anexa vi standarde pentru laboratoarele tb … · introducerea de metode noi în practica de...

of 21/21
ANEXA VI STANDARDE PENTRU LABORATOARELE TB CONDIȚII MINIME PENTRU ASIGURAREA SIGURANȚEI ȘI EFICIENȚEI ACTIVITĂȚILOR DIN LABORATOR 2017 Autori: Daniela HOMORODEAN, medic primar microbiologie, doctor în științe medicale, coordonator al rețelei naționale a laboratoarelor de micobacteriologie, șef Laboratorul Național de Referință Cluj Napoca, Spitalul Clinic de Pneumoftiziologie Leon Daniello Cluj Napoca. Adriana MOISOIU, medic primar medicină de laborator, doctor în științe medicale, șef Laboratorul Național de Referință București, Institutul Național de Pneumoftiziologie Marius Nasta București.

Post on 22-Jul-2019

213 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • ANEXA VI

    STANDARDE PENTRU LABORATOARELE TB

    CONDIII MINIME PENTRU ASIGURAREA SIGURANEI I EFICIENEI

    ACTIVITILOR DIN LABORATOR

    2017

    Autori:

    Daniela HOMORODEAN, medic primar microbiologie, doctor n tiine medicale, coordonator

    al reelei naionale a laboratoarelor de micobacteriologie, ef Laboratorul Naional de Referin

    Cluj Napoca, Spitalul Clinic de Pneumoftiziologie Leon Daniello Cluj Napoca.

    Adriana MOISOIU, medic primar medicin de laborator, doctor n tiine medicale, ef

    Laboratorul Naional de Referin Bucureti, Institutul Naional de Pneumoftiziologie Marius

    Nasta Bucureti.

  • 2

    Abrevieri

    ABG: Antibiograma

    BAAR: Bacilli acido-alcoolo rezisteni

    C-LJ: Cultura n mediul Lowenstein Jensen

    CEC: Control Extern al Calitii

    CIC: Control Intern al Calitii

    CPM: Cabinet de Protecie Microbiologic

    INH: Izoniazid

    LJ: Mediul Lowenstein Jensen

    LNR: Laborator Naional de Referin

    LPA: Line Probe Assay

    LRR: Laborator Regional de Referin

    M: Examen microscopic

    MGIT: Mycobacterium Growth Indicator Tubes

    MDR: Multidrug rezisten

    MTB: Mycobacterium tuberculosis

    NTM: Micobacterii netuberculoase

    PZM: Pirazinamid

    PNPSCT: Programul Naional de Prevenire, Supraveghere i Control a Tuberculozei

    RMP: Rifampicin

    SIRE: Streptomicin, Izoniazid, Rifampicin, Etambutol

    TB: Tuberculoz

    ZN: Ziehl Neelsen

  • 3

    Introducere

    Diagnosticul tuberculozei (TB) a cunoscut n ultimii ani progrese remarcabile prin folosirea n

    practica de rutin a metodelor rapide de diagnostic fenotipic i de biologie molecular1, 2, 3

    .

    ngrijirea pacienilor cu TB ncepe cu un diagnostic de laborator cu calitate asigurat.

    Diagnosticul neadecvat, cauzat de unele laboratoare care nu au capacitatea s ofere rezultate cu

    calitate controlat, poate constitui o barier n controlul TB3,4

    .

    Tehnicile i metodele recomandate pentru folosire n reeaua naional a laboratoarelor TB

    trebuie s in seama de necesitile PNPSCT i de Strategia naional pentru controlulTB, astfel

    nct contribuia laboratorului la realizarea obiectivelor s se situeze la nivelul ateptrilor5,6

    .

    Introducerea de metode noi n practica de rutin genereaz situaii complexe, fiind necesar s se

    in seama de infrastructura laboratoarelor, de posibilitatea realizrii condiiilor de biosiguran

    corespunztoare gradului de risc, validarea echipamentelor i asigurarea ntreinerii acestora,

    asigurarea furnizrii nentrerupte a reactivilor i materialelor consumabile necesare,

    managementul fiecrui laborator n parte i a reelei de laboratoare ca un ntreg, cu realizarea

    unui sistem de asigurare a calitii la toate nivelurile. De asemenea, este necesar asigurarea

    resurselor umane adecvate pentru situaia nou creat3.

  • 4

    1. Structura i funciile reelei laboratoarelor de micobacteriologie

    Pornind de la obiectivele Strategiei naionale pentru controlul TB6, fa de 105 laboratoare

    funcionale n reeaua de laboratoare n anul 2014, pn n anul 2020 vor trebui s ofere rezultate

    cu calitate asigurat, la nivelul necesitilor PNPSCT, un numr de 40 - 45 laboratoare (fig 1).

    Figura 1. Structura actual i cea de perspectiv a reelei de laboratoare TB.

    Existena reelei laboratoarelor permite5:

    a. aplicarea tehnicilor recomandate de PNPSCT la nivelul ntregii ri, cu rezultate comparabile ntre laboratoare;

    b. asigurarea unor investigaii speciale disponibile numai n laboratoarele specializate (ex. testarea sensibilitii tulpinilor, teste de biologie molecular, identificarea speciilor de

    micobacterii);

    c. obinerea informaiilor necesare planificrii i evalurii activitii la toate nivelurile; d. obinerea informaiilor privind activitatea de diagnostic i identificarea eventualelor

    deficiene, cu aplicarea de msuri corective;

    e. aprecierea tendinelor (ex: a confirmrilor bacteriologice, care este unul din indicatorii de performan pentru programul de control al TB)

    f. asigurarea controlului intern i extern al calitii diagnosticului bacteriologic al TB.

    Categoriile de analize i activitile care trebuie s fie asigurate de laboratoarele reelei sunt5:

    Laboratoare de nivel II:

    examenul microscopic pentru evidenierea bacililor acido-alcoolo-rezisteni (BAAR) i cultura micobacteriilor n mediul solid Lowenstein Jensen, cu identificarea obligatorie a

    germenilor din complexul M. tuberculosis. Dac exist condiii realizate pentru

    asigurarea cultivrii n mediul lichid n sistem automat, aceste laboratoare pot folosi

  • 5

    suplimentar i aceast metod, la cazurile suspecte de TB-MDR sau pentru monitorizarea

    tratamentului acestora, conform algoritmului de diagnostic5.

    trimit culturile izolate de la toate cazurile noi i de la cele din cursul monitorizrii tratamentului la laboratorul de nivel III, pentru efectuarea antibiogramei (a se vedea

    algoritmul de diagnostic) (ABG).

    trimit la laboratorul de referin, pentru identificare genetic, toate tulpinile de micobacterii netuberculoase (test imunocromatografic Ag MPT64 negativ).

    pot trimite sput recoltat de la pacienii suspeci de TB-MDR la laboratorul de arondare teritorial (LRR, LNR), n vederea efecturii de teste de biologie molecular pentru

    diagnosticul rapid al TB-MDR.

    n zonele cu prevalen mare a TB-MDR sau/i a infeciei HIV, a TB la copii, dac exist dotarea (GeneXpert MTB/Rif) i condiiile locale asigurate, pot efectua testarea rapid

    pentru evidenierea TB/TB-MDR.

    Laboratoare de nivel III- Laboratoare Regionale de Referin (LRR)

    examenul microscopic pentru evidenierea bacililor BAAR i cultura micobacteriilor n mediul solid Lowenstein Jensen, cu identificarea obligatorie a bacililor din complexul

    M. tuberculosis.

    asigur cultivarea n mediul lichid n sistem automat la cazurile suspecte de TB -MDR sau pentru monitorizarea tratamentului acestora, conform algoritmului de diagnostic

    (pag16).

    efectueaz ABG MT pentru Rifampicin (RMP) i Izoniazid (INH) prin metoda concentraiilor absolute sau prin metoda proporiilor modificat - n mediul lichid

    Middlebrook 7H9, n sistemul automat de cultivare disponibil.

    efectueaz teste de biologie molecular pentru identificarea complexului MTB i a rezistenei la RMP (GeneXpert MTB/Rif) sau RMP i INH (GenoType MTBDRplus)

    coordoneaz activitatea a 3 - 7 laboratoare judeene arondate i din municipiul Bucureti;

    desfoar activitate de supervizare, asigurare a calitii rezultatelor pentru examenul microscopic pentru laboratoarele arondate.

    colaboreaz cu LNR pentru toate activitile desfurate.

    Laboratoarele Naionale de Referin (LNR), din cadrul Institutului de Pneumoftiziologie

    Marius Nasta i din cadrul Spitalului Clinic de Pneumoftiziologie Leon Danielo - Cluj-

    Napoca:

    constituie nivelul la care se realizeaz coordonarea, planificarea, organizarea, monitorizarea i evaluarea reelei, instruirea personalului cu studii superioare din

    laboratoarele reelei.

    n plus fa de LRR, testeaz sensibilitatea pentru substanele anti-TB de linia a II-a prin metode fenotipice (metoda proporiilor n mediul Lowenstein Jensen i metoda

    proporiilor modificat n mediul Middlebrook 7H9 n sistem MGIT 960) i prin teste de

    biologie molecular (GenoType MTBDRsl).

    identific prin metode de biologie molecular speciile din cadrul complexului M. tuberculosis, speciile de micobacterii netuberculoase (NTM) comune i efectueaz teste

    de epidemiologie molecular;

  • 6

    desfoar activitate de supervizare, asigurare a calitii rezultatelor, informare, educare - instruire, management al resurselor i cercetare.Toate laboratoarele, indiferent de nivelul

    lor, pot participa la activitatea de cercetare tiinific.

  • 7

    2. Tehnici i metode

    Toate laboratoarele vor respecta algoritmul de diagnostic recomandat de PNPSCT5.

    n tabelul I sunt prezentate metodele care sunt folosite n diferite niveluri de laboratoare:

    Tabel I. Metodele care sunt folosite n diferite niveluri de laboratoare

    Nivel

    ul lab

    Nr

    lab

    M C-LJ C- mediul

    lichid

    AB

    G

    Lini

    a 1

    ABG

    linia

    1+2

    GeneXpert

    MTB/Rif

    GenoType

    LPA

    Epidemio-

    logie

    molecula-

    r

    LNR 2 x x MGIT 960

    VersaTrek

    x MP x MTBDRplus

    MTBDRsl

    x

    LRR 8 x x MGIT 960 x x MTBDRplus

    II 30-

    35

    x x MGIT 960

    sau

    VersaTrek

    x

    Examenul microscopic constituie prima etap n identificarea cazurilor suspecte de TB, prin

    examinarea a 2 eantioane de sput5.

    Cazul de TB este definit dac se obine rezultat pozitiv BAAR pentru cel puin unul dintre

    eantioanele examinate. Pentru monitorizarea tratamentului se examineaz, de asemenea, cte 2

    eantioane de sput la intervalele de timp recomandate de PNPSCT pentru fiecare categorie de

    caz.

    Microscopia convenional (optic)7

    Folosete coloraia Ziehl Neelsen (ZN), cu examinare la microscopul optic, cu mrire de 1000x

    (obiectiv cu imersie) pentru evidenierea BAAR.

    Poate s fie realizat direct, prin prelucrarea sputei sau, dac exist dotarea cu centrifug

    conform, dup decontaminare/concentrare, prin colorarea frotiului efectuat din sediment.

    Microscopia fluorescent convenional

    Folosete lamp cu vapori de mercur ca surs de lumin. Fa de microscopia optic, are

    avantajul examinrii unui cmp microscopic mai larg, folosind obiective de 20x i 40-60x,

    permind scurtarea timpului necesar examinrii.

    Necesit pregtire/instruire special a personalului de laborator. De asemenea, costul este mai

    ridicat, comparativ cu microscopia optic.

    Este recomandat pentru laboratoare care efectueaz zilnic un numr mare de examinri (35-

    100)8,9

    .

    Poate s fie realizat direct, prin prelucrarea sputei sau, dac exist dotarea cu centrifug

    conform, dup decontaminare/concentrare, prin colorarea frotiului efectuat din sediment.

    Microscopia fluorescent cu microscop LED-UV10

    Spre deosebire de microscopia fluorescent convenional, acest tip de microscop folosete ca

    surs de lumin o diod emitoare de lumin (LED: Light-Emitting Diode), mai ieftin dect

  • 8

    lampa cu vapori de mercur, nu necesit timp pentru nclzirea lmpii, iar n cazul spargerii nu

    genereaz vapori toxici. Performanele sunt similare cu ale microscopului cu fluorescen

    convenional, dar are avantajul c examinarea se face n ncpere luminat.

    Cultivarea micobacteriilor

    Se realizeaz prin nsmnarea produselor prelucrate n mediul solid Lowenstein Jensen (LJ) i,

    acolo unde exist dotarea i se realizeaz condiiile de calitate i biosiguran necesare, n mediul

    lichid Middlebrook 7H9.

    Cultivarea n mediul lichid va fi folosit n mod special pentru cazurile noi, suspecte de TB-

    MDR, dar i pentru cultivarea probelor n cursul monitorizrii terapiei, pentru obinerea rapid a

    culturii n vederea testrii sensibilitii prin metod fenotipic sau genetic. Trebuie reinut c se

    obin doar rezultate calitative (pozitiv/negativ), spre deosebire de cultivarea n mediul solid LJ,

    care ofer informaii cantitative (numr de colonii) utile pentru monitorizarea evoluiei sub

    tratament. Pentru cazurile aflate la monitorizarea tratamentului, la controlul de la 4 luni este

    recomandabil ca sputa prelucrat s fie nsmnat i pe mediul lichid ca s avem mai repede

    informaia referitoare la rezistena dobndit, prin testare genetic i fenotipic a culturii

    obinute.

    Examenul microscopic i cultura n mediul LJ rmn obligatorii pentru toate laboratoarele

    reelei, indiferent de nivelul laboratorului i de alte tipuri de teste folosite.

    Pentru decontaminarea produselor potenial contaminate n momentul recoltrii, se folosesc

    exclusiv metodele recomandate de PNPSCT i numai dup ce personalul a fost instruit asupra

    tehnicii corecte. Introducerea n practica laboratorului a unei metode noi de decontaminare

    trebuie s fie precedat de instruirea personalului i de validarea metodei. Dac nu se obin

    rezultatele scontate (cel puin cu calitate similar metodei anterior folosite), ori se renunt la

    metod, ori se reia instruirea personalului. Se solicit asistena tehnic a LNR.

    Identificarea microbilor crescui n mediul solid sau lichid se va face pentru toate culturile care,

    la verificarea microscopic n coloraia ZN, evideniaz prezena de BAAR (indiferent de

    aezarea acestora n frotiu), folosind testul rapid imunocromatografic Ag MPT64, cu rezultat n

    15 minute11

    . Identificarea genetic este rezervat situaiilor n care testul imunocromatografic Ag

    MPT64 este cu rezultat negativ.

    Indiferent de mediul de cultivare folosit i de nivelul laboratorului, este obligatorie

    identificarea apartenenei bacteriilor izolate la complexul M. tuberculosis.

    Antibiograma

    ABG pentru substanele anti-TB de linia I n mediul solid LJ se va limita la INH i RMP,

    folosind metoda concentraiilor absolute. Testarea n mediul lichid Middlebrook 7H9 n sistem

    automat se va face fa de SIRE i eventual la PZM n LNR n sistem Bactec MGIT 960 i la RIE

  • 9

    n cazul sistemului VersaTREK. LNR vor testa i substanele anti-TB de linia a doua, att n

    mediul solid, ct i n mediul lichid (n sistem MGIT 960).

    Este de reinut c reproductibilitatea rezultatelor este foarte bun pentru RMP i INH, dar mai

    slab pentru SM i EMB, de aceea mono-rezistena izolat doar la acestea din urm trebuie

    interpretat cu pruden12,12a

    .

    Toate laboratoarele care efectueaz ABG trebuie s participle la scheme de control extern al

    calitii/comparare ntre laboratoare, pentru a dovedi i a putea menine calitatea rezultatelor12

    .

    Metodele de biologie molecular

    Metodele moleculare de diagnostic pot fi folosite ca test direct (din proba recoltat de la bolnav)

    exclusiv pentru cazurile noi, care nu au nceput tratamentul anti-TB sau sunt n primele 3 zile de

    tratament, deoarece se bazeaz pe detectarea ADN-ului bacterian i nu se poate face distincie

    ntre bacteriile vii (viabile) i cele moarte (neviabile)13

    .

    Pentru cazurile aflate n cursul terapiei specifice i care necesit un rezultat rapid referitor la

    profilul de rezisten se va efectua test molecular indirect folosind cultura obinut n mediul

    lichid sau solid.

    Se vor folosi metode de identificare simultan a complexului M.tuberculosis i a rezistenei la

    RMP sau i a rezistenei la RMP i INH. La nivelul LNR se va testa genetic rezistena la

    substanele anti-TB de linia a doua, i se identific speciile de micobacterii n cadrul complexului

    M.tuberculosis sau speciile comune de NTM14

    .

    Metodele de epidemiologie molecular vor fi folosite n LNR pentru stabilirea filiaiei cazurilor

    din focarele de TB.

    Indiferent de nivelul laboratoarelor, tehnicile i metodele recomandate trebuie s fie

    folosite de personal calificat, suficient numeric pentru sarcinile i responsabilitile pe care

    le are de ndeplinit, instruit i verificat pentru calitatea rezultatelor obinute.

  • 10

    3. Conditii minime pentru asigurarea siguranei i eficienei activitilor din laborator

    Biosigurana

    Deoarece Mycobacterium tuberculosis este ncadrat n grupul 3 de bacterii patogene din cauza

    riscului pe care l reprezint pentru persoanele care sunt expuse profesional sau accidental, este

    necesar ca toate activitile de laborator s se realizeze n condiii controlate, cu nivel de

    biosiguran adecvat (1, 2 sau 3), care asigur protecia personalului i a mediului.

    Spaiul laboratorului trebuie s fie astfel dimensionat i structurat nct s asigure realizarea de

    analize de calitate, activitatea s se desfoare n mod fluent i s previn riscul contaminrii

    ncruciate a probelor, contaminarea mediului sau a personalului. Trebuie s se asigure circuite

    funcionale pentru clieni/solicitani, probe, personal i deeurile provenite din prelucrarea

    probelor15

    . Compartimentul pentru diagnosticul TB trebuie s fie separat de bacteriologia non-

    TB, dotat cu echipament care s poat susine toate activitile n condiii de biosiguran16

    .

    n timpul activitilor de diagnostic se genereaz cantiti diferite de aerosoli infecioi n funcie

    de metoda folosit dar, mai ales, n funcie de cantitatea de micobacterii coninut n materialul

    prelucrat.

    Fiecare laborator trebuie s-i evalueze activitile prin prisma riscului pe care l prezint pentru

    transmiterea TB, cu identificarea zonelor care necesit, n afar de accesul restricionat,

    echipament pentru protecia personal.

    n aprecierea riscului se ine seama de cantitatea de micobacterii coninut n materialul prelucrat

    (sput, fluid al corpului sau suspensie bacterian din cultur), manopera care trebuie efectuat i

    gradul n care aceasta poate fi generatoare de aerosoli, numrul manevrelor generatoare de

    aerosoli pentru fiecare metod, volumul de lucru al laboratorului, profilul epidemiologic al

    pacienilor pentru care se efectueaz testele i starea de sntate a personalului din laborator.

    Trebuie s existe plan pentru controlul infeciei, cu reguli pentru realizarea programului de

    curenie, dezinfecie, colectarea, neutralizarea i eliminarea deeurilor n funcie de natura

    lor17,18a,19,20

    .

    Cerine minime:

    Trebuie ca laboratorul de micobacterilogie s fie dotat cu cabinet de protecie microbiologic (CPM) de clasa II sau I i toate activitile care presupun mnuirea de

    material cu coninut de micobacterii s se realizeze n interiorul acestuia.

    Dac este folosit centrifuga pentru concentrarea probelor, aceasta trebuie s aib sistem de protecie anti aerosoli.

    Accesul n laborator trebuie s fie controlat.

    Personalul trebuie s fie instruit asupra riscului de infecie i a manoperelor corecte, s lucreze cu calm, s reduc la minim cantitatea de aerosoli generai n timpul lucrului.

    Personalul trebuie s poarte echipamentul de protecie individual recomandat pentru fiecare tip de activitate.

    Cabinetele de protecie microbiologic (CPM)

    sunt concepute pentru a proteja personalul, mediul nconjuror sau/i produsele prelucrate

    folosesc filtre de mare eficien n sistemul de exhaustare sau recirculare a aerului.

    filtrele HEPA (sau filtre ULPA) rein particulele cu diametrul > 0.3m (respectiv >0,1 m), cu o eficien de 99,97 % (respectiv 99.99%). Pentru activitatea de rutin din

    laboratorul TB sunt recomandate CPM cu filtre tip HEPA.

    n bacteriologia TB se folosesc cabinetele de clasa II i I2,14

  • 11

    necesit ntreinere i verificarea vitezei fluxului de aer pentru asigurarea funcionrii n parametri optimi

    este necesar verificare i certificare anual a funcionrii n paramentri de protecie

    este necesar schimbarea filtrelor conform recomadrii productorului

    aezare - departe de cile de acces, centrifugi; nu se lucreaz cu fereastra deschis; nu se deschide ua n timpul lucrului; nu se circul prin spatele celui care lucreaz deoarece

    perdeaua protectoare de aer este fragil

    n interior se pun numai lucruri strict necesare; nu se amestec n aceeai zon materiale curate, sterile, cu deeurile infecioase: stnga-zon curat, n fa- zona de lucru; la

    dereapta -zona cu deeuri infecioase.

    flacra de gaz creaz turbulene n interior, deci este preferabil lucrul cu materiale de unic folosin

    materialul infecios se ine la mai mult de 15 cm de deschiderea frontal, cu flacoanele n poziie oblic, nu vertical

    nu se in deschise n acelai timp mai multe recipiente, iar cele cu material infecios sunt nchise ct mai repede.

    Pentru toate laboratoarele:

    La pregtirea frotiurilor, este preferabil utilizarea anselor de unic folosin n locul anselor metalice reutilizabele care ar trebui sterilizate prin flambare.

    Dac totui nu exist posibilitatea folosirii acestora, flambarea anselor metalice trebuie s se fac ntr-un microincinerator sau la flacra unui bec Bunsen protejat, iar bucla ansei

    metalice reutilizabile se descarc nainte de sterilizare prin rotire ntr-un amestec de nisip

    i alcool.

    Nu este permis nclzirea sau fixarea la flacr a frotiurilor nainte ca ele s se fi uscat complet la aer.

    Factori care cresc riscul infeciei n laborator:

    Lucrul n arii cu ventilaie necorespunztoare.

    Iluminare slab a zonei de lucru.

    Utilizarea unor CPM necertificate, ntreinute necorespunztor.

    Echipament pentru protecie personal neconform (halat cu mneci scurte, nchis n fa, masc chirurgical)

    Mediu cu mult praf care poate bloca filtrele CPM.

    Manevrare defectuoas, neglijent, a probelor, cu formare de aerosoli.

    Nu sunt luate toate msurile de siguran la vortexarea/agitarea probelor.

    Spargerea n timpul centrifugrii a tuburilor coninnd prelevate clinice.

    Formarea de aerosoli la deschiderea capacului blocat al unei centrifugi.

    Funcionarea defectuoas a sistemelor de rcire sau de nclzile.

    Folosirea tehnicilor microbiologice corecte este esenial pentru reducerea la minim a

    riscului de formare a aerosolilor infecioi.

  • 12

    Pentru laboratoarele cu risc mediu i mare de infecie (efectuarea culturilor, identificarea

    culturilor, efectuarea ABG):

    Este interzis eliminarea forat a lichidului din pipet.

    Este interzis barbotarea (suflarea forat a aerului ntr-un lichid cu coninut potenial infecios).

    La pipetarea unui reactiv ntr-un lichid potenial infecios, pipeta se plaseaz n apropierea peretelui intern al marginii superioare a recipientului i lichidul se mpinge

    uor pentru a se prelinge n interior.

    Centrifugarea unei probe sau a unei culturi trebuie fcut ntr-un rotor cu capac de siguran pentru a preveni mprtierea aerosolilor din centrifug n incinta laboratorului.

    Capacele cuvelor rotorului trebuie deschise n interiorul CPM.

    Dup manevrele de centrifugare, vortexare sau dup agitarea manual a probelor, recipientele care le conin trebuie s fie plasate n interiorul CPM i lsate n repaos

    pentru cca 10 minute pentru a permite depunerea aerosolilor nainte de deschiderea

    recipientelor.

    Niciodat nu se vortexeaz sau agit manual un tub deschis; trebuie ntotdeauna s ne asigurm c filetul capacului este bine strns. Niciodat nu se vortexeaz sau agit

    manual recipiente cu dop de vat sau cu dop de cauciuc.

    Trebuie s ne asigurm c la decantarea lichidelor tuburile sunt inute nclinat, astfel nct lichidul s se poat scurge, iar la depunerea recipientului n vasul colector al deeurilor

    nu se formeaz stropi.

    Zonele de lucru: Laboratorul trebuie s fie mprit n arii curate i arii potenial contaminate. Ariile curate sunt destinate activitilor administrative i preparrii

    materialelor necesare pentru procedurile de lucru.

    Laboratorul trebuie s fie curat i liber de materiale i echipamente care nu sunt necesare activitii de rutin.

    Suprafeele de lucru trebuie decontaminate dup orice manevr formatoare de stropi potenial infecioi i la terminarea lucrului.

    Personalul de laborator

    Erorile umane i slaba pregtire tehnic a personalului pot compromite msurile de biosiguran.

    Tot personalul trebuie s fie instruit pentru respectarea att a bunelor practici de laborator, ct i a procedurilor operaionale din manualul de control al infeciilor n

    laborator. Instruirile pentru controlul infeciilor trebuie s cuprind informaii referitoare la

    practicile de biosiguran pentru a reduce la minim riscul de inhalare, ingerare sau

    inoculare, precum i informaii privitoare la colectarea, decontaminarea, depozitarea

    materialului infecios i eliminarea deeurilor din laborator17,18, 18a.

  • 13

    Trebuie reinut c:

    existena reguluilor i a procedurilor nu confer protecie prin ele nsele, acestea trebuind s fie nsuite i aplicate corect n activitatea de rutin.

    este necesar verificarea periodic a nivelului de cunotine teoretice i practice referitoare la tehnicile corecte de lucru i aplicarea de rutin a msurilor de

    biosiguran prin folosirea de chestionare i observarea direct.

    folosirea incorect a CPM expune operatorul la risc.

    Dezinfecia i curenia

    Dezinfectanii recomandai pentru laboratorul de micobacteriologie sunt cei care conin fenol,

    clor i alcool.

    Pentru c fenolul este iritant pentru ochi, piele i mucoase, n locul lui se folosesc derivaii

    fenolici n soluii apoase de 5%.

    Clorul (hipocloriii) se folosete n soluie cu concentraie de 5%, care poate fi diluat n ap

    pentru a obine soluii finale de lucru de 1%. Soluia concentrat de clor poate fi pstrat ntr-un

    loc bine aerisit i la ntuneric pentru o perioad de 3 luni. n soluiile de lucru, diluate, clorul este

    instabil, deci se prepar zilnic; cantitatea nefolosit din ziua precedent se ndeprteaz la

    deeuri chimice; nu se amestec soluie veche cu soluie proaspt. Fiind foarte corozive,

    soluiile de clor nu sunt indicate pentru dezinfecia componentelor metalice. Soluia de lucru de

    hipoclorit de sodiu cu concentraie de 1% se prepar amestecnd 20 ml din soluia cu

    concentraie de 5% cu 80 ml ap distilat; sau 4 ml din soluia de hipoclorit de sodiu n

    concentraie de 25% cu 96 ml ap distilat.

    Alcoolii, etanolul sau izopropil alcoolul trebuie folosii n soluie de 70. Alcoolii sunt volatili i

    inflamabili i este interzis folosirea lor n apropierea flcrii. Soluiile de alcooli se pstreaz n

    recipiente bine nchise spre a preveni evaporarea. Aceste recipiente trebuie etichetate

    corespunztor i nu se autoclaveaz.

    Alcoolul de 70 se utilizeaz pentru dezinfecia curent a CPM.

    Soluia de formalin pentru folosirea n vaporizatorul CPM se prepar astfel: 130 ml formalin

    38-40% se amestec cu 260 ml ap distilat. Rezult 390 ml soluie apoas de lucru pentru

    vaporizator.

    Colectarea deeurilor rezultate din activitile laboratorului trebuie s se fac urmnd procedurile

    scrise care se conformeaz reglementrilor referitoare la curenie, dezinfecie i colectarea

    deeurilor medicale 17,18

    .

    Fiecare laborator trebuie s aib proceduri scrise referitoare la conduita n caz de accident cu

    potential infecios.

  • 14

    Asigurarea calitii

    Activitatea de asigurare a calitii i mbuntire a ei are ca scop motivarea personalului din

    laborator i ajut laboratorul n relaiile sale externe (factori de decizie, finanatori, organizaii de

    certificare/acreditare)21,22

    . Numrul laboratoarelor care implementeaz standardul de calitate

    pentru laboratoare ISO 15189 este un indicator al calitii pentru reeaua de laboratoare21

    .

    Indiferent dac sunt sau nu acreditate conform ISO 15189, toate laboratoarele reelei trebuie s

    efectueze CIC pentru toate testele i metodele aplicate i s pstreze documente doveditoare. De

    asemenea, este obligatorie participarea la scheme de comparare interlaboratoare (CEC), cu

    documentarea corespunztoare.

    Pentru a lua n considerare rezultatele oferite de un laborator, acesta trebuie s obin la CEC

    concordan de cel puin 90% a rezultatelor pentru examenul microscopic i cultur. Pentru ABG

    fenotipic la RMP concordana trebuie s fie de cel puin 95%, iar pentru INH cel puin

    90%.12,12a

    Concordana rezultatelor testelor genetice cu cele fenotipice trebuie s depeasc

    90%.

    Rezultate concordante ntre 80-90% denot deficiene de tehnic i necesit corectare imediat

    prin instruirea/reinstruirea personalului n LNR. Concordana sub 80% nu este acceptabil pentru

    nicio metod sau tehnic i este necesar verificarea imediat a condiiilor de lucru din laborator

    i pregtirea teoretic i practic a personalului.

    Timpul de diagnostic

    TB, boal infecioas pentru care exist tratament specific, are anse maxime de vindecare dac

    este diagnosticat precoce i tratat corect. Timpul de diagnostic include, pe de o parte, intervalul

    de timp de la apariia simptomelor pn la prezentarea la consult medical, iar pe de alt parte,

    intervalul de timp dintre recoltarea produselor patologice i obinerea rezultatelor testelor de

    laborator 3,23,24,25

    . Timpul de diagnostic, din perspectiva laboratorului, este calculat de la data

    recepiei probelor de la pacieni n laborator (tabelul II).

    Tabel II. Timpul de diagnostic

    Testul Limite de timp acceptabile

    Examenul microscopic pentru evidenierea BAAR 24 de ore

    Cultura n mediul LJ 3-8 sptmni

    Cultura n mediul lichid 1-3 sptmni (6 sptmni pentru

    rezultatele negative)

    Identificarea culturii pozitive Imediat dup pozitivare

    ABG mediul lichid 14 zile de la data culturii pozitive

    ABG linia nti, mediul solid 30 zile de la data culturii pozitive

    ABG linia a doua 4 sptmni de la data culturii pozitive

    Testele de biologie molecular pentru diagnostic 48 ore

    Rezultatele testelor trebuie comunicate clinicianului (telefonic, intranet) imediat dup

    validarea lor, n mod special pentru cele pozitive la examenul microscopic, cultur, test

    genetic sau fenotipic de sensibilitate. Se elibereaz imediat i buletinul semnat de ctre eful

    de laborator care a validat rezultatele.

  • 15

    Rezultatele trebuie, de asemenea, s fie nregistrate imediat i n baza naional de date a

    PNPSCT pentru cunoaterea n timp real a situaiei din ar.

    ntrzierea diagnosticului are impact n dinamica transmiterii, a msurilor de prevenire i

    n controlul infecieiTB, putnd fi unul dintre factorii decisivi n controlul TB, de aceea

    sunt necesare msuri pentru scurtarea timpului de diagnostic n ansamblu.

    Resursele umane

    Corectitudinea rezultatelor analizelor efectuate de un laborator poate fi influenat de mai muli

    factori, dintre care cel mai important este factorul uman15

    .

    Calificarea i numrul personalului necesar n fiecare laborator sunt dependente de funciile i

    responsabilitile care i revin n cadrul laboratorului, dar i al reelei de micobacteriologie.

    Pentru realizarea obiectivelor PNPSCT n condiii de diagnostic cu calitate asigurat, este

    necesar ncadrarea corespunztoare cu personal calificat, n acord cu volumul de lucru realizat

    i estimat.

    Particularitatea activitii n laboratoarele de micobacteriologie const n faptul c15

    :

    numrul de examene bacteriologice/pacient este standardizat,

    necesarul de examene bacteriologice se poate estima pentru perioade ndelungate de timp,

    cantitatea de munc poate fi echitabil repartizat n cadrul laboratorului,

    personalul acestor laboratoare este instruit special pentru folosirea tehnicilor standardizate de lucru pentru diagnosticul bacteriologic al TB,

    personalul este instruit pentru a nelege semnificaia i consecinele rezultatelor eronate,

    personalul lucreaz n concordan cu sistemul de management al calitii implementat n cadrul reelei laboratoarelor de micobacteriologie.

    Numrul frotiurilor colorate ZN examinate zilnic de ctre un microscopist nu trebuie s

    depeasc 203, datorit oboselii care se instaleaz i a riscului de deteriorare a calitii

    rezultatelor. Totui, calitatea poate fi meninut doar dac microscopistul examineaz

    sptmnal cel puin 1015 frotiuri3.

    Activitatea de diagnostic trebuie s fie asigurat far ntrerupere, motiv pentru care este necesar

    ca ntr-un laborator s existe mai multe persoane instruite i implicate n activitatea zilnic pentru

    tehnicile de lucru folosite.

    La stabilirea necesarului de instruire trebuie avute n vedere9:

    deficienele n stpnirea tehnicilor de lucru (apreciate prin participarea la scheme de comparare interlaboratoare, CIC - cu evaluarea periodic a indicatorilor realizai,

    observarea direct),

    personal nou angajat, care necesit instruire referitoare la normele de biosiguran i pregatire teoretic i practic pentru metodele pe care le va efectua,

    introducerea de metode noi n practica de rutin,

  • 16

    achiziia de echipament nou,

    modificri n situaia epidemiologic local,

    modificarea statutului i responsabilitilor laboratorului. Atragerea de personal spre laboratoarele de micobacteriologie se poate realiza prin introducerea

    unui modul dedicat diagnosticului TB n curricula de nvtmnt a medicilor rezideni, a

    biologilor/chimitilor i asistenilor de laborator.

  • 17

    4. Algoritmul de diagnostic al tuberculozei

    n activitatea de diagnostic trebuie s se in seama de algoritmul de diagnostic recomandat de

    PNPSCT 5

    (fig. 2).

    n funcie de dotarea laboratorului, experiena personalului i solicitarea clinicianului, innd

    seama de categoria de caz, se va selecta calea de urmat pentru fiecare situaie:

    a. Produsele provenite de la toate cazurile (cazuri noi, recidive, monitorizare) se prelucreaz obligatoriu pentru examen microscopic i cultur pe mediul LJ,

    indiferent ce alte metode se pot folosi ntr-un laborator. Se prelucreaz i se

    nsmneaz pe mediul LJ toate tipurile de produse patologice, cu excepia sngelui

    pentru hemoculturi, care necesit sistem special de cultivare (centrifugare-liz).

    b. Este obligatorie folosirea testului imunocromatografic Ag MPT64 pentru confirmarea apartenenei culturilor la complexul M. tuberculosis, att pentru

    culturile pozitive din mediul lichid, ct i pentru cele din mediul solid. Culturile cu

    rezultat negativ la acest test se trimit la LNR de arondare pentru identificare, cu aceast

    meniune. Se va meniona i produsul patologic pentru care s-a facut cultura i rezultatul

    semicantitativ al examenului microscopic i al culturii din mediul solid sau dac este

    pozitiv doar n mediul lichid.

    c. Dac este un caz eligibil pentru cultivare n mediul lichid, respectiv suspect de tuberculoz cu rezisten (contact cu un caz MDR, abandon repetat, recidiv,

    colectivitate supraaglomerat, persoan fr adpost), pacient infectat HIV suspect de

    TB, copil suspect de TB, cel puin unul dintre produsele prelucrate se va nsmna att

    pe dou tuburi cu mediul LJ ct i un tub cu mediul lichid n sistem automat (cellalt

    produs nsmnndu-se doar pe mediul LJ).

    d. Se exclud de la nsmnarea n mediul lichid n sistem MGIT 960 urina i sngele (pentru acesta din urm se folosesc sisteme speciale).

    e. Produsele pozitiv BAAR se pot testa genetic prin test direct pentru confirmarea MTB i evidenierea modificrilor indicatoare de rezisten la RMP sau RMP/INH (GeneXpert

    MTB/Rif, respectiv GenoType-MTBDRplus). Cazurile eligibile: suspect de TB cu

    rezisten14

    (contact cu un caz MDR, abandon repetat, recidiv, colectivitate

    supraaglomerat, persoan fr adpost), pacient infectat HIV suspect de TB, copil

    suspect de TB.

    f. n cazurile HIV pozitiv sau sput de la copii, se pot testa genetic (folosind GeneXpert MTB/Rif) i cazuri negative BAAR la microscopie.

    g. Culturile pozitive dup 4 luni de la nceperea tratamentului i toate culturile izolate dup fiecare 6 luni de la ABG anterioar se testeaz genetic pentru detectarea

    rezistenei RMP/INH i prin metod fenotipic rapid folosind mediul lichid n sistem

    automat, urmat de metod convenional (metoda proporiilor n mediul Lowenstein

    Jensen), fa de substanele anti-TB de linia I i linia II. Testarea folosind cele dou

    metode se va menine pn la ctigarea experienei necesare obinerii unor rezultate de

    ncredere la testarea n mediul lichid.

    h. Nu se face test genetic direct pentru produsele recoltate n cursul monitorizrii, indiferent de rezultatul examenului microscopic, rezultatele nefiind concludente. Pentru

    aceste cazuri se poate face test genetic indirect (i) folosind cultura din mediul lichid

    sau mediul solid, urmat de testele fenotipice pentru confirmarea rezistenelor.

  • 18

    Figura 2. Algoritm de selectare a cazurilor pentru teste rapide fenotipice i de biologie

    molecular

    LEGEND: LPA = Geno Type, line prabe assay, Xpert = GeneXpertMTB/Rif, LJ= cultur pe

    mediul solid Lowenstein Jensen, MGIT = sistem automat de cultivare n mediul lichid, MGIT

    960 sau VersaTrek; Linia 1= medicamente antit-TB de linia I-a, Linia 2= medicamente anti-TB

    de linia a II-a; MP= metoda proporiilor.

    i. Cultura pozitiv de la T0 pentru cazul nou microscopic negativ, contact cu un caz TB -MDR se trimite la un laborator care are n dotare echipament GenoType-LPA sau

    GeneXpert pentru examinare preliminar. Dac se evideniaz modificri sugestive pentru

    rezisten la RMP sau/i INH, laboratorul respectiv trimite imediat cultura respectiv la LNR

    de arondare pentru a fi testat prin metod rapid (GenoType MTBDRsl) i metod

    convenional fa de substanele anti-TB de linia I i linia II.

    j. Pentru pacienii cu rezisten confirmat la RMP (GeneXpert) sau TB-MDR (GenoType MTBDRplus) prin test direct, trebuie efectuat imediat testarea molecular pentru linia a

    doua (GenoType MTBDRsl) ca test initial, pentru orientarea rapid a terapiei, n loc de

    testarea fenotipic pentru detectarea rezistenei la fluoroquinolone.14a

    Culturile de la

    Pacient suspect TB

    Sputa

    (sputa) Se asigur msuri de control al infeciei la recoltare si transport la laborator

    Testare HIV

    Examen microscopic

    pentru BAAR

    BAAR POZITIV BAAR NEGATIV

    Cultura: mediul solid sau /i lichid: identificare obligatorie

    cu test rapid Ag MPT64 (identificare obligatorie

    cultura pozitiv)

    MTB negativ MTB pozitiv LPA/Xpert

    MGIT -L1

    Sensibil

    Mono-rezisten

    R/H , MDR

    sau MDR

    ABG-LJ/lichid- RH LPA-RH Sensibil

    LPA- linia 2

    ABG- linia (1+2)- MP

    ABG-linia 2- MGIT

  • 19

    pacienii TB-MDR cunoscui se trimit imediat dup izolare la LNR de arondare i

    se efectueaz test genetic indirect pentru detectarea rezistenei la

    aminoglicozide/polipeptide i fluoroquinolone (pentru orientarea rapid a terapiei) i

    se face ABG pentru substane de linia I i linia a II-a prin metod fenotipic rapid

    (mediul lichid) i prin metod convenional (mediul solid). (Rugm revedei i

    punctul g, referitor la intervalul de timp ntre testri) .

    k. Orice cultur pozitiv (mai mult de 10 colonii) crescut dup conversia bacteriologic se va testa prin metod genetic indirect (GenoType-LPA) i metod

    fenotipic rapid - mediul lichid, pentru substane de linia I; l. Pentru supravegherea dinamicii prevalenei MDR se vor efectua teste fenotipice de

    sensibilitate la INH i RMP la toate culturile pozitive cu mai mult de 10 colonii,

    obinute din produsul recoltat nainte de nceperea tratamentului, chiar dac testul

    genetic direct efectuat nu a pus n eviden modificri sugestive de rezisten. ABG se

    efectueaz n laboratoarele de nivel III care au implementat sistemul de management al

    calitii, care au obinut rezultate excelente i foarte bune la controlul extern al calitii

    cel puin pentru RMP i INH.

    Este posibil s fie semnalate situaii epidemiologice noi, particulare pentru o anumit zon, de

    aceea se vor lua n considerare recomandrile referitoare la triajul pacienilor, metodele folosite,

    a relaiilor dintre clinic i laborator, care vor fi comunicate de ctre PNPSCT.

    5. nregistrri. Formulare de solicitare. Registre.

    Pentru solicitarea examinrilor vor fi folosite formularele recomandate de PNPST, anexele 8, 9 i

    11 din Ghid metodologic de implementare a Programului Naional de Prevenire, Supraveghere i

    Control al Tuberculozei. Bucureti, 2015 5., sau ultima revizie a sa, recomandat de PNPSCT

  • 20

    Bibliografie

    1. F. Drobniewski, V. Nikolayevskyy, Y. Balabanova, D. Bang, D. Papaventsis. Diagnosis of tuberculosis and drug resistance: what can new tools bring us? INT J TUBERC LUNG

    DIS 16(7):860870.

    2. Karin Weyer. Review of WHO TB diagnostics policy development. GLI Meeting: Les Pensirees, Annecy, France : 17 -19 April 2012.

    3. WHO.Policy Framework for Implementing New Tuberculosis Diagnostics, 2011, March. 4. A Roadmap for Ensuring Quality Tuberculosis Diagnostics Services within National

    Laboratory Strategic Plans Prepared by The Global Laboratory Initiative Advancing TB

    Diagnosis. First Issue 20th January 2010, World Health Organization 2010.

    5. Ghid metodologic de implementare a Programului Naional de Prevenire, Supraveghere i Control al Tuberculozei. Bucureti, 2015. ISBN 978 973 139 325 4. Ordinul Ministerului Sntii nr. 1171/21.09.2015

    6. Strategia Naional de Control al Tuberculozei n Romnia 2015-2020. Guvernul Romniei Hotrre nr. 121 din 25 februarie 2015.

    7. De Kantor IN, Kim SJ, Frieden T, and col. Laboratory services in tuberculosis control, part II: Microscopy, WHO/TB/98.258, 1998

    8. Rieder HL, Chonde TM, Myking H, Urbanczik R, Laszlo A, Kim SJ, Van Deun A, Trebuck A- The public Health service national tuberculosis reference laboratory and the

    national laboratory network, IUATLD, 1998.

    9. American Thoracic Society/Centers for Disease Control and Prevention/Infectious Diseases Society of America: Controlling Tuberculosis in the United States. Am J Respir

    Crit Care Med Vol 172. pp 11691227, 2005 DOI: 10.1164/rccm.2508001, Internet

    address: www.atsjournals.org

    10. WHO. Policy statement on fluorescent light-emitting diode (LED) microscopy for diagnosis of tuberculosis. Geneva, 2010.http://www.who.int/tb/laboratory/

    11. Andrew J. Brent, Daisy Mugo, Robert Musyimi, Agnes Mutiso, Susan Morpeth Michael Levin, J. Anthony G. Scott1. Performance of the MGIT TBc Identification Test and

    Meta-Analysis of MPT64 Assays for Identification of the Mycobacterium tuberculosis

    Complex in Liquid Culture. J.Clin.Microbiol, Dec. 2011, p. 43434346 Vol. 49, No. 12;

    0095-1137.

    12. Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis 4th ed. WHO/HTM/TB/2009.422

    12a. David J.Horne, Lancelot M. Pinto, Matthew Arentz, S.Y. Grace Lin, Edward Desmond,

    Laura L. Flores, Karen R Steingart, Jessica Minion. Diagnostic accuracy and

    reproducibility of WHO endorsed phenotypic susceptibility testing methods for first-line

    and second line antituberculosis drugs. JCM, Febr 2013: 51(2), 393-401.

    13. Dominguez J, EC Boetger, D Cirillo, F Cobelens, KD Eisenach, S Gagneaux, D Hilleman, R Horsburgh, B Molina-Moya, S Nieman, E Tortoli, A Whitelaw, C Lange.

    Clinical implications of molecular drug resistance testing for Mycobacterium

    tuberculosis: a TBNET/RESIST_TB consensus statement. Int J Tuberc Lung Dis. 2015,

    20(1):24-42.

  • 21

    14. World Health Organization. Policy statement. Molecular line probe assay for rapid screening of patients at risk of multidrug-resistant (MDR) TB. Geneva, 2008.

    14a. The use of molecular line probe assays for the detection of mutations associated with

    resistance to fluoroquinolones (FQs) and second-line injectable drugs (SLIDs). Policy

    guidance. WHO/HTM/TB/2016.07

    15. Daniela Homorodean, Olga Moldovan, Mihaela Stoian, Mihaela Brojboiu,Graiela Chiriac, Ionela Sorina Muntean, Domnica Ioana Chiotan, Iuliana Nicolae, Constantin

    Marica,Nicolae Galie. Organizarea si managementul laboratorului de micobacteriologie,

    Bucuresti 2008, Ed Totem, ISBN:978-973-0-05558-0.

    16. ORDIN MS nr. 1.301 din 20 iulie 2007 (*actualizat*) pentru aprobarea Normelor privind funcionarea laboratoarelor de analize medicale (actualizat pn la data de 2 aprilie

    2008*).

    17. HG 856/2002. Clasificarea deeurilor medicale 18. Ord MS 261/ 2007. Curenia Dezinfecia. Sterilizarea.

    18a. Ordinul nr. 961/2016 pentru aprobarea Normelor tehnice privind curarea, dezinfecia i

    sterilizarea n unitile sanitare publice i private, tehnicii de lucru i interpretare pentru

    testele de evaluare a eficienei procedurii de curenie i dezinfecie, procedurilor

    recomandate pentru dezinfecia minilor, n funcie de nivelul de risc, metodelor de

    aplicare a dezinfectantelor chimice n funcie de suportul care urmeaz s fie tratat i a

    metodelor de evaluare a derulrii i eficienei procesului de sterilizare

    19. Tuberculosis Laboratory Biosafety Manual, WHO, 2012. 20. Friedman C. Newsom W. Basic Concepts of Infection Control. International Federation

    of Infection Control, 2007.

    21. Linda Oskam, Tjeerd Datema, Paul Klatser..TB laboratory performance indicators to measure the effect of ISO 15189 QMS implementation. KIT Biomedical Research,

    Amsterdam, The Netherlands, www.kit.nl

    22. TB Microscopy Network Accreditation. An assessment tool. First English Edition, October 2013. A publication of the Global Laboratory Initiative a Working Group of the

    Stop TB Partnership.

    23. Chandrashekhar T Sreeramareddy, Kishore V Panduru, Joris Menten, J Van den Ende. Time delays in diagnosis of pulmonary tuberculosis: a systematic review of literature.

    BMC Infectious Diseases 2009, 9:91 doi:10.1186/1471-2334-9-91

    24. WHO. Noncommercial culture and drug-susceptibility testing methods for screening patients at risk for multidrugresistant tuberculosis. Policy statement.

    WHO/HTM/TB/2011.9

    25. S.R. Ritchie, A.C. Harrison, R.H. Vaughan, L. Calder" and A.J. Morris. New recommendations for duration of respiratory isolation based on time to detect

    Mycobacterium tuberculosis in liquid culture. Eur Respir J 2007; 30: 501507