antibiograma refacut
TRANSCRIPT
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
1/30
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
2/30
2
Introducere
Metode de testare a sensibilitii la antibiotice Metoda diluiilor Metoda difuzimetric Factori ce afecteaz diametrul zonelor de inhibiie
Controlul de calitate
Principalele scopuri ale antibiogramei: Orientarea tratamentului
Cunoaterea sensibilitii unui microorganism la anumite chimioterapice Determinarea concentraiei unui chimioterapic n esuturile sau fluidele organismului
Instrument epidemiologic
Supravegherea apariiei de tulpini rezistente a principalilor ageni patogeni (ex. Shigella, Salmonellatyphi) Supravegherea continu a patternului de rezisten a tulpinilor patogene (ex. Staphylococcus, bacili
Gram negativi) Ageni antimicrobieni frecvent folosii n tratarea infeciilor sistemice
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
3/30
3
Metoda difuzimetric Se dispun discuri ce conin o cantitate cunoscut de antibiotic pe un
mediu solid nsmnat cu tulpina bacterian de testat Metoda diluiilor
Variaz cantitatea de substane antimicrobiene incorporate n mediisolide sau lichide
Ulterior se inoculeaz tulpina bacterian de testat
Se folosesc discuri de hrtie impregnate cu antibiotice Se testeaz sensibilitatea la mai multe antibiotice prin msurarea
diametrului zonelor de inhibiie S-a demonstrat c rezultatele metodei difuzimetrice cu discuri se
coreleazbine cu rezultatele metodei diluiilor
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
4/30
4
Materiale necesare: Inoculul bacterian reprezint tulpina bacterian de testat, izolat din
produsele patologice i identificat. Inoculul este o cultur n mediu lichid de 18 ore obinut din 5-10 colonii
izolate, standardizat nefelometric. Concentraia bacterian a inoculului este de 105UFC/ml (Unitati Formatoare de
Colonii), cu o turbiditate de 0,5 uniti McFarland. Mediu de cultur solid pentru antibiogram (ex. geloz Mueller Hinton,
geloz simpl etc.) turnat n plci Petri, cu grosimea de 3-4 mm i cu ocompoziie adecvat, n funcie de tulpina de testat i structurachimioterapicelor.
Microcomprimate standardizate - discuri de hrtie de filtru cu diametrul de 6mm mbibate cu antibioticele de testat. Pe discuri este imprimat simbolulantibioticului i cantitatea n micrograme.
Grosime: 4 mm pH Cationi * Magnesium
* Calcium Condiii de stocare Trebuie uscate
Trebuie adus la temperatura camerei
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
5/30
Condiii de incubare
Aer ambiental, 35 0C pentru bacterii aerobe i facultativ anaerobe Perioada de incubare 16-18 h 24 h pentru S.aureusi enterococi 5% CO2pentru Haemophilus
Teancurile de plci nu vor conine mai mult de 5 plci
Trebuie stocate i manipulate corect Trebuie refrigerate, se scot de la frigider cu 1 h nainte de utilizare
Se verific data de expirare Se aduc la temperatura camerei evitnd condensul Se plaseaza n 15 minute de la nsmnarea mediului
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
6/30
6
Procedur(Kirby-Bauer modificat: National Committee for Clinical LaboratoryStandards. NCCLS/CLSI) Se prepar un inocul de105UFC/ml n ser fiziologic sau bulion soia-tripticaza
(TSB)sau bulion Mueller-Hinton (5ml) Se prelev de pe plac 5-10 colonii izolate Se ajusteaz turbiditatea pentru a fi aceeai cu standardul McFarland No. 0.5.
Se prelev din inocul cu tamponul i se descarc pe suprafaa gelozei Mueller-Hinton
Se las 5-10 minute geloza pentru uscare Prepararea inoculului
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
7/30
Limita zonei de inhibiie
7
Procedur(continuare) Se plaseaza discurile cu antibiotice pe suprafaa gelozei
insamantate cu inocul Plcile se incubeaz la 37oC, timp de 18-24 h Se msoar diametrul zonelor de inhibiie a creterii
bacteriene n mm
Cretere bacterian
Metoda difuzimetrica
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
8/30
Insamantareainoculului
Aplicarea discurilorcu antibiotice
Dup o incubare de 18-24 ore la37 0C, se msoar diametrelezonelor de inhibiie
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
9/30
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
10/30
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
11/30
Plasare incorect a discurilor Plasare corect a discurilor
Geloz prea subire
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
12/30 12
Metoda difuzimetric
Msurarea diametrelor zonelor de inhibiie
Se msoar de la marginea unde ncepe creterea, cu 3 excepii: n cazul sulfamidelor i cotrimoxazolului se ignora uoara cretere la
marginea zonei Unele tulpini de Proteusspp. Pot invada n zona de inhibitie Dac se testeaz Streptococcus productor de beta-lactamaze i
apare zone de inhibiie suprapuse se raporteaz ca rezistent
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
13/30
Metoda difuzimetric
Msurarea diametrelor zonelor de inhibiie
Se msoar de la marginea unde ncepe creterea, cu 3 excepii:
n cazul sulfamidelor i cotrimoxazolului se ignora uoara cretere la marginea zoneiUnele tulpini de Proteusspp. Pot invada n zona de inhibitie
Dac se testeaz Streptococcus productor de beta-lactamaze i apare zone de inhibiiesuprapuse se raporteaz ca rezistent
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
14/30
Teste de sinergie
Se plaseaza alaturat discuri
continand antibiotice cu efectsinergic Zonele de inhibitie se contopesc
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
15/30
Test pentru producereade beta-lactamaze
Se plaseaza alaturat discuri continandantibiotic simplu si antibiotic cuinhibitor de beta-lactamaze
In cazul producerii de beta-lactamaze,diametrul zonei de inhibitie din juruldiscului cu inhibitor este mult mai mareaspect de dop de sampanie
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
16/30
Test pentru producereade beta-lactamaze
Ampicillin (A); Chlorampenicol (C);Streptomycin (S); Sulphonamides (Su);Tetracycline (T); Trimethoprim (Tm); Nalidixicacid (Na); Kanamycin (K); Ciprofloxacin (Cp);
Ceftazidime (Cz); Gentamycin (Gm) andCefotaxime (Ctx).
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
17/30
17
Metoda difuzimetric Interpretarea rezultatelor
Prin compararea diametrelor obinute cu cele din tabele standardizate pentru tulpinilede referin
Rezultatul se raporteaz ca: Sensibil Intermediar sensibil
Antibiotice cu toxicitate mic: Moderat sensibil Antibiotice cu toxicitate mare: zon tampon ntre sensibil i rezistent
Rezistent
Test pentru producerea debeta-lactamaze
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
18/30
18
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
19/30
19
Densitatea inoculului
Timpul de aplicare a discurilor
Temperatura de incubare
Timpul de incubare Dimensiunea placii Grosimea gelozei (4 mm) Spaierea discurilor (2.5 cm)
Zonele sunt mai mari cnd inoculul este slab iinvers
Daca dup aplicarea discurilor placa este inut multla temperatura camerei se formeaza zone mai mici Zone mai mari la temperaturi > 35 oC Ideal 16-18 ore; incubarea mai scurta nu da rezultate
interpretabile Plcile mai mici permit un numr mai mic de discuri Mediul subire duce la apariia de zone mari iinvers Evit suprapunerea zonelor
Factori ce afecteaz diametrul zonelor de inhibiie
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
20/30
20
Se efectueaz diluii de antibiotice n mediu
lichid sau solid Permite obinerea de rezultate cantitative :
Indic concentraia minim inhibitorie precum iconcentraia minim bactericid a chimioterapicului
testatConcentraia Minim Inhibitorie (CMI) (Minimal
Inhibitory Concentration = MIC) Reprezint cea mai mic concentraie de antibiotic care
inhib multiplicarea bacterian
Concentraia Minim Bactericid (CMB)(Minimal Bactericidal Concentration = MBC) Reprezint cea mai mic concentraie de antibiotic care permite
supravieuirea a mai puin de 0,1 % din bacteriile din inocul
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
21/30
21
Procedur Se efectueaz diluii binare de antibiotic n bulion Mueller-Hinton,
Tryptic Soy Broth, Clark, ser fiziologic Sensmneazinoculul bacterian i se incubeaz
Se folosesc martori frinocul i frantibiotic Se observ turbiditatea i se determin concentraia minim
inhibitorie - CMI (ultima eprubetn care cultura bacteriannu a maicrescut imediul a rmaslimpede)
Se subcultiv eprubetele limpezi pe medii de cultur solide i seincubeaz
Se apreciaz concentraia minim bactericid - CMB n funcie deprezena sau absena creterii culturii bacteriene pe mediile solide.CMB este concentraia de antibiotic din ultima eprubet din careprin subcultivare nu s-a obinutcreterebacterian.
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
22/30
22
Ziua 1
Se adaug 1 ml inocul cubacteria de testat (1*106CFU/ml) n tuburi ncare s-au efectuat nprealabil diluii deantibiotic n mediu lichid
Martori:
C1 = Martor fr antibiotic
Viabilitatea trebuie testatprin subcultivare pe mediulichidC2 = Martor fr inocul
Concentraia inocului = 5*105CFU/ml
Se incubeaz 35 oC, 18-24 ore
128 64 32 16 8 4 2 C1 C2
64 32 16 8 4 2 1 C1 C2
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
23/30
23
Ziua 2
Se observ turbiditateavizual - MIC = 16 mg/l
Se subcultiv eprubetelelimpezi pe plci de gelozcu ansa de 0,01 ml
64 32 16 8 4 2 1 C1 C2
0.01 ml se nsmneaz, se incubeaz la 35oC, 18-24 ore
64 32 16
Ziua 3Se determin numrul de CFU peplci:La 16 mg/l = 700 CFU/ml > 0.1%of 5*105CFU/ml (inocul)
In acest caz : MBC = 32 mg/l
Metoda diluiilor n bulion
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
24/30
Concentratia bacteriostatic (CMI)
Concentratia bactericid (CMB)
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
25/30
25
Modul de calcul al concentraiei minime bactericide
100% din concentraia inoculului = 5*105CFU/ml
0.1% = [(5*105)*0.1]/100 CFU/ml = 500 CFU/ml
Prin urmare n eprubeta cu concentraie bactericid de antibiotictrebuie s existe o concentraie bacterian mai mica 500 CFU /ml(5 colonii pe o plac nsmnat cu 0,01 ml mediu lichid, 500*0.01
= 5 CFU). Dezavantaje:
Permite testarea unui singur antibiotic Este laborioas i de durat
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
26/30
26
Plcile pentru microdiluii conin 96 godeuri deplastic
Se poate efectua si pe stripuri ce contin 10-12antibiotice
Se efectueaza simultan teste pentru mai multeprobe
Diluiile se prepar manual sau comercial
Antibioticele sunt liofilizate Performana este bun dar costul este ridicat
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
27/30
27
Vizualizarea turbiditii Cititor manual cu surs de lumin sau oglind Cititoare automate
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
28/30
96 well microtiter plate
ug/ml64 32 16 8 4 2
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
29/30
29
Procedur Se efectueaza diluii de antibiotic n medii
gelozate topite care se toarn n plci
64 ug/ml 32 ug/ml 16 ug/ml
-
5/25/2018 Antibiograma refacut
30/30
30
Procedur nsmnarea inoculului bacterian (McFarland
No. 0.5)
Se folosete un dispenser Steers-Foltz care repartizeaz1 microlitru de inocul
Incubare Numrarea coloniilor
CMI32 ug/ml