinei, Resveratrolului și Curcuminei de a diminua nivelurile crescute ale SRO

în urma tratamentului cu citostatice. De altfel această diminuare are loc, așa cum reiese din

datele obținute doar când sunt administrate înaintea compușilor chimici cu acțiune citotoxică.

22. Medicina translațională, personalizată, completată de noile descoperiri din domeniul

medicinei de precizie, reprezintă o punte de legatură între cercetarea fundamentală și cea

clinică, permițând pe de o parte ca descoperirile cercetătorilor din laborator să fie transferate

în clinică și folosite în diferite trialuri clinice, iar pe de altă parte, datele clinice obținute în

diferite studii clinice să poată fi folosite pentru abordări complexe ale unor teme de cercetare,

unor studii in vitro în laboratoarele de cercetare.

32

BIBLIOGRAFIE

1. Albini, A. (1990) Standardization of protein free SH groups in blood plasma. Boll Soc.

Ital. Sperim., 18, 1829- 98.

2. Aroner, S.A., Rosmer, B.A., Tamini, R.M., Tworoger, S.S., Baur, N., Jaos, T.O.,

Hankinson, S.E. (2015) Plasma matrix metalloproteinases levels and breast cancer risk.

Cancer Epidemiol,39(3), 321- 327

3. Benzie, I.F., Strain, J.J. (1996) The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a

measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Anal Biochem, 15, 239(1), 706.

4. Bray, F., Ferlay,J., Soerjomataram, J., Siegel, R.L., Torre, L.A., Jemal, A. (2018).

Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality

worldwide for 36 cancers in 185 contries. CA Cancer J.Clin., 68 (6), 384 – 424

5. Brown, N.S, Bicknell, R. (2001). Hypoxia and oxidative stress in breast cancer:

Oxidative stress: its effects on the growth, metastatic potential and response to therapy

of breast cancer. Breast Cancer Res, 3(5), 323 – 327.

6. Capony, F., Morisset, M., Barrett, A.J., Capony, J.P., Vignon, F.,Chambon, M., Louisot,

P., Rochefort, H. (1987) Phosphorylation, glycosylation and proteolytic activity of the

52-kD estrogen induced protein secreted by MCF-7 cells. J.Cell. Biol., 104, 253-262

7. Cheng, G., Zielonka, J., Ouari, O., Lopez, M., McAllister, D., Boyle, K., Barios, C.S.,

Weber, J.J., Johnson, B.D., Hardy, M, Dwinwell, M.B., Kalyamaram, B. (2016)

Mitochondria- Enhanced Antiproliferative and Radiosensitizing Effects in Pancreatic

Cancer cell. Cancer Res, 76(13), 3904-15

8. Feitelson, M.A, Arzumanyan, A., Kulathinal, R.J., Blain, S.W., Holcombe,

R.F., Mahajna, J., Marino, M., Martinez-Chantar, M.L., Nawroth, R., Sanchez-Garcia,

I., Sharma, D., Saxena, N.K., Singh, N., Vlachostergios, P.J., Guo, S., Honoki, K., Fujii,

H., Georgakilas, A.G., Bilsland, A., Amedei, A., Niccolai, E., Amin, A., Ashraf,

S.S., Boosani, C.S., Guha, G.

,Ciriolo, M.R., Aquilano, K., Chen, S., Mohammed,

S.I., Azmi, A.S., Bhakta, D., Halicka, D., Keith, W.N., Nowsheen, S. (2015) Sustained

proliferation in cancer: Mechanisms and novel therapeutic targets. Semin Cancer Biol,

35 Suppl:S25-S54. doi: 10.1016 Gan, S.D., Patel, K.R. (2013). Enzyme Immunoassay

and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, 133 (9), 1–3

33

9. Garcia, M., Plated, N., Liandet, E., Laurent, V., Derocq, D., Brouillet, J.P., Rochefort,

H. (1996) Biological and clinical significance of cathepsin D in breast cancer

metastasis. Stem Cells, 14(6), 642-50

10. Georgescu, D., Comisel, V., Enachescu, F. (2000) Oncobiologie. Ars Docendi,

Bucuresti

11. Gibellini, L., Pinti, M., Nasi, M., Montagna, J.P., De Biasi, S., Roat, E., Bertoncelli, L.,

Cooper, E.L., Cossarizza, A. (2011) Quercetin and cancer chemoprevention. Evid Based

Complement Alternat Med, doi:10.1093

12. Jaiswell, A.K. (1994) Antioxidant response element. Biochem. Pharmacol, 48,439-444

13. Janero, D.R. (1990) Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic

indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury. Free Radic Biol Med; 9,

515-540

14. Kattermann, V.R., Kriegel, R. (1981) Mikromethode zur Besimmung von N-Acetyl-

Neuraminsaure in Glycoproteinen. J.Clin. Chem.Clin. Biochem. 19 , 31-34

15. Li, H., Qui, Z., Feng, L., Wang, C. (2017) The relationship between MMP-2 and MMP-

9 expression levels with breast cancer incidence and prognostic.Oncol Lett, 14(5), 5865-

5870

16. Maio, M., Altomonte M., Calabro L., Fonsatti E. (2001) Bioimmunotherapeutic targets

on angiogenetic blood vessels in solid malignancies. Front Biosci., 6:776-784

17. Rajagopalan, S., Meng, X.P., Ramasamy, S., Harrison, D.G., Galis, Z.S. (1996)

Reactive oxygen species produced by macrophage-derived from cells regulate the

activity of vascular matrix metalloproteinases in vitro. J. Clin. Invest., 98:2572-2579

18. Tang, H., Yuen, K.L., Tang, H.M., Fung, M.C. (2009) Reversibility of apoptosis in

cancer. Br.J. Cancer, 100(1), 118- 122

19. Yadav L., Puri N., Rastogi V., Satpute P., Sharma V. (2015) Tumour Angiogenesis and

Angiogenic Inhibitors: A Review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. (6):01-

05.

20. Zhang, Z., Wuhrer, M., Holst, S. (2018) Serum sialylation changes in cancer. Glycoconj

J., 35(2), 139-160