1

Analiza structurala si modularea functionala a drenajului fluidului perivascular si al amiloidului Abeta in creier

Director proiect: Prof. Univ. dr. Pirici Nicolae-Daniel, U.M.F Craiova, Disciplina Metodologia Cercetarii Stiintifice, Departamentul I Stiinte Morfologie

Raport Stiintific Final (09.01.2017- 30.06.2018)

Rezumat

Proiectul “Analiza structurala si modularea functionala a drenajului fluidului perivascular si al amiloidului Abeta in creier”, finantat in cadrul programului PN-III-CERC-CO-PED-2016, a avut un dublu impact:

(1) Desi in mod traditional creierul este descris ca fiind lipsit de vase limfatice, acest proiect a confirmat in primul rand faptul ca exista vase cu fenotip limfatic nu numai la nivelul tesutului cerebral, dar si la nivelul structurilor care separa creierul de cutia craniana (meninge), si mai mult, acestea sunt in strinsa continuitate unele cu altele, prin oasele calotei craniene si pana la nivelul tesuturilor moi inconjuratoare. Pe langa aspectul pur anatomic, devine si mai clara posibilitatea propagarii infectiilor din afara calotei cranieie in mod direct catre sistemul nervos central.

(2) Rezultatele proiectului de fata arata si ca inhibarea unui canal ubiquitar de apa (deci care mentine echilibrul hidric in jurul membranelor celulare), numit aquaporina 4 (AQP4), duce la blocarea trecerii fluidului dinspre/catre creier prin spatiile situate in jurul vaselor de sange (numit drenaj paravascular si perivascular). Pe langa rolul dovedit ca un tratament ce vizeaza blocarea AQP4 reduce complicatiile unui accident vascular cerebral ischemic, echipa noastra a aratat si ca inhibitorul blocheaza drenajul peptidului amiloid Aβ (responsabil de acumularea placilor de amiloid in maladia Alzheimer). Aici este deci de conceput ca un tratament care se stimuleaza AQP4 va favoriza eliminarea Aβ si ar putea ameliora modificarile histopatologice din aceasta maladie.

2

Obiectivele fazei de executie

In descursul proiectului de fata s-au efectuat si definitivat experimentele propuse si s-a finalizat analiza datelor considerate spre publicare. S-au atins urmatoarele obiective si activitati:

1. Managementului proiectului.

1.1. Intalnire de lucru intre parteneri; stabilirea protocoalelor finale de lucru.

S-au discutat in cadrul acestor intalniri obiectivele proiectului, si daca acestea constituie inca elemente de maxima actualitate, avand in vedere timpul scurs de la data propunerii initiale in competitie. Pe baza studiului de documentare bibliografica, echipa si-a updatat baza de referinte bibliografice, iar publicatiile aratau ca nu existau rapoarte ale utilizarii unui inhibitor selectiv de aquaporina 4 (AQP4) (produs denumit comercial TGN-020) in modularea curgerii perivasculare a lichidului interstitial in creier, si implicit al drenajului peptidului precursor al amiloidului (Aβ). Este cunoscut faptul ca modele animale murine purtatoare de mutatii la nivelul proteinelor APP (proteina precursoare a amiloidului) si PS1 (Presenilina 1), ce reproduc patologia amiloida din maladia Alzheimer, vor depozita predominant amiloid perivascular in momentul in care nu mai exprima AQP4 (AQP4 -/-) (Xu, Xiao et al. 2015). Acest lucru sugera implicarea AQP4 in modularea curgerii si clearance-ului perivascular al Aβ, insa ideea nu a fost abordata inca pana in prezent. Pe de alta parte, nici descrierea anatomo-histologica complexa a vaselor cu fenotip limfatic de la nivelul SNC nu a fost extinsa peste o analiza a leptomeningelui (Louveau, Smirnov et al. 2015). In concluzie, la data intalnirilor noastre si a finalizarii obiectivelor generale ale proiectului de fata, erau pastrate inca prioritatea si actualitatea stiintifica.

1.2. Semnarea unui acord cu Comisia de Etica a UMF Craiova si respectiv UMF Crol Davila; crearea unei pagini web dedicate a proiectului. Ulterior primei intalniri intre membrii echipei, si consecutiv deciziei de a mentine numarul de animale si metodologia de lucru propusa in forma depusa a proiectului, s-a formulat o cerere de avizare a proiectului de catre Comisiile de Etica ale celor doua UMF partenere. Aprobarile cu numarul 199/24.10.2017 (pentru UMF Craiova) si respectiv 125/16.06.2017 (pentru UMF Carol Davila) sunt anexate in copie acestui raport. Pe site-ul UMF Craiova a fost creata o pagina dedicata proiectului, pagina ce a fost updatata periodic, pe masura evolutiei acestuia (http://www.umfcv.ro/143ped).

2. Injectia intracerebrala a Aβ40 cu /fara inhibitorul de AQP4. Evaluarea in vivo in microscopie cu doi fotoni; analiza integrativa finala

In scopul perfectionarii tehnicilor necesare injectiei sub microscop a unor volume mici, in coordinate stereotaxice bine definite, s-a realizat intai un prototip de sistem de atasare a unui micromanipulator pe platanul microscopului cu stimulre doi fotoni (2P) din cadrul biobazei UMF Craiova, prin design si printare tridimensionala cu ajutorul imprimantei 3D UP BOX plus (Tiertime Corp.) ce face parte din dotarea UMF Craiova. Designul a fost realizat cu ajutorul interfetei online Tinkercad (Autodesk Tinkercad, https://www.tinkercad.com), prin colaborarea intre membrii proiectului din UMF Craiova si UMF Carol Davila (Figura 1).

3

Figura 1. Design-ul suportului pentru micromanipulator, in platforma de desen Tinkercad si instrumental montat pe platanul microscopului, dupa printare 3D.

In scopul injectarii lente a unor volume mici (timp de cateva minute), vom utiliza o microseringa Hamilton cu volum de 1µl, care insa nu pote fi actionata manual constant la o viteza de descarcare de cateva minute. In acest scop am pus la punct un prototip de minipompa controlata electronic ce actioneaza constant si controlabil pistonul seringii (Figura 2). La data finalizarii proiectului am realizat deja o noua mini-pompa de micro-injectare, de data aceasta sistemul de actionare a seringii Hamilton facandu-se prin transmitere pneumatica, eliminand astfel vibratiile induse initial de plasarea servomotorului direct pe stativul seringii Hamilton. Realizarea s-a facut cu ajutorul imprimantei 3D din cadrul UMF Craiova, iar toate experimentele de injectare si urmarire in vivo a difuziei Aβ40 s-au facut cu acest sistem.

Figura 2. Sistemul de actionare si control al microseringii Hamilton in cadrul aparatului de pozitionare stereotaxica.

Toate loturile de animale (transgenice si non-transgenice) necesare pentru acest studiu au fost injectate sub microscop, dupa optimizarea instrumentarului descris si a solutiei de Aβ40 HiLyte FluorTM 555 (AnaSpec, USA; 3µl in 1% NH4OH), in scopul vizualizarii simultane a difuziei Aβ40 impreuna cu reactia celulara fluoresecnta endogen in aceste animale (Figurile 3-4).

4

Figura 3. Urmarirea reactiei celulare corticale la nivelul zonei de injectare intracerebrala, secventa temporala surprinsa in microscopie 2P. Astrocitele sunt verzi, oligodendrogliile rosii, iar resturile de

dura albastre.

Pentru animalele tratate cu inhibitorul de AQP4, s-a utilizat compusul TGN-020 [N-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)pyridine-3-carboxamide], in doza de 200 mg/kg dizolvat in ser fiziologic (Huber, Tsujita et al. 2009, Igarashi, Huber et al. 2011, Nakamura, Suzuki et al. 2011). Directorul de proiect contactase deja un producator capabil sa sintetizeze inhibitorul (http://www.uorsy.com), intrucat produsul disponibil de exemplu la Sigma-Aldrich avea un pret prohibitiv la cantitatea necesara in proiectul de fata, si in plus, aceasta forma neutra ar putea prezenta probleme de solubilitate in ser fiziologic. S-a contactat producatorul de mai sus si s-a procurat o sare de Cl care sa prezinte o solubilitate crescuta in ser fiziologic [N-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)pyridine-3-carboxamide dihydrochloride]. In urma discutiei dintre membrii din UMF Craiova si UMF Carol Davila s-a hotarat ca sarea de Cl este de preferat fata de sarea de Na utilizata in alte studii.

.

Figura 4. Difuzia in vivo a Aβ40 (verde) in jurul vaselor de singe (dextran, rosu) prin microscopie 2 fotoni Sagetile albe indica remanenta peptidului perivascular, in timp, la animalele tratate cu TGN-020.

5

Rezultatele acestui studiu (Figura 4) au aratat, cum era de asteptat, ca dupa injectia intracerebrala lenta, Aβ40 difuzeaza incet si este degradat la nivelul parenchimului (microglii, enzime interstitiale, captare la nivelul vaselor de sange. Injectarea Aβ40 la 30 de minute dupa dministrarea de TGN-020 a aratat insa pentru prima data in literatura, captarea peptidului amiloid si remanenta acestuia la nivelul spatiilor perivasculare, chiar si dupa captarea si difuzia sa la nivelul parenchimului (Figura 4).

Aceasta este prima dovada experimentala a ipotezei noastre, conform careia inhibarea transportului de apa paravascular mediat de AQP4 duce si la blocarea preluarii lichidului interstitial din parenchim, si implicit a peptidului Aβ, probabil aceasta cale fiind una din primele elemente fiziopatologice implicate in maladia Alzheimer.

3. Procesarea si arhivarea tesutului in vederea investigatiilor histo- si imunohistochimice.

Toate animalele de testari prealabile a metodei de injectie si cele destinate studiului vascularizatiei limfatice meningo-cerebrale au fost deja sacrificate si procesate pentru includerea la parafina, fiind deja analizate histopatologic si imunohistochimic.

4. Prelucrarea si examinarea histopatologica si imunohistochimica a tesutului arhivat.

Toate tesuturile incluse la parafina au fost deja analizate in ceea ce priveste reactia gliala in jurul situsului de injectare, rezultatul fiind o reducere a gliozei reactive la animalele tratate cu TGN-020 (rezultat prezentat in cadrul unui conferinte). Colateral, am fost interesati daca pe un model animal de traumatism cerebral, inhibarea AQP4 poate avea efecte benefice si poate imbunatati recuperarea clinica.

Figura 5. Pe un model murin tratat cu TGN-020 dupa un accident vascular cerebral ischemic se arata reducerea densitatii de celule apoptotice comparativ cu animalele netratate.

6

Observatia ca TGN-020 reduce transferal apei in parenchim, reducand deci edemul cerebral, ne-a facut sa evaluam efectul sau si dupa un accident vascular cerebral ischemic, acolo unde etapa initiala de edem citotixic nu poate fi contracarata prin mijloace terapeutice curente. Rezultatele analizei histopatologice si imunohistochimice detaliate arata ca inhibarea AQP4 duce la reducerea gliozei si apoptozei la animalele tratate (Figura 5), si ca tratamentul potenteaza si efectul unor neuroprotectoare precum Crebrolysin (Figura 6). Ambele rezultate sunt deja publicate in jurnalele “International Journal of Molecular Sciences” si respectiv “CNS & Neurological Disorders - Drug Targets” (Pirici, Balsanu et al. 2017, Catalin, Rogoveanu et al. 2018).

Figura 6. Mentinerea densitatii neuronale la animale tratate cu Cerebrolysisn si TGN-020 dupa un AVC ischemic comparativ cu animalele tratate numai cu Cerebrolysin.

5. Microscopie electronica de transmisie; analiza integrativa finala

O parte din blocurile incluse au fost postfixate in glutaraldehida si au fost examinate evaluate prin Microscopie Electronica (EM) in cadrul UMF Carol Davila (EM de transmisie), dr si in cadrul universitatii din Southampton, UK, in laboratorul de histologie condus de dna Prof Roxana Carare (examinare EM pe sectiuni seriate printr-o tehnica existenta in acest laborator). Rezultatele acestei analize arata o ingrosare a membranelor bazale endoteliale la animalele injectate cu inhibitorul de AQP4 comparativ cu animalele de control, analiza fiind facuta dupa o fereastra de supravietuire de 30 de minute de la injectarea intraperitoneala a inhibitorului (Figura 7).

Ca si in cazul difuziei Aβ40, aceasta este prima evidenta directa ultrastructurala a blocarii curgerii fluidului paravascular dupa inhibarea transportului de apa mediat de AQP4.

7

Figura 7. Ingrosarea membrane bazale endoteliale la animalele tratate cu inhibitorul de AQP4 (pe verticala) versus control. Barele albe identifica morfologic membranele bazale endoteliale.

6. Screening anatomo-histologic al vaselor limfatice durale; analiza integrativa finala

Proiectul depus a propus analiza vaselor limfatice durale de la nivelul encefalului, in lumina descoperirii prezentei reactivitatii pentru markeri limfatici la acest nivel. In acest scop s-a inceput evaluarea unor tehnici de decalcificare si procesare pentru includere la parafina in vederea evaluarii parenchimului cerebral impreuna cu oasele craniului.

Intrucat procesarea pentru includerea la parafina duce la o reducere volumetrica de aproximativ 25% a piesei histologice, in functie de continutul in apa al tesutului, ne-a interesat ce tehnica de decalcificare reduce suficient duritatea oaselor neurocraniului pentru ca acestea sa nu se desprinda de parenchimul cerebral in timpul procesarii. In al doilea rand, tehnica de decalcificare nu trebuie sa afecteze antigenicitatea tesutului pentru a putea efectua apoi si teste imunohistochimice pentru vizualizarea simultana a vaselor de sange si limfatice.

Rezultatele optimizarilor noastre au aratat ca:

1. Dintre cele mai utilizate doua metode de decalcificare (incubarea cu acid formic 5-10% si respectiv 5-10% EDTA, cea din urma mentine cel mai bine antigenicitatea tesutului) (Figura 8).

8

Figura 8. Decalcificrea in solutie tamponata de EDTA mentine antigenicitatea tesutului mai bine comparativ cu FA.

2. Indiferent de metoda de decalcificare, procesarea tesutului pentru includere la parafina contine o serie de pasi de deshidratare obligatorii, si incepand cu deshidratarea in etanol 90% incepe un proces de contractare selectiva a tesutului ce duce la distrugerea continuitatii os-parenchim (Figura 9).

Figura 9. Procesarea pentru includere la parafina induce retractia encefalului de pe calota craniana incepand cu solutia de alcool 90%.

3. Incubarea in parafina topita peste noapte (parafina clasica cu punct de topire de 56˚) duce la o contractare suplimentara a parenchimului cerebral si o desfacere a sa de pe calota craniana (Figura 10). Aceste date au aratat ca nu putem folosi tehnica calsica de includere la parafina si ca este nevoie de o metoda alternativa.

9

Figura 10. Rezultatul decalcificarii cu EDTA 5-10% si al procesarii prin includere la parafina. Se observa desprinderea masiva a parenchimului cerebral de oasele neurocraniului si viscerocraniului.

4. In aceasta situatie, am revizuit literatura tehnica legata de procesarea si includerea tesutului intr-un mediu de sectionare (respingand ideea sectionarii la gheata datorita morfologiei de calitate inferioara a acestor preparate). O solutie putin utilizata astazi datorita unor costuri mai ridicate pentru analize de rutina s-a dovedit a fi inlocuirea parafinei clasice cu un amestec de polietilenglicoli (PEG), un produs care exista pe piata si care poarta denumirea de Parafina poliesterica (PEG) (VWR cod 360704E) (Steedman 1957). Avantajele utilizarii PEG sunt ca este miscibila cu alcoolul 90% si ca are temperatura de topire de 38˚C, deci parea un produs ideal pentru necesitatile noastre. Am achizitionat si testat acest produs, iar rezultatele au aratat in final o pastrare a integritatii interfetei parenchim –calvaria, cu retinerea antigenicitatii in cazul procesarii pentru imunohistochimie (Figura 11).

Figura 11. Procesarea si includerea tesutului decalcificat in parafina PEG arata o retinere a integritatii interfetei os- parenchim cerebral.

In concluzie, desi datorita obstacolelor tehnice aceasta a fost de departe cea mai lunga perioada a primei etape a proiectului de fata, am obtinut in final un protocol care sa permita evaluarea unitara a craniului si a encefalului in scopul evaluarii vaselor de sange si limfatice de la nivelul meningelui.

Apoi, conform planului propus, am urmarit din punct de vedere imunohistochimic identificarea simultana pe aceste tesuturi a endoteliului vascular in general, impreuna cu un marker specific endoteliului limfatic. Am efectuat tehnici de imunohistochimie dubla secventiala pentru vizualizarea CD31 (sobolan anti-mouse Abcam ab56299 sau Santa Cruz sc-101454) si a Lyve-1 (iepure anti-mouse Abcam ab36993 sau ab33682). Au fost alesi cate doi anticorpi pentru fiecare tinta pentru a nu considera observatiile incidentale. Anticorpii au fost detectati separat cu cate un sistem polimeric conjugat cu HRP si dezvoltat fie pentru IgG de iepure,

10

fie pentru IgG de sobolan (Nikirei Histofine). Intre cele doua detectii s-a utilizat o metoda de elutie si blocare a HRP introduse in literatura de grupul nostru (Pirici, Mogoanta et al. 2009), iar detectia chimica s-a realizat fie cu DAB (Vector Labs) fie cu Permanent HRP Green (Zytomed, cod ZUC070-100).

In scopul separarii celor doua culori, chiar si in cazul suprapunerii lor), utilizam o camera de achizitie microscopica multispectrala unica in tara (Nuance FX, Perkin Elmer), care permite selectarea si separarea semnalelor in functie de lungimea de unda emisa in spectrul vizibil, fiind la ora actuala o metoda avizata si pentru diagnosticul histopatologic (Figura 12). Prin optimizarea acestei camere multispectrale grupul nostru a participat si la elaborarea unor lucrari legate de evaluarea imunohistochimica a plexurilor nervoase mienterice in diferite tipuri de tumori ale tubului digestiv, dintre care una este deja publicata (Tartea, Florescu et al. 2017).

Figura 12. Imunohistochimie dubla enzimatica (Lyve 1 – maro, CD31 – verde) in care separarea spectrala a celor doua semnale ilustreaza ca pe masura ce vasele de sange leptomeningeale mari

(verde) se ramifica, isi pierd treptat fenotipul limfatic (maro)

Au fost realizate si preparate fluorescente in care cei doi anticorpi primari au fost detectati cu ajutorul unor secundari anti-iepure si respectiv anti-sobolan marcati cu AlexaFluor555 si Alexa Fluor 596, sectiunile fiind apoi procesate prin deconvolutie (Figura 13). Analiza imagistica s-a desfasurat pe statiile grafice aflate in dotarea ambilor parteneri ai proiectului (UMF Craiova si UMF Carol Davila).

Figura 13. Imunohistochimie dubla fluorescenta in care se observa din nou faptul ca vasele de sange leptomeningeale mari se ramifica, isi pierd treptat fenotipul limfatic (centrifuge fata de vasele mari

leptomeningeale, majoritatea vaselor devin Lyve-1 negative).

11

Dupa finalizarea optimizarilor proceselor de decalcificare si de imunocolorare s-au urmat doua cai de analiza a tesutului:

a. Scanarea sectiunilor seriate rezultate din procesarea cutiilor craniene si urmarirea morfologiei vaselor limfatice si a piei mater (Figurile 14-15).

Figura 14. Sectiuni seriate scanate complet pentru analiza morfometrica a piei mater.

Figura 15. Imunomarcarea pentru vasele limfatice (Lyve1) a aratat pe sectiuni seriate (sagetile rosii) continuitatea vaselor limfatice subcutanate cu sinusurile venoase si cu pia mater.

12

b. Continuarea investigarii imunofluorescente de inalta rezolutie a expresiei celor doi markeri la nivelul vaselor meningeale (CD31 - verde si Lyve1 - rosu) (Figura 16).

Figura 16. Imunomarcarea vaselor limfatice (rosu) si de sange (verde) meningeale.

In concluzie, analiza pe sectiuni seriate a fenotipului de expresie a markerilor limfatici si endoteliali a aratat, pentru prima data, ca acest fenotip este exprimat puternic la nivelul piei mater, vaselor meningeale si a unei proportii din vasele corticale; precum si ca aceste vase comunica larg cu sinusurile venoase intraosoase si cu vasele scalpului.

7. Diseminarea rezultatelor

In cursul desfasurarii proiectului s-a initiat si updatat o pagina web dedicata proiectului (http://www.umfcv.ro/143ped), s-au stabilit si confirmat protocoalele finale de lucru, si s-au obtinut acordurile comisiilor de Etica ale UMF Craiova si UMF Carol Davila.

La data finalizarii proiectului exista 6 articole publicate si 1 articol acceptat spre publicare, in jurnale indexate ISI:

1. Mitran SI, Burada E, Tanasie CA, Manea NC, Ciorbagiu MC, Mirea CS, Balseanu TA. Microglial morphology determined with confocal and two-photon laser scanning microscopy. Rom J Morphol Embryol. 2018;59(1):2 in press

2. Stopper L, Bălşeanu TA, Cătălin B, Rogoveanu OC, Mogoantă L, Scheller A. Microglia morphology in the physiological and diseased brain - from fixed tissue to in vivo conditions. Rom J Morphol Embryol. 2018;59(1):7-12.

3. Catalin B, Rogoveanu OC, Pirici I, Balseanu TA, Stan A, Tudorica V, Balea M, Mindrila I, Albu CV, Mohamed G, Pirici D, Muresanu DF. Cerebrolysin and aquaporin 4 inhibition improve pathological and motor recovery after ischemic stroke. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2018 Apr 25. doi: 10.2174/1871527317666180425124340. [Epub ahead of print]

13

4. Pirici I, Balsanu TA, Bogdan C, Margaritescu C, Divan T, Vitalie V, Mogoanta L, Pirici D, Carare RO, Muresanu DF. Inhibition of Aquaporin-4 Improves the Outcome of Ischaemic Stroke and Modulates Brain Paravascular Drainage Pathways. Int J Mol Sci. 2017 Dec 23;19(1). pii: E46. doi: 10.3390/ijms19010046.

5. Pîrşcoveanu DFV, Pirici I, Tudorică V, Bălşeanu TA, Albu VC, Bondari S, Bumbea AM, Pîrşcoveanu M. Tau protein in neurodegenerative diseases - a review. Rom J Morphol Embryol. 2017;58(4):1141-1150.

6. Tudoraşcu DR, Pirici D, Târtea EA, Mustafa ER, Florescu C, Vere CC, Balea AM, Puiu I, Târtea GC, Albu VC. Synaptophysin expression as prognostic factor for survival in colorectal carcinomas. Rom J Morphol Embryol. 2017;58(4):1409-1415.

7. Târtea EA, Florescu C, Donoiu I, Pirici D, Mihailovici AR, Albu VC, Bălşeanu TA, Iancău M, Badea CD, Vere CC, Sfredel V. Implications of inflammation and remodeling of the enteric glial cells in colorectal adenocarcinoma. Rom J Morphol Embryol. 2017;58(2):473-480.

Au fost sustinute o serie de prezentari la conferinte si congrese nationale si internationale:

1. Pirici D, Catalin B, Balsanu TA, Pirici I, Nicola CG, Ofiteru AM, Mogoanta L, Margaritescu C. Inhibiting aquaporin 4 modulates the perivascular drainage of amyloid Aβ peptide in the brain. European Journal of Neurology (The 4th Congress of the European-Academy-of-Neurology: Lisabona, Portugalia, 16-19 iunie 2018), Vol 25, Suppl 2

2. Pirici D, Bogdan C, Balsanu TA, Manole E, Bastian AE, Pirici I, Mogoanta L, Margaritescu C. Inhibitia aquaporinei 4 moduleaza fluxul perivascular al peptidului Aβ in creier. Al XVI-lea Simpozion National de Morfologie Microscopica cu participare internationala, Craiova, 23-26 mai, 2018

3. Pirici I, Catalin B, Balsanu TA, Silvia PE, Margaritescu C, Mogoanta L, Ion DA, Pirici D. Analiza tridimensionala a vaselor limfatice durale la soarece. Al XVI-lea Simpozion National de Morfologie Microscopica cu participare internationala, Craiova, 23-26 mai, 2018

4. Pirici I, Catalin B, Balseanu A, Mogoanta L, Margaritescu C, Nicola GC, Pirici D. Evaluarea efectului inhibarii aquaporinei 4 asupra difuziei fluidelor in parenchimul cerebral si supra curgerii paravasculare a lichidului interstitial. Al XV-lea Simpozion National de Morfologie Microscopica cu participare internationala, Baile Felix-Oradea, 24-27 mai, 2017

5. Pirici I, Catalin B, Balseanu A, Mogoanta L, Margaritescu C, Popescu ES, Pirici D. Optimization of whoile mouse head processing for paraffin embedding with minimal volumetric changes for morphology studies. The 8th Conference of the National Neuroscience Society of Romania (Neurodegeneration and regeneration From cells to mind), Craiova, 19-21 octombrie, 2017

6. Balseanu TA, Pirici I, Catalin B, Margaritescu C, Mogoanta L, Muresanu DF, Pirici D. New targeting patways in ischemic stroke – aquaporin. The 8th Conference of the National Neuroscience Society of Romania (Neurodegeneration and regeneration From cells to mind), Craiova, 19-21 octombrie, 2017

7. Cojocaru A, Godeanu S, Barbulescu D, Vladulescu N, Brosteanu M, Dragan MI, Serbanescu MS, Balseanu TA, Catalin B. Cranial window implantation alters superficial vascular network. The 8th Conference of the National Neuroscience Society of Romania (Neurodegeneration and regeneration From cells to mind), Craiova, 19-21 octombrie, 2017

Ca si concluzie generala, in cadrul acestui proiect am aratat ca (1) inhibarea AQP4 reduce curgerea fluidului perivascular si drenajul acestuia de-a lungul membranelor bazale vasculare cerebrale, si (2) ca vasele de sange meningeale exprima markeri limfatici, si ca sunt in continuitate cu sinusurile venoase ale calvariei si cu vasele limfatice ale scalpului.

14

Mai mult, proiectul de fata a asigurat nu numai o oportunitate de a construi colaborari cu centre de neuropatologie de prestigiu din Europa, de a ne imbunatati baza materiala cu reactivi si echipamente de ultima generatie (automatizarea microscopului de cercetare din cadrul departamentului nostru din UMF Craiova), dar mai ales ne-a dat posibilitatea de a oferi un suport pentru activitatea de cercetare stiintifica propusa impreuna cu doctoranzi si tinerii cercetatori din UMF Craiova.

05.07.2018 Director proiect, Prof. Univ. dr. Pirici Nicolae-Daniel

15

Referinte

Catalin, B., O. C. Rogoveanu, I. Pirici, T. A. Balseanu, A. Stan, V. Tudorica, M. Balea, I. Mindrila, C. V. Albu, G. Mohamed, D. Pirici and D. F. Muresanu (2018). "Cerebrolysin and aquaporin 4 inhibition improve pathological and motor recovery after ischemic stroke." CNS Neurol Disord Drug Targets.

Huber, V. J., M. Tsujita and T. Nakada (2009). "Identification of aquaporin 4 inhibitors using in vitro and in silico methods." Bioorg.Med.Chem. 17(1): 411-417.

Igarashi, H., V. J. Huber, M. Tsujita and T. Nakada (2011). "Pretreatment with a novel aquaporin 4 inhibitor, TGN-020, significantly reduces ischemic cerebral edema." Neurol.Sci. 32(1): 113-116.

Louveau, A., I. Smirnov, T. J. Keyes, J. D. Eccles, S. J. Rouhani, J. D. Peske, N. C. Derecki, D. Castle, J. W. Mandell, K. S. Lee, T. H. Harris and J. Kipnis (2015). "Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels." Nature 523(7560): 337-341.

Nakamura, Y., Y. Suzuki, M. Tsujita, V. J. Huber, K. Yamada and T. Nakada (2011). "Development of a Novel Ligand, [C]TGN-020, for Aquaporin 4 Positron Emission Tomography Imaging." ACS Chem.Neurosci. 2(10): 568-571.

Pirici, D., L. Mogoanta, S. Kumar-Singh, I. Pirici, C. Margaritescu, C. Simionescu and R. Stanescu (2009). "Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype." J.Histochem.Cytochem. 57(6): 567-575.

Pirici, I., T. A. Balsanu, C. Bogdan, C. Margaritescu, T. Divan, V. Vitalie, L. Mogoanta, D. Pirici, R. O. Carare and D. F. Muresanu (2017). "Inhibition of Aquaporin-4 Improves the Outcome of Ischaemic Stroke and Modulates Brain Paravascular Drainage Pathways." Int J Mol Sci 19(1).

Steedman, H. F. (1957). "Polyester wax; a new ribboning embedding medium for histology." Nature 179(4574): 1345.

Tartea, E. A., C. Florescu, I. Donoiu, D. Pirici, A. R. Mihailovici, V. C. Albu, T. A. Balseanu, M. Iancau, C. D. Badea, C. C. Vere and V. Sfredel (2017). "Implications of inflammation and remodeling of the enteric glial cells in colorectal adenocarcinoma." Rom J Morphol Embryol 58(2): 473-480.

Xu, Z., N. Xiao, Y. Chen, H. Huang, C. Marshall, J. Gao, Z. Cai, T. Wu, G. Hu and M. Xiao (2015). "Deletion of aquaporin-4 in APP/PS1 mice exacerbates brain Abeta accumulation and memory deficits." Mol Neurodegener 10: 58.