ANALIZE PRIN INJECTIE ÎN FLUX (FIA)

I. EVOLUTIA CONCEPTULUI

Analiza prin injectia în flux este o tehnica cu aplicare la scara larga în analizele chimice cantitative, ideal pentru analizele automatizate rapide pe probele lichide.

Tehnica a fost raportata de catre Ruzica si Hansen în 1975 în Danemarca si de catre Stewart în USA. Pe parcursul evolutiei domeniile de aplicare ale metodei cât si configurarea sistemului s-au diversificat. În perioada 1975-2000 peste 10000 de lucrari dedicate FIA au fost publicate în reviste stiintifice

Aceasta tehnica a câstigat rapid teren si a fost acceptata de catre oamenii de stiina si de laboranti datorita celor trei atribute semnificative:

a) principiile fundamentale ale tehinicii sunt usor de înteles si de pus în practica ;

b) aparatul e usor de asamblat, cu componente simple, ieftine, usor de procurat;

c) promoveaza proceduri simple si automatizate de efectuare a multor proceduri analitice manuale.

FIA este o tehnica simpla ca si concept, dar greu de definit. Datorit caracterului multilateral si diversittii FIA este dificil de cuprins într-o singura fraza domeniul mare de preocupari si multele fatete ale sistemului.

Prima definitie, data de Ruzica si Hansen, a fost: „FIA este o metoda bazata pe injectarea unei probe lichide în fluxul continuu si nesegmentat al unui lichid adecvat aflat în miscare. Proba injectata formeaza o zona care este tranportata catre un detector care înregistreaza în mod continuu absorbanta sau orice alt parametru fizic, asa cum se modifica în mod continuu ca urmare a trecerii probei prin conducta de curgere”. Aceasta definitie a fost considerata depasita si a revizuit pentru a descrie o tehnic „pentru culegerea de informatii din concentratia gradientului format dintr-o zona bine stabilita de lichid injectat, dispersat în fluxul continuu si nesegmentat al unui lichid purtator”. Si aceasta definitie a fost ulterior contestat de evolutia sistemelor FIA care au fost segmentate într-un fel sau altul sau care folosesc probe provenite de la coloane ce nu prezinta suprafete de separatie bine definite.

Fang a definit FIA ca fiind „o tehnica de analiza în flux bazata pe reproductibilitatea manipularii probei si zonelor de reactiv într-un flux în curgere caracterizat de conditii de dezechilibru termodinamic ”.

În general, exista doua tipuri de definitii în uz, prima catalogata ca fiind definitie academica,iar cealalta definitie industriala . O definitie academica descrie FIA ca fiind: „obtinerea de informatii din concentratia amestecului ce contine zona injectata bine definita de lichid ce este dispersata în fluxul continuu si nesegmentat al lichidului purtator”. Definitia industriala tipica descrie FIA ca fiind: „o tehnica simpla si cu caracter multilateral pentru analizele chimice automatizate pe lichide, bazate pe manipularea chimica si fizica a unei zone dispersate, formata din proba injectata în fluxul unui lichid purtator, urmat de detectia speciilor chimice.”

În ultimii ani, FIA a fost completat de catre analizele prin injectie secventiala (SIA- Sequential Injection Analysis definit de catre Ruzickasi Marshall în 1991) si Lab-on-Valve (LOV), a caror metode au furnizat facilitati

1

suplimentare conceptului original al FIA.

II. DESCRIEREA SISTEMULUI FIA

1.DESCRIERE GENERALA

FIA, în cea mai simpla forma , consta în injectarea unei cantitati bine stabilite de proba într-un flux continuu si nesegmentat de lichid purtator, urmat de dispersia ei si detectarea speciilor chimice urmarite.

Informatiile sunt înregistrate sub forma de peak-uri care sunt apoi utilizate pentru determinarea concentratiilor speciilor chimice. Aceasta tehnicanu se bazeaza pe omogenizare perfecta dintre proba si lichidul din flux deci nu este necesara obtinerea echilibrului (fizic si chimic) deoarece si proba si reactivii sunt dispersati în aceeasi masura .

Cel mai simplu sistem FIA este format din urm toarele componente:-pompa cu rol de propulsare a reactivilor, solventilor sau a altui mediu

(exemplu:substanta tampon);-conducte/ tevi/ tuburi de diferite dimensiuni si materiale;-valva de injectie prin care se introduce periodic volumul de proba în

flux ;-un microreactor pentru amestecarea fluidelor;-sistem de detectie;-sistem de înregistrare, prelucrare, afisare, stocare date.

Principiile de baz ale FIA au fost identificate de Ruzicka si Hansen ca fiind:

-injectarea probei prin reproductibilitatea volumului;-controlarea dispersiei;-timpul necesar deplasarii zonei injectate de la punctul de injectare la

detector.

Cercetarile ulterioare au aratat ca de fapt pricipiul central îl reprezinta controlul dispersiei din proces care are un rol decisiv în obtinerea datelor în conditiile de dezechilibru ce caracterizeaza sistemul FIA.

2.PRINCIPIUL DE FUNCTIONARE

În primele sisteme FIA se introduceau regulat bule de aer pentru a reduce dispersia si pentru a îmbunatatii omogenizarea. Mai apoi, s-a constatat ca bulele determinau cresterea timpului necesar analizelor si pe cel de pornire, respectiv reglare a aparatului si era necesara operatiunea de introducere- scoatere a bulelor din sistem, fapt ce complica analizele.

Având în vedere dezavantajele sistemului cu bule de aer, oamenii se stiinta au avut ca scop eliminarea bulelor din sistem, reducerea diametrului interior al tuburilor utilizate si obtinerea unei precizii mai bune în ce priveste volumul de proba injectat.

În figura urmatoare este prezentata schema de principiu a sistemului de analize în flux continuu segmentat cu bule de aer – ASCFA.

2

Fig.1Schema de principiu a sistemului de analize în flux continuu segmentat cu bule de aer: 1- intrare

flux continuu (lichidul purtator); 2- supapa alimentare cu aer; 3- valva de injectare a probei; 4-amestecarea probei cu lichidul purtator; 5- bule de aer; 6- loc de desfasurare a reactiilor chimice; 7- evacuare bule; 8- detector; 9- sistem de achizitie, procesare, afisare date.

În lichidul purtator (1) se introduc prin supapa de alimentare(2) bulele de aer (5) cu rol în amestecarea probei injectate cu lichidul purtator (4). În traseul spre detector,au loc reactiile chimice(6) dintre componentele celor doua lichide cu obtinerea speciilor chimice detectabile.

Bulele de aer sunt indepartate din sistem (7) înainte de detector (8). Speciile rezultate în urma reactiilor sunt detectate de catre detector si înregistrate de catre sistemul de achizitie si procesare a datelor.

În urma evolutiei datorate numeroaselor cercetari în domeniu, sistemele FIA moderne variaza de la simple la cât mai complexe, însa au ca baza sistemul clasic. Schema de principiu a sistemului de analize prin injectie în flux clasica este reprezentata în figura urmatoare.

Fig.2Schema de principiu a sistemului de analize prin injectie în flux clasic:

1-intrare lichid purtator (din flux); 2- intrare reactiv, solvent; 3- punct de injectare proba; 4- pompa ; 5- valva de injectie; 6,6” - zona de amestecare; 7- detector; 8- informatiile obtinute sub forma de pick-uri; 9- reziduri; I- etapa de propulsare; II- etapa de masurare si de injectare a probei; III- etapa de procesare a probei; IV-etapa de detectie, obtinere date.

Pompa (3) are rolul de a propulsa lichidele (lichidul purtator (1) si reactivul sau solventul (2)) prin sistemul de tevi spre detector (7). Valva de injectie (5) este folosita pentru introducerea periodica a volumelor mici de proba (4). Prin injectarea probei în flux se formeaza o zona a probei injectate care este dispersata în mod progresiv în lichidul purtator. La diferite puncte

3

de confluenta pot fi adaugati reactivi sau solventi (2). Acestia se amesteca cu proba datorita dispersiei radiale pentru a produce specii chimice detectabile. Fluxul, în traseul spre detector, trece prin camerele de amestecare (agitatoare) (6, 6’), loc în care sunt favorizate producerea reactiilor dintre proba , lichidul din flux si reactiv. Speciile rezultate în urma reactiilor sunt detectate de catre sistemul de detectie (7) al sistemului si inregistrate sub forma de peak-uri (8).

Înaltimea si aria pick-urilor sunt proportionale cu concentratiile speciilor detectate determinate prin comparatie, utilizînd curba de calibrare a fiecarei specii.

Întreaga analiza este împartita în patru etape si anume: etapa de propulsare (I), de masurare si de injectare a probei (II), de procesare a probei (III) si acea etapa de detectie si obtinerea datelor (IV).

Importanta analizelor prin injectie în flux în domeniul analizelor analitice este data de abilitatea de a combina functiile analitice într-o varietate de metode diferite ce creeaza un domeniu larg de metodologii si de aplicare a acestor metodologii rapid, automat si cu precizie. Etapa II i IV sunt în mare parte aplicatii ale stiintelor tehnice conventionale. Etapa III este considerata “inima FIA” si are ca scop trasformarea analitului în specii ce pot fi masurate de catre detector si aducerea concentratiei acestora pâna la un nivel compatibil cu detectorul din sistem utilizând una sau mai multe operatii de procesare.

Cele mai comune operatii de procesare a probei sunt dilutia, amestecarea, îmbogtirea (concentrarea), extractia cu solvent, schimbarea mediului. De exemplu, FIA poate dilua pâna la un factor de 10000 sau concentra pâna la un factor de câteva sute, poate determina reactii chimice în analit pentru a rezulta specii chimice detectabile, poate transfera un analit dintr-un mediu în altul (exemplu: dintr-o proba gazoasa într-un lichid purtator sau viceversa), poate utiliza extractia cu solventi si modificarea formulei chimice sau eliminarea ei din proba .

3. SISTEMUL DE PROPULSARE

Sistemul de propulsare sau unitatea de distributie este o componenta critica în FIA. Pe lînga functia de a trimite fluxul purtator spre detector cu debit constant, au rol în reglarea debitului prin tevi a lichidului putator si a reactivilor. Debitul utilizat în sistemele de analiza prin injectie în flux tipice variaza între 0,5- 4 ml/min.

Cele mai utilizate sisteme de propulsare sunt pompele cu capacitatea de a pompa intre 4-8 linii sau pompa peristaltica . Avantajul specific pompelor peristaltice este acela ca si lichidul pompat este în contact numai cu interiorul unui tub de material plastic sau cauciuc pe toata durata procesului de pompare. Acest avantaj este esential pentru pomparea lichidelor corozive (apa de mare).

Se pot utiliza si pompele cu piston utilizate în cromatografia de lichide sau butelii cu gaze sub presiune. Trebuie de specificat faptul ca FIA se desfaoara la presiuni scazute, 10psi, iar utilizarea pompelor HPLC (pompe de înalt presiune) prezinta un cost suplimetar.

4. SISTEMUL DE TUBURI

4

Tevile sau tuburile utilizate în sistemele FIA au diametrul interior de dimensiuni variabile însa cele cu diametrul interior cuprins între 0,3-1,0 mm sunt utilizate în principal pentru mentinerea fluxului laminar de curgere si a dispersiei controlate în zona probei injectate.

Tuburile utilizate sunt:-tuburi de legatura -tuburi pentru pompa-tuburi de conectare

Tuburile de legatura sunt utilizate pentru a conecta recipientele în care se afla reactivii si agentul purtator cu tubul partii de aspiratie a pompei, tubul partii de propulsare a pompei cu injectorul si detectorul cu rezervorul pentru reziduu. Se poat folosi tevi din orice material ce nu reactioneaza chimic cu reactivii sau proba cu care intra în contact. PTFE (teflonul ) este frecvent utiilizat findca este inert chimic dar se poate folosi si PVC-ul pentru o gama larg de analize.

Debitul de curgere este de obicei constant, dar daca un tub cu diametrul interior mai mare se conecteaza la un tub cu diametrul interior mai mic, viteza de curgere va creste, ceea ce poate duce la formarea bulelor de gaz. Diametrul interior al tuburilor ce leaga recipientele în care se afla reactivii si agentul purtator cu tubul pompei ar trebui sa aiba cel putin 0,8mm, însa, totusi, si tuburi cu diametrul interior prea mare nu este bine de folosit deoarece determina cresterea timpului de pornire a sistemului. Pentru o mai buna inserare tubul de legaturaeste taiat sub unghi de 45° daca diametrul sau exterior este mai mic decât diametrul interior al tubului pompei.

Daca cele doua tuburi au diametrele egale se utilizeaza pentru unirea lor manson de silicon cu peretii grosi.Diametrele interioare ale celorlalte doua tipuri de tuburi utilizate nu au influente critice si sunt cuprinse între 0,5-0,8mm.

Tuburile pentru pompa peristaltica sunt facute fie din silicon, PVC sau orice alt material plastic asemator. Cel mai comun material este numit Tygon, un tip de material din PVC. De obicei aceste tuburi prezint în apropierea capetelor câte un inel colorat. Aceste doua inele de pe tubul pompei servesc ca punct de atasare a harnasamentului pompei si codul culorilor ajuta la identificarea diametrului interior si a debitului caracteristic. Distanta standard între cele doua inele este de 15cm.Tuburile de Tygon sunt adecvate pentru solutiile apoase si cele alcoolice dar nu si pentru acizi tari sau solutii bazice.

Tuburile de conectare cu profil T sunt utilizate pentru unirea tuburilor prin care circul agentul purtator, reactivii cu tubul în care au loc reactiile (reactorul tubular). Aceste tuburi sunt confectionate din PTFE si au diametru interior cuprins între 0,5-0,8mm.

Tipuri de tuburi utilizate în sistemele FIA:tuburi scurte- necesit mai pu in timp pentru difuzie iar dispersia este sc zut ; tuburi lungi- necesit mai mult timp pentru difuzie iar dispersia este ridicata.

Fig.3.a),b).

5

Fig.4.Tuburi de conectare : a)sub form de Y; b)sub form de W; c)sub form de T.

5.MASURAREA SI INJECTAREA PROBEI

5.1 SISTEMUL DE INJECT IE

Aparatul cel mai frecvent utilizat pentru masurarea si injectarea probei (esantionului) în fluxul purtator este valva de injectie. Ani de zile s-au folosit valvele de injectie de la HPLC, dar acest lucru este acum considerat un cost suplimentar nejustificat deoarece valvele de injectie de la HPLC sunt construite sa reziste a presiuni înalte pe cînd FIA este o tehnica de joasa presiune.

Sunt utilizate în general valvele de injectie rotative de joasa presiune cu 4 canale. Volumul de injectie poate fi modificat prin schimbarea buclei de injectie atasate, fie manual, fie pneumatic,fie electric. Alte sisteme de injectie utilizate: seringa cu supapa cu clapeta , valva solenoid actionata prin comutator,sau injectia hidrodinamica . Sistemul de injectie poate fi cuplat la un autosampler pentru o operatie complet automatizata .

Caracteristicile importante pentru valvele de injectie utilizate:-sa aiba precizie înalta-sa prezinte reproductibilitate pentru volumele injectate

6

-sa fie usor de schimbat-limitele de presiune de aproximativ 100 p.s.i. (1p.s.i= 0,068atm);-sa aiba capacitatea de a injecta volume de proba (esantion) de la câtiva microlitri la

câteva sute de microlitri sau fractiuni de microlitri. În pozitia de injectie, conectarea porturilor este rapid schimbata astfel încât agentul

purtator sa treaca prin bucla cu proba , pe care o preia în flux. Aspirarea probei are loc pâna în momentul în care flaconul probei este îndepartat sau înlocuit. Volumul conductelor dintre port-uri este mic, de câtiva μl.

Exemple :- valve de injectie la care pentru a modifica volumul de proba injectata trebuie

schimbata valva (cele cu bucla interna )- valve de injectie la care volumul este modificat manual prin modificarea pozitiei

buclei exterioare- valve de injectie cu dispozitiv de comanda electronica ce are capacitatea de a stabili

prin intermediul unui software timpul de injectie ce duce la modificarea volumului injectat în flux.

Fig.5

6. PROCESUL DE DILUTIE

Procesul de dilutie din sistemele FIA se poate face prin:-dispersia analitului- dilutie electronica- tehnica bazata pe discriminarea unei zone- tehnica ce utilizeaza o camera de omogenizare (de gradient)-tehnica în care se foloseste o membrana de discriminareAceste metode de realizare a dilutiei analitului sunt prezentate în cele

ce urmeaza .

7

6.1 DISPERSIA ANALITULUI

Dilutia prin dispersie are loc în fiecare sistem FIA. Dispersia controlata este un proces foarte complex. Este definit ca fiind procesul dinamic si reproductibil de amestecare a probei injectate cu reactivul si/sau cu agentul purtator influentat de curgerea fluidului prin sistemul de tuburi. Aceasta tehnica este, fara îndoiala , cea mai simpla si mai precisa metoda de diluare.

Fortele active ce conduc dispersia probei injectate în flux sunt difuzia moleculara si cea prin convectie. De obicei efectele difuziei moleculare sunt neglijate. Convectia apare ca rezultat al diferentei de debit a fluidelor în diferite puncte ale axei radiale a tubului si a aparitiei fluxurilor secundare, create de fortele centrifuge, perpendiculare pe directia de curgere a fluxului principal.

Astfel dispersia poate fi de doua tipuri:a) dispersia radiala este determinata de profilul de curgere al fluxului determinând o

dilutie minima si totodata si latirea peak-ului.b) dispersie axiala ce apare de-a lungul fluxului de curgere si provoaca o dilutie mai

mare ducând la un peak mai latit decât la dispersia radiala ; predonima în tuburile liniare.Influenteaza în mod negativ analizele, zona unei probe injectate cu lungime de 1 cm

poate fi întins prin dispesie axiala pe o lungime de 1m.Trasaturile specifice proceselor de dispersie sunt reproductivitatea si controlarea lor prin

manipularea parametrilor de curgere si dimensiunilor geometrice ale tuburilor utilizate.Reproductivitatea dispersiei poate fi influentata de:- debitul fluidelor- volumul de proba injectat- diametrul interior al tuburilor- lungimea tuburilor- tipul de reactor utilizat-arhitectura interna a componentelor sistemului: valva de injectie, detectorii, conectorii. Cuantificarea proceselor de dispersie se face cu ajutorul coeficientului de dispersie (D)

definit ca fiind raportul dintre concentratia probei înainte de dispersie (C0) si concentratia dupa dispersie (Cmax), data de înaltimea peak-ului. Coeficientul de dispersie este echivalent cu factorul de dilutie al fluidului luat în considerare.

D= C0/Cmax= k0 ·h0/ k1 ·h1 ,unde:k0, k1-constante;h0- înaltimea peak-ului pentru proba nedispersata h1- înaltimea peak-ului pentru proba dispersata Dac semnalul este direct proportional cu concentratia, atunci k0=k1 si D poate fi

determinat direct din raportul inaltimilor peak-urilor. Lungimea tevii de curgere nu afecteaza semnificativ dispersia. În controlarea dispersiei

probei nu se recomanda utilizarea acestor factori În functie de valoarea coeficientului de dispersie, D, sistemele pot fi : :

a) sisteme cu dispersie înalta , D>10, caracterizate de: reactoare lungi;debite mici; volume mici de proba ,mai putin sensibile.

b) sisteme cu dispersie medie, D=3-10, caracterizate de: reactoare tubulare mai lungi; debitele cele mai scazute; volume mici de proba , sensibile.

c) sisteme cu dispersie joasa , D=1-3 reactoare tubulare scurte; tuburi cu diametre interioare mici; debit mediu;volume mari de proba.

6.2 DILUTIA ELECTRONICA

Dilutia electronica este o tehnica simpla si noua care se bazeaza tot pe dispersie. De fapt aceasta tehnica se bazeaza pe masurarea semnalului în anumite puncte de-a lungul pantei peak-

8

ului. Semnalul este masurat în mod normal în maxim (dat de vârful peak-ului)(t 1). Cu toate acestea si t2 i t3 ce reprezinta momente în care proba era mai diluata pot fi folosite în evaluarea informatiilor despre analit. = k1, i D poate fi determinata direct din raportul înaltimilor peak-urilor.

Desi aceasta metoda este simpla , din pacate este si cea mai putin precisa , cu erori inerente în masurarea pantei semnalului datorita rapiditaii si usurintei cu care vârful peak-ului îsi modifica pozitia.

6.3.TEHNICA BAZATA PE UTILIZAREA UNEI CAMERE DE AMESTECARE(DE GRADIENT)

Camera de amestecare este un dipozitiv simplu utilizat în dilutiile din FIA. Constructiv,este un bazin de amestecare, în general, cu o tija de amestecare si un dispozitiv de alimentare si respectiv de evacuare a fluxului agentului purtator. Volumul camerei este în general de 1 ml sau chiar mai putin. Proba este injectata (3) în flux (1), ajungand în camera de amestecare(4) unde proba este supusa unei dilutii proportionale cu volumul de agent purtator în care a fost introdus .Utilizând aceasta metoda se poate ajunge la un factor de dilutie de câteva sute, cu precizie buna .

6.4. MEMBRANA DE DISCRIMINARE (MSD)

Membranele de discriminare sunt folosite pentru dilutie dar si pentru alte operatii de procesare a probei cum ar fi: modificarea sau eliminarea unor compusi din proba , extractia cu solventi sau pentru concentrarea analitului. Sunt construite din doua canale, pentru cele doua fluxuri, separate de o membrana subtire. Unul dintre fluxuri este denumit flux donor si poate fi lichid sau chiar gazos, iar celalalt flux este flux acceptor. Fluxul donor (1) contine analitul (A) fiind format fie doar din proba propriu-zisa , fie din proba injectata si dispersata într-un agent purtator. Dac este aleasa o membrana corespunzatoare (2), când fluxul donor ce contine analitul trece prin dreptul membranei, o parte din analit va traversa membrana, în fluxul acceptor (3). În conditii bine stabilite, fractiunea ce traverseaza membrana ramâne constanta.

Fig.6

Principiul membranei de discriminareA- analitul; 1-traseul fluxului donor; 2- membrana; 3- traseul fluxului acceptor.

Tipuri de membrane:

- poroase - transportul de masa se produce prin difuzia analitului prin porii membranei.Sunt utilizate în general pentru anali i volatili (CO2, NH3, H2S, HCN)

- neporoase- pentru a avea loc trasferul de masa , analitul se dizolva în membrana si difuzeza pe partea fluxului acceptor. Pentru un transport eficient, din peretele membranei în fluxul acceptor, analitul trebuie sa aiba o solubilitate mai mare în fluxul acceptor decât în membrana sau sa fie transformata într-o specie chimica ce are aceast proprietate (NH3 este astfel transformat în NH4). Cea mai utilizata este cea de silicon ce nu reactioneaza cu speciile ionice.

- ionice - utilizat pentru specii ionice (H+, NH 4+)

9

Din punct de vedere constructiv, membranele de discriminare pot fi:

- plana , când membrana este cuprinsa între 2 placi- tubulara , când membrana de tip fibra este închisa într-un tubRata masei de analit transportat depinde în principal de grosimea peretelui membranei,

în general, în FIA se utilizeaz membrane subtiri (0,01-0,2mm).Factorul de dilutie obtinut prin aceasta metoda depinde de volumul probei injectate în

fluxul donor, grosimea membranei, dimensiunea canalelor membranei si de debitele de curgere a celor dou fluxuri.

7. CONCENTRAREA ANALITULUI

FIA este utilizat nu numai pentru diluarea unui analit ci si pentru concentrarea acestuia. Pentru acest lucru de folosesc aceleasi membrane ca si la dilutie dar cu anumita configurare, de exemplu, membrana tubulara instalata în partea opusa a celor doua orificii ale valvei de injectie sau minicoloane cu material, în interior, ce retine analitul .

Principul sistemului FIA utilizat pentru concentrarea unui analit;1-intrare reactiv; 2- intrare agentul putator; 3- traseul probei ce contine analitul; 4-

pompa ; 5- valva de injectie; 6- zona de amestecare; 7- detector; 8- membrana de discriminare tubulara ; 9, 10- eliminare reziduu; 11- bucla by-pass.

Fig.7

10

Fig.8

Principiul sistemului FIA utilizat pentru concentrarea analitului cu minicoloana1- intare agent purtator; 2- intrare proba cu analit; 3- valv de injec ie; 4- pompa ; 5-

minicoloana cu material, în interior, ce retine analitul; 6- detectorÎn partea opusa celor doua orificii ale valvei de injectie se instaleaza o bucla by-pass

unul dintre orificii fiind utilizat pentru intarea agentului purtator, iar cealalt pentru iesirea acestuia.

Concentrarea si analizele propriu-zise se desfsoara în doua etape, de colectare si de curgere. În etapa de colectare, valva este comutata pe pozitia care directioneaza fluxul de agent purtator prin bucla by-pass. Agentul purtator, în aceast etapa , stationeaza în tubul membranei de discriminare (8). Proba (3) ce contine analitul ce urmeaza a fi concentrat trece prin MSD, iar analitul , fie prin difuzie, fie pe baza proprietailor de permeabilitate, trece în peretele membranei pentru a ajunge în agentul purtator. Astfel are loc acumularea, respectiv,concentrarea analitului în agentul purtator. Dupa un anumit timp, necesar atingerii unei concentratii suficiente de analit în agentul purtator, valva este comutata în pozitia ce permite trecerea fluxului de agent purtator prin MSD. Fluxul va pune în miscare zona de solvent în care s-a concentrat analitul, ducând-o

11

spre detector .Procesul poate fi automat, daca se utilizeaza un sistem ce sa comute valve de injetie la

un anumit interval de timp. Minicoloana (5) este instalata pe valva de injectie (3), în porturi opuse. Initial, valva de injectie se afla într-o pozitie ce sa permita trecerea fluxului de proba (2) prin coloana , iar analitul este absobit de umplutura coloanei. Valva este apoi comutata în pozitia în care agentul purtator (1) va trece prin minicoloana si va pune în miscare analitul, spre detector (6).

8. ZONA DE AMESTECARE

Sistemul FIA utilizeaza un dispozitiv de amestecare a fluidelor ce favorizeaza difuzia radiala si reactiile dintre proba injectata si reactivi. Dispozitivul de amestecare este de obicei reprezentata de un tub cu structura de serpentina (reactoare tubulare). Daca se utilizeaza serpentine cu raza mica , apar fluxuri secundare care favorizeaza amestecarea radiala si diminueaza difuzia axiala . Din acest motiv se utilizeaza tuburi înnodate sau reactoare cu coloana granulata care determina o amestecare radiala superioara . Se pot folosi si agitatoare electromagnetice sau camere de amestecare, care duc la obtinerea unei amestecari radiale bune.

9. SISTEMUL DE DETECTIE

Sistemele FIA sunt utilizate de obicei pentru analize on-line. Detectorul sistemului are rolul de a “simti” schimbarile de absorbanta , fluorescenta , chemiluminiscenta , emisie sau absorbtie atomica , absorbtie în infrarosu, pH, potential de electrod, curent de difuzie, conductivitate electrica , turbiditate, masa etc.

Interfata detectorului are o influenta decisiva asupra performantelor sistemului.Complexitatea ei depinde de modul în care se efectueaza masurarea (solutie, plasma sau vacuum). Parametrii ca reproductibilitatea, acuratetea, sensitivitatea si selectivitatea sunt dependente de modul în care se realizeaza cuplarea. În general se poate utiliza orice detector apt pentru flux. Sistemul de detectie variaza de la simplu la complex.

Sistemele FIA pot fi cuplate, pentru detectie, cu :

-spectroscopia de masa (MS) utilizata pentru determinarea compozitiei calitative si cantitative a substantelor anorganice si organice, a amestecurilor organice complexe, determinarea compozitiei si structurii izotopice a substantelor, determinarea compozitiei si structurii de suprafa a corpurilor solide.

-spectroscopia de emisie atomica (AES) recunoscuta pentru analiza cantitativ si calitativa pentru multe dintre elemente, în special metale si semimetale; se bazeaza pe înregistrarea spectrelor de linii de emisie rezultate în urma excitatiei probei.

-spectroscopia de absorbtie atomica (AAS) de asemenea recunoscuta pentru analiza cantitativa si calitativa pentru multe dintre elemete, în special metale si semimetale cu folosire la scara larga pentru analiza cantitativa a urmelor diferitelor elemente; se bazeaza pe masurarea cantitaii de radiatie absorbita din radiatia incidenta de catre elementul analizat.

-spectroscopia moleculara Raman este folosita în special pentru caracterizarea legaturilor nepolare sau slab polare precum si pentru caracterizarea compusilor ciclici; este specifica oscilatiilor simetrice ale moleculei si presupune polarizarea acesteia.

-spectroscopia în infrarosu cu trasformanta Fourier utilizata pentru analiza cantitativ si calitativa a speciilor moleculare; se bazeaza pe studiul oscilatiilor si rotatiilor moleculare ca urmare a aportului de energie din infrarosu.

-cromatografia de lichide de înalta performana (HPLC) este folosit în separarea si identificarea cantitativa si calitativa a substantelor din amestecurile lichide.

-cromatografia de gaze (GC) prin care pot fi analizate toate amestecurile lichide, gaze

12

sau solide care pot fi trecute sau exista în faza gazoasa si care nu se descompun la încalzire în alte specii chimice; etc.

Spectroscopia este o denumire generica data unei clase de procedee si tehnici experimentale prin care se urmareste si se cuantifica efectul absorbtiei sau emisiei de energie de catre o proba supusa unei analize chimice calitative si/sau cantitative. Scopul spectroscopiei este acela ca dintr-un spectru se obtin informatii despre proba analizata . La analiza chimica calitativa se realizeaza corelarea lungimilor de unda a spectrelor obtinute cu spectrele etalon, iar la analiza chimica cantitativa se foloseste dependenta dintre intensitatea emisiilor spectrale specifice si concentratia elementelor sau substantelor din compusi sau amestecuri de compusi.

Clasificarea metodelor spectroscopice:1.spectroscopia atomica -de absorbtie (AAS) -de emisie (AES)-de fluorescenta (AFS)-electronica-Röntgen (XRS)2. spectroscopia moleculaza

-în ultraviolet- vizibil (UV-VIS)-în infrarosu (IR)-Raman-de fluorescenta -cu rezonanta de spin (NMR)-cu microunde3. spectroscopia de masa (MS)

4. spectroscopia Laser.

Legaturile matematice între cantitatea de radiatii electromagnetice emise, respectiv

absorbite si concentratie în cazul analizei spectroscopice cantitative sunt stabilite de Legea Lambert- Beer:

I=I 0 ek b cîn care:I- intensitatea fasciculului trecut prin proba k- coeficientul de absorbtie dependent de frecven tab- grosimea stratului absorbantc- concentratia atomilor liberi

Analiza chimica calitativa se bazeaza pe compararea spectrelor de absorbtie ale substantelor sau materialelor cu spectre cunoscute.

Fotometria si spectrofotometria masoara instrumental lumina transmisa de o solutie colorata lucrând cu o sursa de lumina monocromatica . Când lumina incidenta este filtrata , prin filtre optice, având un spectru mai larg, avem de a face cu o fotometrie iar când domeniul filtrat este mai îngust (utilizând monocromatoare) vorbim de spectrofotometrie. În ultima varianta , este posibila fixarea mai precisa a lungimii de unda la care se lucreaza . Cu ambele variante se poate chiar trasa un spectru de absorbtie, adica o curba , obtinuta prin masurarea semnalului în functie de lungimea de unda a radiatiei incidente. În literatura de specialitate uneori se foloseste pentru ambele metode si denumirea de metoda colorimetrica (sau chiar spectrocolorimetric ),

13

ceea ce uneori poate crea confuzii. În domeniul UV, ochiul omenesc nepercepând lumina, se utilizeaza doar spectrofotometria.

Întrucât principiile sunt identice iar aparatele sunt în multe privinte similare în cele doua domenii, în ultimul timp, în afara de aparatele dedicate domeniului VIS sau a celor pentru UV, de multe ori se utilizeaza un singur instrument pentru ambele intervale de lungimi de unda , UV-VIS.

Fig.9Parti componente ale unui spectrofotometru de absorbtie1- sursa de radiatie; 2- fanta; 3- monocromatorul; 3- cuveta cu proba ; 5- detectorul; 6-

amplificatorul; 7-sistemul de înregistrare.

Sursa emite un fascicol de radiatie ce trece prin fanta (2) si cade pe monocromator(3).Radia ia incident , monocromatic , realizat cu ajutorul monocromatorului (3), trece prin

cuveta cu proba , (4),unde intensitatea scade fata de situatia în care în locul probei de analizat se pune o a-numit proba martor (sau prob oarba ). Apoi fasciculul cade pe detector (5), unde semnalul optic este transformat în semnal electric. Semnalul rezultat, dupa o amplificare, poate fi în final masurat si înregistrat. Înregistrat nu mai înseamna astazi întotdeauna preluarea semnalului cu un înregistrator ci mai degraba introducerea acestuia în memoria unui calculator urmând de regula prelucrarea automata a datelor.

Tabelul 1. Componentele unui spectrofotometruDomeniulspectral

Sursa (lampa, bec) Monocromator(prisma)

Cuva Detector

UV Cu H sau D Cuart/NaCl,retea dens Cuart Celula fotoelectrica/ fotomultiplicator

VIS Filament:W Sticla/cuart retea meddie

Sticla /cuart

Celula fotoelectrica/ fotomultiplicator

Analiza chimica cromatografica este un domeniu mai recent al analizei instrumentale care include mai multe metode de separare si totodata de analiza a componentilor amestecului din proba . Într-un sistem cromatografic exista o faza mobila si una stationara .În faza mobila se introduce substanta de analizat rezultând un nou amestec ce va fi separat pe baza afinittilor fizico-chimice diferite ale componentelor din amestec fata de faza stationara. Datorita acestei afinitti componentele amestecului ies pe rând din coloana cromatografica si ajung la detector.

14

Detectorul din sistem este capabil sa dea un semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de component în faza mobila . În consecinta , dispozitivul, "marcheaza " trecerea fiecareia din substantele ce formeaza initial proba. Se distinge cromatografia de lichide (LC) când faza mobila este un lichid, cromatografia de gaze (GC) când aceasta este un gaz sau cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobila este un lichid aflat peste temperatura critica . În cadrul cromatografiei de lichide se mai face distinctie între cromatografia pe coloana deschisa si cea pe coloana închisa .

Din punct de vedere a analizei calitative, cromatografia identifica natura substantelor prin timpul de retentie ce se defineste ca fiind timpul ce trece de la injectie pâna la sosirea componentului analizat. Analiza cantitativa se bazeaza pe corelarea concentratiei compusului cu înaltimea peak-cului sau suprafata de sub curba .

Un domeniu larg de utilizari ca sisteme de detectie în FIA îl constituie detectoarele din cromatografia de lichide, si anume:

-de absorbtie în ultraviolet-sir de fotodiode (diode - Array)-de fluorescenta-refractometrici-electrochimic

Detectoare de absorbtie în ultraviolet.

Aceste detectoare sunt de natura semiconductoare si sunt cei mai folositi senzori în cromatografia de lichide datorita faptului ca foarte multe molecule organice absorb în ultraviolet, iar detectorul este fiabil si ieftin.

Detectorul de UV este format dintr-o celul cilindrica (5) cu capacitate de 1µl-10µl care este intersectat de coloana cu eluent. Razele UV (1) sunt aranjate astfel încât sa treaca prin celula cu proba de analizat (5) si apoi sa cada pe fotoelement (6). Semnalul de la fotoelement ajunge la amplificator (7) (acesta mareste intensitatea semnalului) si apoi la sistemul de achizitie, prelucrare si afisare a datelor obtinute (8); rezultatul este o cromatograma (9) ale carui picuri vor oferi informatii de natura calitativa si cantitativa despre substantele din solutia analizata.

Selectivitatea acestui detector este data de faptul ca pot fi detectate calitativ si analizate cantitativ numai molecule ce absorb în domeniul ultraviolet. Asemenea substante sunt alchene,hidrocarburi aromatice, sau compusi cu legaturi multiple între C, O, sau S.

Fig10

Principiul de func ionare al detectorului de UV1- raze UV; 2- tub capilar de intare a substantei de la coloana cromatografica ; 3- tub

capilar de iesire a substantei; 4- geam de cuart ; 5- tub capilar prin care circul substanta de analizat; 6- detector(fotomultiplicator); 7- amplificator; 8- sistem de achizitie, prelucrare si afisare a datelor; 9- cuva detectorului.

15

Detectoare sir de fotodiode (Diode - Array)

Radiatia policromatica (1), trimisa printr- o celula speciala ermetica (5) prin care circula faza mobila (2)ce iese din coloana cromatografica , cade pe o oglinda de reflectie totala si de aici pe o retea de difractie (6) unde este descompusa dupa componentele spectrale, acestea fiind reflectate pe detectorul sir de fotodiode (7). Dioda Array poate contine sute de diode, iar semnalul de la fiecare dioda este preluata si amplificata de catre amplicator (8) ca la sfârsit sa ajunga la sistemul de preluare, prelucrare si afisare a datelor (9) care de obicei este un calculator care stocheaza datele pe hard disc. Marele avantaj al detectorului cu sir de fotodiode consta în faptul ca spectrul este obtinut instantaneu si în mod continuu neexistând pericolul ca unii compusi de concentratie mica sa nu fie surprinsi de detector.

Fig.11

Principiul de func ionare al detectorului ir de fotodiode1- raze în ultraviolet; 2- tub de intrare a substantei ce vine

de la coloana cromatografica ; 3- tub capilar de iesire a substantei; 4- geam de cuart ; 5- tub capilar prin care circulasubstanta de analizat; 6- retea de difractie; 7- dioda Array; 8- amplificator; 9- sistem de preluare,achizitie si afisare a datelor.

16

Detectoare de fluorescenta

La iluminare cu lumina ultravioleta unele substante sunt în masura sa absoarba radiatie ultravioleta si ca urmare a acestei absorbtii sa emita lumina vizibila pe o lungime de unda mai mare decât cea absorbita .

Dac emisia de lumina are loc imediat dupa iradiere fenomenul poarta denumirea de fluorescenta , iar daca emisia are loc cu întârziere se vorbeste de fosforescenta . Raportul între energia luminii emise si energia radiatiei absorbite este subunitara si pentru majoritatea substantelor este atât de mica încât nu poate fi valorificata instrumental. Abia pentru substantele la care valoarea acestui raport se situeaza la valori intre 0,1 i 1 este posibila detectia prin fluorescenta . Exista substante care prezinta în mod natural fluorescenta . Asemenea substante au o structura ciclica conjugata asa cum prezinta de exemplu hidrocarburile aromatice policiclice. Multe substante ce nu prezinta în mod natural fluorescenta ,tratate cu reactivi corespunzatori pot fi transformate în derivate fluorescente.

Fig.12

Principiul de functionare al detectorului de fluorescenta1- sursa de radiatie; 2- fanta; 3- filtru; 4- lentila ; 5- tub capilar pentru

substanta ce vine de la coloana; 6-cuva cu substanta de analizat; 7- pereti de cuart ; 8- unghi de 90 grade; 9- tub capilar pentru substanta ce iese din cuva; 10- lentila ; 11- filtru; 12- fanta ; 13- detector de fluorescenta ; 14- amplificator; 15- sistem de preluare, prelucrare si afisare a datelor.

Radiatia emisa de o sursa de radiatie de deuteriu (1) este trecuta printr-un filtru (3) si cade pe celula cromatografica speciala (7) cu solutia de analizat (6) unde genereaza radiatie de fluorescenta pe toate directiile, masurarea acesteia se face însa la 900 fata de radiatia incidenta ea fiind trecut printr-un filtru (11) înainte de a cadea pe detector (13). Detectoarele de fluorescenta au si o selectivitate, foarte mare, deosebit de utila în analiza urmelor, data de faptul ca prin filtre adecvate poate fi variata atît lungimea de unda incidenta cît si lungimea de unda detectata dupa generarea fluorescentei.

Detectoare refractometrice

17

Acest tip de detector se bazeaza pe masurarea indicelui de refractie a eluentului ce soseste din coloana, reprezentînd diferenta între indicele de refractie a substantei analizate si indicele de refractie a fazei mobile pure. Detectoarele refractometrice au marele avantaj de a putea fi folosite la aproape toate substantele ,sînt fiabile iar indicatiile lor nu depind de viteza de curgere în schimb indicatia este influentata de variatii de temperatura .Detectoarele refractometrice au o sensibilitate mai mica decît detectoarele de ultraviolete. Daca se doreste o sensibilitate inalta este necesara termostatarea aparatului si un control foarte bun al compozitiei fazei mobile.

Fig.13

Principiul de func ionare al unui detector refractometric 1- radiatia luminoasa ; 2- tub capilar de intrare pentru amestecul de

substante; 3- tub capilar de intrare pentru solventul pur; 4- perete sticla ; 5- oglinda semitransparenta ; 6, 6’- fotocelula ; 7- amplificator; 8- surub reglator; 9- sistem înregistrator; C-cuva refractometrica ; M- sistem ce regleaza detectorul în functie de unghiul sub care cad razele.

Radiatia luminoasa trece printr-o celula paralelipipedica speciala (C) cu doua compartimente desptite de un geam de sticla (4). Unul din compartimente este pentru proba de analizat si unul pentru solutia etalon. Dupa traversarea celulei radiatia luminoasa cade pe o oglinda semitransparenta (5) si este desptita în doua fascicule, unul cade pe fotocelula (6) iar celalalt pe fotocelula (6’). Atunci cînd indicele de refractie se modifica ,se modifica unghiul de incidenta al radiatiei ce cade pe oglinda (5) si ca atare se modifica si cantittile de radiatie ce cad pe cele doua fotocelule (6) si (6’), si proportional si fotocurentii celor doua celule. Fotocurentii sînt trecuti într-un amplificator diferential (7) ce da un semnal de eroare proportional cu modificarea indicelui de refractie. Semnalul de eroare comanda un servomotor (M) care roteste oglinda semitransparenta (5) pîna cînd semnalul de eroare are valoarea zero. Oglinda semitransparenta este legata de un ac înregistrator astfel încît deplasarea acesteia este înregistrat în timp sub forma unei cromatograme ce are pe ordonata indicele de refractie iar pe abscisa timpul.

Detectoare electrochimice

Aceste detectoare exista într-o varietate mare si se bazeaza pe principii electroanalitice diferite precum:

- amperometrie;- coulometrie;- conductometrie.

18

Detectoarele electrochimice sunt simple, au limite de detectie scazute si aplicabilitate la un numar extrem de mare de substante. Pentru a putea fi detectabile prin amperometrie si coulometrie substantele trebuie sa fie usor oxidabile, respectiv usor reductibile. Pentru a putea fi detectate pe cale conductometrica substantele trebuie sa existe sub forma ionica

Din punct de vedere constructiv detectoarele amperometrice sau coulometrice sunt relativ simple. Detectorul nu este altceva decât o celul electrochimica clasica cu trei electrozi adaptat pentru conditii de masurare sub presiune. Folosirea detectiei amperometrice sau coulometrice presupune cunoasterea exacta a potentialului unde specia respectiva are activitate maxima . În acest sens de un real folos sunt curbele curent-tensiune care se pot trasa pentru diferitele specii ionice cu celule electrochimice cu trei electrozi.

Daca se aplica unei asemenea celule tensiuni progresiv crescatoare atunci prin înregistrarea parametrilor curent-tensiune între electrodul de lucru (2)si electrodul de referinta (6) se obtine o curba specifica ce da infomatii valoroase despre activitatea electrochimica a speciei respective.

Fig.14

Principiul de func ionare amperometric al detectorului electrochimic

1- tub capilar pentru substantele ce vin de la coloana cromatografica ; 2- electrodul de lucru; 3- electrodul auxiliar; 4- celula electrochimica ; 5- tub capilar prin care circul substanta de analizat; 6- electrodul de referinta ; 7- tub capilar pentru substanta ce iese din tubul capilar; 8- amplificator; 9- sistem de achizitie, prelucrare si afisare a datelor.

În figura urmatoare este reprezentata o asemenea curba pentru trei substante diferite X,Y,Z. Daca se pleaca din pozitia (O) de curent zero si se aplica o tensiune negativa crescatoare în pozitia (E1) se instaleaza un curent la care specia (Z) este redusa . Din palierul crescator al curbei electrocinetice se observa cresteri mari mari de curent la cresteri mici de potential. Acest lucru se manifesta pân în zona curentului limit -corespunzator tensiunii (E2).

Dupa aceasta tensiune la cresteri relativ mari de potential cresterea de curent este nesemnificativa . Situatia se schimba dupa depasirea potentialului (E3) când din nou la variatii mici de potential corespund cresteri mari de intensitate, în acest caz este vorba însa de descarcarea (reducerea) altei substante respectiv solventul.

Acelasi rationament se face pentru substantele (X) i (Y) care sunt oxidate atunci când potentialul se deplaseaza din punctul (O) spre dreapta ceea ce corespunde unui potential pozitiv. Substanta (X) este oxidata mai usor

19

(oxidarea începe la E4) decât substanta (Y) (oxidarea începe la E5), oxidarea solventului necesita potentilaul cel mai ridicat si începe la (E6). Importanta interpretarii acestei curbe consta în posibilitatea alegerii potentialului de descarcare care da sensibilitatea cea mai ridicata pentru anumita specie ionica moleculara prezenta într-un amestec. Asa cum se observa din figura daca potentialul celulei cromatografice ar fi cel corespunzator pozitiei (O) nu ar putea fi identificat nici una din cele trei substante deoarece peak-ul de pe cromatogram ar avea valoarea zero. La stânga sau la dreapta acestui punct cele trei substante pot fi identificate cu sensibilitati diferite în functie de valoarea potentialului aplicat celulei. Situatia alegerii potentialului de descarcare pentru obtinerea unei sensibilitati maxime este analog cu modificarea lungimii de unda în cromatografia cu detectoare UV pentru ob inerea sensibilittii maxime pentru o anumita specie. Linia punctata din figura reprezinta curba curent-tensiune reziduala corespunzatoare solventului atunci când ar lipsi cele trei substante (X),(Y) i (Z).

Curba cineticaFig.15

20

Fig.16Principiul de functionare al detectorului conductometric1- generator de înalta frecventa ; 2- celula conductometrica ; 3-

electrozi de platina :; 4-tub de intrare pentru sustanta de analizat; 5-tub capilar prin care iese substanta din celula conductometrica ; 6- amplificator; 7-sistem de achizitie, prelucrare si afisare a datelor.

Detectorii conductometrici

Sunt folositi în special pentru solutiile ionice unde substantele disociaza complet. Detectorii conductometrici masoara conductivitatea fazei mobile.

Este constituit din doi electrozi (3) situati în coloana (2) cu eluent si o rezistenta situata între cei doi. Celula conductometrica este etansa , iar cei doi electrozi sunt fixati si dimensionati din fabrica . Rezistenta este masurata cu ajutorul circuitului electric la care este legat.

III.PROCESUL CHIMIC

21

Reactiile chimice joaca un rol important în cele mai multe metodologii FIA. Scopul acestora este de a converti analitul în specii detectabile compatibile cu detectorul utilizat.Obtinerea reactiilor chimice ideale este adesea o provocare si de cele mai multe ori o sarcina descurajatoare Cu toate acestea, acest lucru devine mai usor datorita resurselor bogate de metode analitice colorimetrice din literatura de specialitate, dezvoltate cu decenii în urma când analizele colorimetrice au fost utilizate pe scara larga . În majoritatea cazurilor aceste metode pot fi adaptate pentru FIA. Acesta este unul dintre motivele pentru care metodele colorimetrice sunt cel mai des utilizate în FIA. De asemenea au fost aplicate si alte tehnici manuale, cum ar fi titrarea.

De obicei configurarea sistemului este modificat pentru a îndeplini cerintele particulare ale metodei sau detectorului utilizat însa se au în vedere si influentele asupra reactiilor chimice ce ar trebui sa aiba loc.

Schimbarea debitului total poate afecta semnalul obtinut prin modificarea timpului de reactie. Cresterea debitului total determina scaderea timpului de reactie, iar daca timpul de reactie este redus formarea amestecului proba -reactiv este redus iar semnalul obtinut are înaltime mai mica . Totodata , prin modificarea ratei de formare a amestecului se modifica cinetica reactiei chimice.

Modificarea lungimii tevii duce la modificarea evidenta a semnalului obtinut deoarece determina cresterea timpului de reactie. Schimbarea diametrului interior poate sau nu sa afecteze semnalul. Daca schimbarile sunt mici di=0,3-0,5mm, cu lungimea l<1m, timpul de reactie nu se modific substantial si nici semnalul nu este semnificativ diferit. Daca modificarile sunt mari di=0,3-0,9mm combinate cu cresterea lungimii tevii, timpul de reactie creste semnificativ. De aceea, daca conditiile stricte stabilite nu sunt atinse, semnalul obtinut va fi amplificat.

În mod evident, schimbarile volumului probei vor afecta semnalul observat, prin modificarea lungimii zonei probei în flux. În concluzie, cele mai multe modificari ale semnalului se datoreaza caracteristicilor dispersiei si nu efectelor cineticii chimice. Cinetica reactiilor chimice poate fi utilizata în modificarea semnalului obtinut prin modificarea timpului de retentie si prin varierea debitului probei si reactivului. Pentru a creste timpul de reactie se scade debitul sau se mareste lungimea tevii. Orice modificare a sistemului ce determina cresterea timpului de reactie si nu modifica semnificativ procesul de dispersie este cea mai buna pentru cinetica chimica .

VI.DIFERITE MODURI DE CONFIGURARE A SISTEMULUI

Sistemele pentru analize prin injectie în flux pot fi configurate într-o varietate de moduri diferite, în functie de aplicatia dorita . Ele pot fi folosite pentru determinarea unor analiti multipli fie simultan, fie succesiv.

a) Sisteme cu injectia normala

Parti componente ale sistemului FIA cu injectie simpla: 1- tub capilar cu lichidul purtator (fluxul); 2- tub capilar cu reactiv; 3- injectare proba ; 4- pompa ; 5- zona de amestecare; 6- detectorul; 7- evacuare reziduu; 8- informatiile obtinute.

b) Sisteme cu injectie de reactiv (FIA invers )

Este utilizat în situatii în care este necesara economisirea reactivului

22

introdus sau când cantitatea lichidului analizat este mare (de exemplu:analiza apei oceanelor, monitorizarea compozitiei apei reziduale etc.)

Parti componente ale sistemului FIA cu injectie de reactiv :1- tub capilar cu lichidul purtator (fluxul); 2- injectare reactiv; 3- tub capilar cu proba; 4- pompa ; 5- zona de amestecare; 6- detectorul; 7-evacuare reziduu; 8- informatiile obtinute.

Const în injectia reactivului (2) în fluxul continuu ce contine lichidul purtator (1) si proba(3) propulsat de catre pompa (4) prin conducte. Astfel se economisesc reactivii si totodata se îmbunatateste sensibilitatea analitica.

c) Sistem cu injectie periodica “stop-flow”

Poate fi utilizat pentru: a mari sensitivitatea analizelor bazate pe reactii lente; a separa (deosebi) semnalul analitului de zgomotul de fond; obtinerea de informatii despre cinetica , în unele reactii, prin utilizarea pick-ului obtinut în timp ce pompa este oprita (exemplu: determinarea activitaii enzimelor).

Parti componente ale sistemului FIA cu injectie periodica 1- tub capilar cu lichidul purtator (fluxul); 2- tub capilar cu reactiv; 3- injectare proba ; 4- pompa ; 5- zona de amestecare; 6- detectorul; 7-evacuare reziduu; 8- informariile obtinute; T- temporizator pentru pompa

Specific acestui sistem este faptul ca pompa (4) este oprita pentru o anumita perioada de timp (T), la un timp bine stabilit, dupa injectie pentru a permite desfaurarea reactiilor dintre proba si reactiv .Peak-ul rezultat este format dintr-un peak continuu crescator suprapus pe peak-ul obtinut înainte de initializarea perioadei de oprire.

d) Sistemul FIA cu gradient multiplu (titrare)

Necesita o dispersie mare si acest lucru poate fi obtinut prin utilizarea unei camere de amestecare . De exemplu, când se doreste titrarea unui acid se va utiliza o baza ca agent purtator sau ca reactiv . camera de amestecare va duce la modificarea pH-ului atât cât este necesar, de-a lungul sistemului, astfel încât dispersia sa fie medie. Timpul necesar probelor pentru o reactie completa si pentru a traversa sistemul depinde de concentratia probei dar si de cea a agentului purtttor sau a reactivului. Acest timp de reactie ( t), care reprezinta timpul scurs între modificarile consecutive de culoare ale unui indicator adaugat fie în solutia bazica utilizata ca agent purtator, fie adaugat odata cu reactivul, este determinat prin masurarea latimii peakului la jumatatea înaltimii lui.

Parti componente ale sistemului FIA cu gradient multiplu : 1- tub capilar cu lichidul purtator (fluxul); 2- tub capilar cu reactiv; 3- injectare proba ; 4- pompa ; 5- zona de amestecare; 6- detectorul; 7- evacuare reziduu; 8- informatiile obtinute; 9- camera de amestecare.

e) Sistemul FIA ce utilizeaza extractia cu solventi

Acest sistem este utilizat în special atunci când FIA este conbinat cu AAS (spectroscopia de absorbtie atomica ) si în analizele produselor farmaceutice si a bauturilor.

Parti componente ale sistemului FIA ce utilizeazs extractia cu solventi 1- tub capilar cu lichidul purtator (fluxul); 2- tub capilar cu faza organica ; 2’- dispozitiv de segmentare a fazei organice; 2’’- dispozitiv de separare a fazelor; 3- injectare proba ; 4- pompa ; 5- serpentina de extractie; 6- detectorul; 7, 7’-

23

evacuare reziduu; 8- informatiile obtinute.Proba saturata cu apa (3) ce contine analitul ce urmeaza a fi extras este

injectat în fluxul agentului purtator (1). Faza organica (2) este adaugata în segmentator (2’). Se produce un flux segmentat de faz organica - solutie apoasa ce va trece prin serpentina/ bobina de extractie (5).

Transferul de masa între cele doua faze are o eficienta de 80-99%. Fluxul segmentat este separat de catre separatorul de faze (2’’) situat înaintea detectorului în faza organica pura si faza ce contine un amestec de apa si solutie organica.

f) Sistemul FIA cu dispozitiv de separare a fazelor inclus

Se bazeaza pe difuzia selectiva sau trasportul unui analit sau specii de la un flux donor printr-o membrana într-un flux acceptor care ajunge la detector.

De exemplu, gazele dizolvate pot fi separate prin difuzia lor printr-o membrana hidrofoba sau specii cu masa moleculara mare sau mica pot fi separate prin utilizarea unei membrane pentru dializa . Pentru separarea fazelor poate fi utilizata si o membrana de filtrare, pentru a separa particulele si fazele dizolvate în probe eterogene.

Parti componente ale sistemului FIA cu dispozitiv de separare a fazelor inclus (difuzia unui gaz, dializa , filtrarea fluxului etc.):1- tub capilar cu lichidul purtator (fluxul); 2- tub capilar cu reactiv; 3- injectare proba ; 4- pompa ; 5dispozitiv de separare a fazelor; 6- detectorul; 7, 7’-evacuare reziduu; 8- informatiile obtinute.

g) Sistemul FIA legat în linie cu un reactor cu umplutura sau o coloana de separare

Reactorul cu umplutura (9) poate fi utilizat ca mediu de imobilizare a enzimelor sau anticorpilor sau pentru separarea sau concentrarea analitului din proba daca faza solida este mediu cromatografic. Avantajele utilizarii enzimelor în forma imobilizata sunt reducerea consumului de enzime, o potentiala activitate mai buna , inhibari reduse si o longevitate mai mare. Se pot obtine separari rapide în determinari cu analiti multipli, concentrarea analitului si îmbuntirea selectivitaii si prin utilizarea unui mediu cromatografic ca umplutura .

Parti componente ale sistemului FIA legat în linie cu un reactor cu umplutura (1 peak) sau o coloana de separare (2 peak-uri) 1- tub capilar cu lichidul purtator (fluxul); 2- tub capilar cu reactiv; 3- injectare proba ; 4- pompa ; 5- zona de amestecare; 6- detectorul; 7- evacuare reziduu; 8- informatiile obtinute; 9- reactor cu umplutura sau coloana de separare.

h) Sistemul FIA cu coloana de concentrare

Concentrarea analitului se poate obtine prin trecerea unui volum bine cunoscut de proba printr-o coloana cromatografica (9), ce este o bucla în sistemul de injectie.

Avantajele sistemului sunt: concentrarea analitului, separarea interferentelor si utilizarea doar a unei calibrari standard.

Parti componente a sistemului FIA cu coloana de concentrare 1- tub capilar cu lichidul purtator (fluxul); 2- tub capilar cu reactiv; 3- injectare proba ; 4- pompa ; 5- zona de amestecare; 6- detectorul; 7- evacuare reziduu; 8- informatiile obtinute; 9- coloana de concentrare.

24

i) Sistemul FIA cu reactor în care se produc modificari ale probei (termice, fotochimice,electrochimice)

În acest reactor, proba poate fi supusa unei descompuneri termice sau fotochimice, sau unei oxidari sau reducere electrochimica . Un fotoreactor simplu dar eficient poate fi construit prin infasurarea tubului de curgere din teflon în jurul unei lampi UV de putere mica . Acest sistem poate fi folosit pentru înregistrarea modificarilor fotochimice ale unui analit organic atunci cînd este utilizat un detector de fluorescenta , sau pentru oxidarile rapide ale fosforului organic, carbonului sau azotului din apa .

Parti componente ale sistemului FIA cu reactor în care se produc modificari ale probei 1- tub capilar cu lichidul purtator (fluxul); 2- tub capilar cu reactiv; 3- injectare proba ; 4- pompa ; 5- reactor; 6- detectorul; 7- evacuare reziduul; 8- informatiile obtinute;

i) SistemulFIA cu detectie multipla în serie

Caracteristica este utilizarea mai multor detectoare legate în serie.Parti componente ale sistemului FIA cu detectie multipla 1- tub capilar

cu lichidul purtator (fluxul); 2- tub capilar cu reactiv; 3- injectare proba ; 4- pompa ; 5- zona de amestecare; 6, 6’, 6’’- detector; 7-evacuare reziduul; 8- informatiile obtinute;

j) Sistemul FIA cu sistem de divizare si un singur detector

În acest sistem, proba (3) este despartita imediat dupa injectarea în agentul purtator (1), volumele de proba trecînd prin serpentine (5, 5’) cu timpi de retinere diferiti si recombinati inainte de detector (exista un singur detector comun (6)). Acest sistem este utilizat atunci cand detectia a doi analiti se bazeaza pe diferenta dintre timpii de formare a produsilor de reactie.

Parti componente ale sistemului FIA cu sistem de divizare si un singur detector 1- tub capilar cu lichidul purtator (fluxul); 2- tub capilar cu reactiv; 3- injectare proba ; 4- pompa ; 5- sistem de divizare, serpentine de reactie; 6- detectorul; 7-evacuare reziduul; 8- informatiile obtinute.

Într-o alt varianta , dupa despartire, fluxurile paralele de proba nu mai sunt unite, fiecare segment din sistem având propriul detector.

l) Sistemul FIA cu injectie multipla

Detectia multipla a analitilor poate fi obtinuta si prin utilizarea tehnicii de fuzionare a zonelor. În aceasta tehnica se utilizeaza fie un injector dublu, fie un injector la care bucla de injectie poate fi umplut pe jumatate cu proba si cealalta jumatate completata cu un alt reactiv care are rolul de a introduce o zona de reactiv ce va fuziona cu zona probei. Astfel, compozitia chimica a zonei injectate de-a lungul sistemului este diferit . Prin alegerea corecta a reactivilor si a conditiilor hidrodinamice, se pot obtine peak-uri pentru doi sau mai multi analiti din proba.

Parti componente ale sistemului FIA cu injectie multipla:1- tub capilar cu lichidul purtator (fluxul); 2- tub capilar cu reactiv; 2’- injectare reactiv;3- injectare proba ; 4 - pompa ; 5- zona de amestecare; 6- detectorul; 7-evacuare reziduul; 8- informatiile obtinute.

25

V. AVANTAJELE SI DEZAVANTAJELE TEHNICII

CARACTERISTICILE TEHNICII

Metodele FIA sunt caracterizate de urmatoarele avantaje:

-consum mic- sunt necesare cantitati mici de proba (10-50 l) si de reactivi

-timpul necesar determinarilor este redus datorita puterii mari de tranzit

-timp scurt de reactie-se trece cu usurinta de la o analiza la alta, tuburile fiind

usor de ansamblat-dezansamblat-reproductibilitate datelor-rata de trasfer mica -flexibilitate mare în ce priveste probele-mai usoara datorita aautomatizarii

În urmatorul tabelul sunt prezentate caracteristicile de productivitate ale metodei FIA.

Caracteristici de productivitate

timp de pornire ~5 minute

timp de analiza 20-60 secundetimp de tranzit (numarul de

probe)60-120 probe/ora

spectru de lucru (masa) parti per trilion pâna la per suta

rezolutie nu exista contact între probegama dinamica tipic 2-3 zecimaletimp de oprire ~5 minute

timp de schimbare a metodei ~10 minutedilutia automata probele sunt diluate automat

farainterventia operatorului

controlul calitaii datelor în timp real

Automatizarea sistemului FIA a adus metodei cateva avantaje, dar si dezavantaje, prezentate în tabelul urmator.

26

Contributiile automatizarii

avantajele automatizarii

economice:reducerea numarului personalului;

reducerea pierderilor;viteza

precizie, se înlatura erorile umane

dezavantajele automatizariicost mare la achizitie

necesita reglare si calibrareinflexibilitate

Probabil cel mai important avantaj al tehnicii FIA este buna reproductibilitate a rezultatelor obtinute datorita faptului ca sistemul poate fi reglat fara dificultati mari si cu costuri mici de investitie, intretinere.

Aceste avantaje au condus la o dezvoltare extraordinara a tehnicii FIA.

COMPARATIE FIA-HPLC-SIA

Se considera ca în ceea ce priveste comparatia între FIA si HPLC este nefondata deoarece similaritatile între cele doua tehnici sunt putine.

În primul rând cele doua tehnici au obiective diferite, FIA este utilizata pentru a creea semnale detectabile doar pentru o specie chimica din proba iar HPLC pentru a separa si detecta cativa compusi ai probei.

Sistemele functioneaza cu presiuni diferite: FIA necesita presiuni mici (7psi, 1psi=0,068atm) ce asigura reproductibilitatea si dispersia controlata a probei, iar HPLC necesita presiuni înalte (1000psi) pentru a împinge proba prin coloana .

Ambele metode utilizeaza injectia probei dar HPLC este considerata o tehnica de separare pe când FIA este incapabil de separari de mare rezolutie.

În ce priveste comparatia dintre FIA si SIA se considera a fi una fondata . Diferenta operationala fundamentala dintre cele doua tipuri de sisteme este segmentarea. SIA este în mod normal utilizata în conditii chimice stricte pe când în FIA aceste conditii nu sunt necesare datorita reproductibilitatii si dispersiei controlate. Sistemul SIA necesita pentru setare timp îndelungat si efort.

Parametrii tehnicilor de analiza

Parametru FIA HPLC SIAmodul de introducere

al probeiinjectie injectie aspiratie

volumul μl μl mlfluxul analitic nesegmentat nesegmentat segmentat

diametrul interior al conductelor

<1 mm <1 mm 1,2mm

defazaj nu exista nu exista semnificativa

27

trasformarea datelor integrare integrare întimeconditii de amestecare laminar laminar turbulent

Parametrii tehnicilor de analiza

parametri FIA SIAtimp de pornire 3-5 minute 30 minutetimp de analiza 30-60 secunde 5-20 minute

limite de detectie <1 ppb 1 ppbpauza între probe Da Nunecesitatea bulelor Nu Da

timp de oprire 2-5 minute 10-40 minutetimp de schimbare a metodei 10 minute 60-80 minute

controlul calittii datelor Da Nudilutia automata Da Nu

necesitatea de tratare a agentului purtator dupa analiza

Nu Da

utilizare si pentru complexe chimice Da Da

VI.DOMENII DE APLICARE

Datorita diversitaii probelor cu care laborantii si cercetatorii vin în contact, dar si metodologiilor specifice cerute de catre organismele de reglementare, metodele FIA sunt usor de adaptat, cu aplicatii în:

-industrie-medicina -mediu-metalurgie-agricultura -geologie-farmacie-industria alimentara -biotehnologiiAnalizele prin injectie în flux au fost adoptate pe scara larga de catre

cercetatori si se bucura de o acceptare rapida în industrie, ca modalitate rapida de analiza a apei potabile, a apelor reziduale, reziduurilor, probelor biochimice, medicamentelor, alimentelor, bauturilor, produselor agricole. Pâna în prezent, tehnica FIA a fost utilizata cu succes si în monitorizarea on-line a unor compusi cum ar fi: glucoza, fructoza, lactoza, maltoza, etanol, amoniac, fosfat, biomasa si activitatea enzimatica în diferite procese de fermentatie. FIA a fost de asemea utilizata pentru monitorizarea continu sau semicontinu a substantelor din apa marilor(fosfati, nitrati, amoniac, magneziu, fier, aluminiu etc.).

În timpul existentei sale, tehnica FIA a devenit o importanta metoda instrumentala cu contributii substantiale în domeniul cercetarilor farmaceutice, în special a drogurilor.Caracteristicile tehnicii au fost asociate cu necesitatea determinarii unor compusi dintr-un complex si a urmelor unor substante. Diversitatea sistemelor de detectie ce pot fi utilizate rezolva majoritatea restrictiilor ce apar în determinarile din domeniul farmaceutic. Problema care restrictiona

28

aplicarea metodei pentru determinarile selective a substantelor cu sensitivitate mare a fost rezolvata prin utilizarea unor detectori de înalta selectivitate, de exemplu: determinarea acizilor nucleici prin oxidarea guaninei cu un electrod de grafit, determinarea paracetamolului utilizând spectroscopia FTIR. Exemple de aplicatii:

-determinarea codeinei din preparatele farmaceutice-determinarea proteinelor-determinarea creatinei si izoprenului-determinarea penicilinei-determinarea drogurilor cu structura fenolica

În ce priveste industria alimentara , FIA este utilizata pentru determinarea amidonului din alimente, cofeinei din ceai, cafea, corpilor cetonici din lapte, sulfitilor si dioxidului de sulf din bauturi, bromatului de potasiu din faina etc.

Metodele FIA sunt foarte utile în domeniul apei. Colectarea probelor de apa de la un curent de apa (râu, fluviu, izvor) este cea mai mare sursa de potentiale erori în analiza chimica a apei. Prelevarea continua este necesara în obtinearea unor date reprezentative în ce priveste compozitia chimica a apei. În majoritatea cazurilor, costul echipamentelor de laborator si munca necesara face acest lucru imposibil. Ideal ar fi sa se faca analize in-situ, pentru expunerea la mai putine influente externe. Desi exista câteva metode electrochimice ce pot fi utilizate pentru determinarea câtorva parametrii, pH, continut de O2, conductivitate, nu se acopera întreaga gama de analize necesare. Una dintre solutii este aplicarea metodelor FIA (exista peste 225 de lucrari privind aplicabilitatea tehnicii în domeniul apei). Aplicatiile în domeniu consta în general în determinarea fosfatilor, nitratilor, amoniacului, amoniului, ozonului rezidual, sulfatilor, a alcalinitaii, fluorurilor, metalelor grele, cianurii.

Evaluarea metodelor existente privind acuratetea, aplicabilitatea, precizia, selectivitatea, sensitivitatea, gradul de determinare si de tranzitie a probei indica faptul ca:

-numarul mare de lucrari publicate privind FIA în domeniul analizelor apei confirma potentialul acestei tehnici în realizarea analizelor de rutina într-un mod automat si simplu:

-calitatea generala a tehnicii este acceptabila- multe dintre aplicatii s-au orientat pe determinarea compusilor

anorganici si utilizarea detectorului fotometric-se asteapta metode mai performante pentru laboratoarele de analiza -tendintele în domeniu ar trebui sa se orienteze pe determinarea

compusilor organici,monitorizarea a unu sau doi componenti ai apei.Principalele cerinte pentru procesul de monitorizare cu sisteme FIA

sunt: simplitate,robustete si fiabilitate. Simplificarea sistemelor si miniaturizarea lor sunt temele principale de dezvoltare a tehnicii FIA.

29