analiza molecular a a alelelor hla

27

ANALIZA MOLECULARĂ A ALELELOR HLA

CRISTINA LUMINIŢA STANCIU, IOAN FLOREA DUMITRU

Facultatea de Biologie, Universitatea Bucureşti

Introducere

Acum mai bine de 100 de ani patologul Rudolph Virchow a descristegumentul ca un înveliş protector al organelor interne. La acea vreme tegumentulera considerat o barieră pasivă la rănirile mecanice şi pierderile de lichide.

Astăzi este ştiut că tegumentul este compus din tipuri celulareinterdependente. Melanocitele din epiderm sunt celulele responsabile deproducerea pigmentului brun (melanina), celulele Langerhans sunt celuledendritice histiocitare care preiau şi prelucrează semnalele antigenice şi comunicăaceste informatii celulelor limfoide, celule epiteliale scuamoase (keratinocite) suntsitusurile majore pentru biosinteza moleculelor solubile (citokine) importante înreglarea funcţională a celulelor adiacente epidermului şi celulelor care formează înapropierea dermului un micromediu [24].

S-a descris răspunsul imun antitumoral mediat de fenomenul de restricţieimpus de moleculele sistemului major de histocompatibilitate (MHC MajorHistocompatibility Complex I şi II) la nivel cutanat.

Nu s-a găsit o asociere între răspunsul anticorpului la antigenele HLA şiapariţia cancerului cutanat. La transplantaţii de rinichi asocierea cu HLA-DR7indică un control genetic al dezvoltării sau regresiei cancerului cutanat implicândgene din regiunea clasei II a complexului major de histocompatibilitate [5].

Natura moleculară a răspunsului imun HLA I dependent la pacienţi cumelanom a fost clarificată odată cu descoperirea peptidelor derivate din antigenetumorale sau asociate tumorilor. Aceste antigene legate de moleculele HLA I pot firecunoscute specific de către limfocitele Tc citotoxice. Mai mult, prezenţa unorantigene HLA I constituie în prezent un criteriu de orientare a imunoterapiei bazatepe interleukine-2 (IL-2) şi evaluarea imunoterapiei nespecifice asupra proliferărilorcelulare cutanate în funcţie de modificările apărute în structura primară amoleculelor MHC I şi II aflate pe celulele tumorale.

Dezvoltarea metodologiei biomoleculare a arătat că frecvenţa crescută aHLA-DR5 şi HLA-DR4 se poate asocia cu anumite tipuri de melanoame. TipizareaDNA permite obţinerea de informaţii de mare acurateţe asupra alelelor HLA.

Componenta celulară a sistemului imun cutanatTegumentul este alcătuit din epiderm, derm aşezat pe membrana bazală şi

hipoderm. Fiecare dintre aceste ţesuturi conţine populaţii celulare care pot juca rolactiv în reacţiile imune [2].

Cristina Luminiţa Stanciu, Ioan Florea Dumitru

28

Sistemul imun cutanat este alcătuit din două tipuri de celule dendritice: înepiderm celulele Langerhans CD1a-pozitive şi în derm macrofagele dendriticeCD36-pozitive. Celulele dendritice pot migra dintr-un explant de piele într-unmediu de cultură.

Keratinocitele - sunt celule epiteliale epidermice care produc citokineimportante: interleukinele 1, 3 şi 6 (IL-1, 3, 6) , factorul de necroză tumorală (TNF-alpha), GM-CSF. După activarea cu citokinele produse de către limfocite, deexemplu cu IFN-gamma, keratinocitele secretă chemochine care stimuleazăchemotaxia dar şi anumite linii leucocitare. Deşi aceste constatări sugerează căinflamaţia locală se poate mări prin inducţie keratinocitară nu se ştie dacăcitokinele produse de către keratinocite pot ajunge la derm unde sunt localizaţi ceimai mulţi efectori imuni. Pe lângă rolul keratinocitelor de a secreta citokine,acestea pot induce şi exprimarea moleculelor MHC (Major Human Complex) IIprin expunerea la interferon gamma. Mecanismul este similar cu exprimarea MHCII pe macrofage. De asemenea, keratinocitele exprimă co-stimulatori diferiţi deaceia aflaţi pe celulele dendritice, macrofage şi limfocitele B. Oricum este neclarăfuncţia keratinocitelor de a prezenta antigene pentru iniţierea răspunsului imun prinintermediul limfocitelor T [2].

În contrast cu keratinocitele din ţesutul cutanat normal, celulele tumoraledin carcinomul bazocelular exprimă puternic şi difuz ligandul Fas (CD95L), dar nuexprimă antigenul Fas (CD95). Această exprimare in vivo a ligandului CD95L pecelulele tumorale ale carcinomului bazocelular este asociată cu limfocitele Tperitumorale care merg către apoptoză. Mai mult, CD95L poate fi indus pekeratinocitele normale aflate în cultură după expunerea lor la lumina ultravioletăradiaţia B (UV-B). Această inducere a ligandului CD95L a fost confirmată la nivelproteic şi mRNA folosindu-se pasaje multiple ale keratinocitelor umane şi a linieicelulelor keratinocitare. Keratinocitele care induc exprimarea ligandului CD95Lcaştigă capacitatea funcţională de a ucide linia celulelor limfocitare CD95-pozitivă.Pe câtă vreme keratinocitele hiperplastice din plăcile psoriazice netratate care nuexprimă ligandul CD95L pe membrana lor plasmatică, după tratamentul cu UV-Bse produce o puternică exprimare a CD95L pe keratinocite, ceea ce coincide înmod temporar cu depletia celulelor T intraepidermale la pacienţii studiaţi.

Datele sugerează o nouă cale prin care lumina UV-B poate contribui laabilitatea celulelor canceroase cutanate de a scăpa atacului imun al limfocitelor Tcitotoxice. Asemenea evenimente imunologice prevăd implicarea liganduluiCD95L ca tratament nou în neoplasmele cutanate dar şi în cazul unor variatedermatoze mediate de celulele T cum ar fi psoriazisul [9].

Analiza răspunsului obţinut în urma iradierii cu UV (UVB, 280-320 nm),la nivel transcriptional, prin metoda PCR (Polymerase Chain Reaction) a identificato forma nerecunoscută a unui grup larg de gene represate. Printre aceste gene UV-represabile a fost identificat un nou inhibitor serin proteinaza (serpin) denumithurpin (HaCaT UV-repressible serpin). Noul serpin are aproape 59% din

Analiza moleculară a alelelor HLA

29

aminoacizi identici cu antigenul 1 al celulei scuamoase carcinomatoase (SCCA1squamous cell carcinoma antigen 1) şi cu antigenul 2 al celulei scuamoasecarcinomatoase (SCCA2). Trăsăturile structurale unice ale serpinei aparţin familieiovalbuminei (ov-serpins). Secvenţa de aminoacizi din regiunea hinge în situsulloop reactiv sugerează că hurpin are capacitatea de inhibare a proteazei. Reziduriledin centru reactiv P1-P1 au fost identificate ca Thr 356-Ser 357 de aliniamentul cualte ov-serpine.

Expresia hurpin este limitată la celulele epidermale unde au fost detectaţidoi transcripti de 3.0 si 3.4 kb. Mai mult exprimarea hurpin pare a fi înrudită cuactivarea şi proliferarea keratinocitelor când transcriptul hurpin este mult maiabundent în keratinocitele imortalizate (HaCaT) şi în cultura de keratinocitenormale comparativ cu exprimarea lui în ţesutul cutanat normal [1].

Factorul de stimulare a coloniilor de granulocite-macrofage GM-CSF esteunul din factorii care stimulează proliferarea keratinocitelor şi de asemenea este unfactor chemoatractant pentru neutrofile şi macrofage [30].

Deşi există un paralelism clar între apoptoză şi sfârşitul diferenţieriiepidermale este neclar dacă terminarea diferenţierii keratinocitelor este o formă aapoptozei. Apoptoza este rară în culturile aderente de keratinocite normale chiar şiatunci când factorii de creştere sunt îndepărtaţi. Keratinocitele puse într-osuspensie timp de 24-96 ore, majoritatea suferă o diferenţiere terminală. MetodaTUNEL (Terminal-Uridin-Nucleotide-End-Labelling) utilizată în vederea detectăriipunctelor de fragmentare DNA nu este întodeauna un marker specific al apoptozeikeratinocitelor. In vivo şi în cultură, apoptoza şi diferenţierea terminală akeratinocitelor sunt evenimente celulare distincte, sensibile la diferiţi stimuli [8].

Celulele epidermale Langerhans - sunt celule derivate din măduva osoasă,având aspect pronunţat de asemănare cu profilul celulelor dendritice localizate înpartea suprabazală a epidermului. Funcţia celulelor Langerhans este aceea deprezentare a antigenelor către limfocitele T (CD4 +) [2].

Datorită faptului că au ATP-aze, esteraze, receptori pentru complement,receptori Fc, se aseamănă cu macrofagele, de care se deosebesc prin poziţia lorpredilectă în organism, adică la nivel cutanat. Celulele Langerhans stimuleazăpotent limfocitele T. Prin cultivarea lor in vitro pierd capacitatea de prelucrare aantigenului fiind, ca şi celulele dendritice, inductoare ale răspunsului imun primar,dar nu şi secundar.

Celulele Langerhans sunt bogate în antigene MHC clasa II şi HLA-DP şiHLA-DQ dar totuşi nu au markerii antigenici specifici monocitelor, macrofagelordeşi exprimă pe suprafaţa membranei antigene MHC clasa I.

Studiile in vitro au arătat că GM-CSF sunt importante pentru celuleleLangerhans. În ţesutul cutanat uman normal, GM-CSF induce schimbări înfenotipul şi distribuţia celulelor CD1a+ potrivit cu maturarea funcţională a celulelorLangerhans şi migrarea lor din epiderm către derm. GM-CSF pot juca un rolcrucial în patogeneza inflamaţiilor dermatoase [27].


30

A fost investigat rolul factorului de necroză tumorală alpha (TNF-α) înmobilizarea şi migrarea celulelor epidermale Langerhans. Injectarea intradermică aTNF-α recombinat la voluntari umani normali a condus după 2 ore la o reducere afrecvenţei celulelor Langerhans în stratul epidermal. Rezultate echivalente au fostobţinute când celulele epidermale Langerhans au fost identificate ca stând la bazaexprimării CD1a sau HLA-DR. La doza uzuală de 500U de TNF-α rezultatultratamentului este acela că densitatea celulelor Langerhans se reduce cuaproximativ 24%. Tratamentul cu TNF-α a fost asociat cu infiltrarea polimorfo-nuclearelor perivasculare după 2 ore de la injectare, dar epiderma apare normalăfără necroză fibrinoidă şi vasculită, iar morfologia celulelor Langerhans nu a fostafectată semnificativ. Aceste rezultate demonstrează că TNF-alpha furnizează unsemnal important pentru migrarea celulelor Langerhans şi de aceea joacă un rolcrucial în inducerea răspunsului imun cutanat [7].

Limfocitele intraepidermale - în cadrul epidermului există o mică populaţiede limfocite. La om acestea constituie doar aproximativ 2% din limfocitele asociatesistemului cutanat, restul de celule sunt proprii dermului; majoritatea limfocitelorsunt celule T (CD8+). În cele mai multe ţesuturi extracutanate limfocitele Tintraepidermale pot exprima un set restrictiv de receptori antigenici însă nicispecificitatea şi nici funcţia acestei subpopulaţii de celule T nu este definită.Procesul de cantonare a limfocitelor din circulaţia periferică în ariile specifice saude dependenţă a unor celule T la epiderm (�homing�) poate fi controlată prinmolecule de adeziune specifice. Celulele T intraepidermale precum şi unele celuleT din epiderm exprimă un carbohidrat sializat numit - antigen limfatic cutanat(CLA -1 - Cutaneous Lymphocyte Antigen) care este recunoscut de selectina E, şicare a fost identificat iniţial ca o moleculă endotelială ce induce un răspuns imuninflamator timpuriu. Majoritatea moleculelor determinantului CLA-1 suntsintetizate când celulele T devin active în micromediul cutanat ca răspuns lacitokine. Un număr mic de celule T circulante exprimă CLA-1 şi pot adera lacelulele endoteliale, exprimând în acelaşi timp selectina E.

Limfocitele şi macrofagele dermice - ţesutul conjunctiv al dermului conţinemacrofage dispersate şi limfocite T (CD4+/CD8+) situate predominantperivascular. De obicei celulele T exprimă markerii celulelor activate sau dememorie cum ar fi CD45-RO şi un număr mare de receptori IL-2R-alpha [2].

Fiziologic, limfocitele B nu sunt prezente la nivel cutanat. Chiar şi însituaţii patologice ele apar foarte rar. În schimb, limfoamele primare cutanate cucelule B sunt caracterizate de proliferarea limfocitelor B la nivel cutanat. Aceastasugerează cu siguranţă existenţa unui micromediu care sprijină expansiunea clonalăa celulelor B. A fost demonstrată implicarea citokinelor în patogeneza limfoamelorcutanate care au la origine celula T. Citokinele exprimate în leziunile cutanate alelimfoamelor cu celule B nu au fost investigate până acum. De aceea s-a analizat lanivelul mRNA mai multe citokine folosind tehnica RT-PCR [3].


31

Iniţierea răspunsului imun în pieleAntigenele proteice ajunse în tegument mobilizează trei tipuri de celule

prezentatoare de antigen. Celulele Langerhans reprezintă calea majoră deprezentare a antigenelor cutanate către celulele T native. Aceste celule leagăantigenul de suprafaţa lor, îl prelucrează şi apoi părăsesc sediul tegumentarîncărcate cu antigene, către vasele limfatice aferente spre regiunea paracorticală aganglionilor limfatici, unde se formează celulele interdigitate capabile să prezinteîn final antigenele limfocitelor T (CD4+). În stare de repaus fără stimulareextrinsecă celulele dendritice sunt celule prezentatoare de antigen. Pe de altă parte,macrofagele şi limfocitele B care sunt prezentatoare de antigen în mod curenttrebuie să fie mai întâi activate. Structural celulele dendritice exprimă un nivelridicat de molecule MHC II, precum şi co-stimulatori cum este glicoproteina B7.Celulele Langerhans proaspăt izolate nu activează limfocitele T dar capătă aceastăcapacitate după o scurtă cultivare de cca. 1-2 zile. Această perioadă de cultivareeste analogă cu migrarea celulelor Langerhans încărcate cu antigen, în vaselelimfatice aferente. Celulele Langerhans prezentatoare de antigene asigură activarealimfocitelor T în nodulii limfatici şi nu la nivel cutanat unde a fost introdus iniţialantigenul de referinţă. Macrofagele dermale şi celulele endoteliale venale potprezenta antigene limfocitelor T din derm. Cele mai multe dintre aceste celule Tdermale sunt activate anterior sau sunt celule de memorie.

Mecanisme prin care celula tumorală evită raspunsul imunChiar dacă celulele tumorale exprimă antigene specifice care pot fi

recunoscute ca proteine străine, sistemul imun nu poate supraveghea şi preveniapariţia şi frecvenţa cancerelor letale.

Obiectivele de bază ale terapiei antitumorale sunt tocmai creştereaimunogenicităţii tumorilor şi amplificarea activităţii efectorilor imunologici pe căispecifice şi nespecifice. Pentru aceasta trebuie să se cunoască în detaliumecanismele prin care fiecare tip de celulă tumorală evită răspunsul imun. Înlucrarea de faţă se accentuează descrierea categoriei de mecanisme dependente deMHC, ţinându-se cont de ambele funcţii ale acestor molecule:

- asigurarea histocompatibilităţii;- realizarea răspunsului imun sub restricţia lor.

1. Expresia moleculelor MHC-I în celulele tumorale poate fi reglată însens negativ (expresie redusă), astfel încât acestea să nu poata forma complexeîntre antigenele tumorale prelucrate şi moleculele MHC.

Creşterea nivelului de sinteză şi a capacităţii de exprimare a moleculelorMHC I în celule tumorale este urmată de mărirea susceptibilităţii lor faţă de lizaprodusă �in vitro� de către limfocitele T citotoxice (CTL).


32

Deşi există multe analize �in vitro� rezultatele lor nu se pot extrapola întotalitate situaţiilor existente �in vivo�. De exemplu, nu întotdeauna între celulatumorală cu potenţial metastatic şi aceea ne-invazivă există diferenţe privindsinteza şi expresia moleculelor MHC-I.

2. Cele mai multe celule tumorale nu exprimă molecule MHC II, deci nupot activa decât celule specifice, adică celule CD4+.

Activitatea antitumorală a limfocitelor T citotoxice CTL este într-ooarecare măsură dependentă de semnalele provenite de la celulele T helper. Dacăîn structura tumorilor nu există infiltrate celule prezentatoare de antigen clasice,care să prezinte antigenele tumorale şi apoi să activeze limfocitele T helper, atuncinu apare nici diferenţierea limfocitelor T citotoxice (CTL) cu activitateantitumorală.

3. Declanşarea răspunsului imun antitumoral poate conduce uneori, laselecţia de celule tumorale în care se produc mutaţii ale structurii genelor carecodifică antigenele MHC; aceste molecule au rol indispensabil în prezentareapeptidelor tumorale către sistemul imun.

Pe suprafaţa celulelor tumorale, antigenele MHC sunt expuse asociatantigenelor tumorale, formând complexul de recepţie faţă de efectorii celulariimunologici tip: CD4+/CD8+ (NK, CTL, limfocite helper). Modificarea anti-genelor MHC prin mutaţie genetică va neutraliza răspunsul imun antitumoraldeclanşat specific sau nespecific. Acest fenomen de instabilitate genetică seproduce din cauza ratei mari de multiplicare a celulei tumorale [2].

Antigenele complexului major de histocompatibilitate (MHC)Antigenele de histocompatibilitate se definesc ca molecule ale suprafeţei

celulare şi care, datorită diferenţelor biochimice individuale sunt recunoscute desistemul imunitar al receptorului de grefă. Diversitatea biochimică la nivelindividual a acestor molecule stă la baza unicităţii biochimice a fiecărui individuman şi determină o diversitate genică corespunzătoare.

Sistemul HLA este constituit: a) dintr-un prim grup de gene ce se găsesc pelocusurile A, B şi C a căror expresie fenotipică (antigenele de histocompatibilitate) au oanalogie marcată (atât lanţurile grele cât şi cele uşoare) cu imunoglobulinele; b) dintr-oa doua clasă de gene echivalente produselor Ir şi constituite din genele DR; c) în afaragenelor A, B, C şi DR o a treia clasă de gene cuprinsă în sistemul HLA.

În Tabelul 1 se poate observa frecvenţa bolilor la diverse specificităţiHLA-DR [18].

Tabelul 1. Afecţiuni asociate sistemului HLA (dupa Svejgaard) [18]Frecvenţa %Boala HLA

Pacienţi MartoriRisc relativ

Dermatita herpetiformă D/DR 3 85 26.3 15.4Psoriazis vulgaris Cw6 87 33.1 13.3


33

Distribuţia tisulară a moleculelor MHC II

Moleculele MHC II sunt exprimate predominant pe limfocitele B şi petoate celulele care prelucrează şi expun antigenul pe suprafaţa lor.

Intensitatea exprimării moleculelor MHC II este variabilă, fiind controlatăde diferiţi factori: interferonul γ, IL-2 şi alte produse de sinteză a celulelor Tamplifică nivelul de exprimare a moleculelor MHC II, iar glicocorticoizii,alfafetoproteina, lipopolizaharidele bacteriilor Gram negative diminuă gradulexprimării acestor molecule. Limfocitele B şi celulele tumorale elibereazămoleculele MHC II [32].

Structura moleculară a antigenelor MHC II

Orice celulă exprimă pe suprafaţa sa molecule cu proprietăţi antigeniceparticulare, a căror sinteză este sub controlul genelor din complexul major dehistocompatibilitate [32].

În general se consideră că antigenele MHC clasa I sunt recunoscute decelulele T CD8+, în timp ce antigenele MHC clasa II sunt recunoscute de celulele TCD4+ [20].

Complexul genic HLA este localizat la om pe cromozomul 6 [5].Acest complex se găseşte pe braţul scurt al cromozomului uman (6p21.1 -

6p21.3) [6] şi cuprinde aproximativ 3500 (kbp) kiloperechi de baze, iar în interiorulcomplexului, regiunea (telomerică) a clasei I şi regiunea (centromerică) a clasei IIsunt diferite [31].

Clasa a II-a de molecule este alcătuită din lanţurile α ţi β, douăglicoproteine heterodimere distincte de circa 32-34 kDa, respectiv 26-29 kDa. Suntlegate între ele prin forţe necovalente şi au fiecare un domeniu extracelular cu 195-199 aminoacizi şi câte două legături disulfidice intralanţ care formează câte douăbucle α1 şi α2 la nivelul lanţului α şi β1, şi β2 la nivelul lanţului β, un segmenttransmembranar cu circa 23 aminoacizi şi un domeniu intracitoplasmatic. Ambelelanţuri leagă hidraţi de carbon. Lanţul α are două catene oligozaharidice laterale,iar lanţul β doar o catenă.

Domeniile NH2 terminale α1 si β1 sunt polimorfe, pe când cele α2 şi β2sunt mai constante, fiind asemănătoare cu regiunile constante aleimunoglobulinelor. Segmentul transmembranar are circa 25 de resturi deaminoacizi hidrofobi, iar cel citoplasmatic circa 10-20 resturi de aminoacizi.Domeniile α1 şi α2 leagă hidraţi de carbon la radicalii de asparagină din poziţiile78 şi 118, iar lanţul β leagă un glican la poziţia 19, iar gruparea glucidică conţine:manoză, galactoză, fucoză, glucozamină [21].

Analizele moleculare au permis subdivizarea regiunii HLA clasa II în maimulte subregiuni [29].

Regiunea genelor din complexul MHC care codifică pentru moleculeleclasei a II-a, denumită HLA-D, codifică de fapt pentru mai multe tipuri de


34

molecule care au toate aceeaşi structură, deşi există considerabile diferenţebiochimice între moleculele controlate de cele trei subregiuni DP, DQ, DR. Suntexprimate selectiv pe suprafaţa limfocitelor B, monocitelor şi macrofagelor, pe altecelule prezentatoare de antigen, pe limfocitele T activate, în special pe cele Tajutătoare, pe celulele epiteliului timic. Lipsesc pe precursorii limfocitari B, apar pesuprafaţa limfocitelor B imunocompetente aproape simultan cu moleculele deimunoglobulină pentru ca să dispară pe plasmocite.

Exprimarea lor este activată de anticorpi anti-imunoglobulină, de IL-4 careacţionează la nivelul transcripţiei genelor şi este inhibată de IFN-γ care blocheazăefectul activator al IL-4 [21].

Antigenele complexului major de histocompatibilitate clasa II au un rolbine definit în restricţiile interacţiilor celulă � celulă în timpul răspunsului imun.Rezultatele studiilor sugerează că antigenele HLA II pot induce direct proliferareacelulară în absenţa activării policlonale. Legarea antigenelor fie a lui DR, fie a luiDP fac posibilă proliferarea celulară [17].

Citokine implicate în mecanismele inflamatoriiInterleukina 1 (IL-1) este produsă de celulele din seria monocite-

macrofage, dar şi de keratinocitele tegumentare, de celulele endoteliale, gliale,dendritice, NK (natural killer) [31]; este o glicoproteină transmembranară, cugreutatea moleculară de 17.5 kDa, rezistentă la temperatura de 56oC şi la pH 2-9,dar este sensibilă la acţiunea pronazei, chemotripsinei si tripsinei. Molecula are încompoziţie circa 30% carbohidraţi şi se găseşte sub două forme, care, deşi suntprodusul unor gene diferite, se leagă de acelaşi receptor: IL-1α, cu 159 resturi deaminoacizi şi IL-1β, proteina globulară cu 153 resturi de aminoacizi. Majoritateamoleculelor IL-1α rămân în celulă, fiind active numai în cazul contactului celulă-celulă, în timp ce moleculele IL-1β sunt eliberate extracelular sub formă de precursoricu greutate mare (36 kDa) şi scindate de proteaze în molecule de 17 kDa.

Sinteza IL-1 este realizată de numeroase tipuri de celule aflate sub acţiuneaunor factori inductori dependenţi sau independenţi de antigen. Din prima categoriefac parte contactele intracelulare realizate de moleculele de adeziune după stimulantigenic, citokinele eliberate de limfocitele T activate, IL-1 exogenă, etc. În adoua categorie intervin unele iritaţii celulare provocate de virusuri, bacterii sau altecitokine (TGFβ, TNFα, GM-CSF, etc.)

Sinteza este inhibată sau diminuată de către prostaglandine (PGE2),interferoni, corticoizi, IL-4, IL-6, IL-10, histamină, ciclosporină, etc.

După legarea de receptorul celular specific, IL-1 declanşează transmitereaintracelulară a diferitelor semnale ca: activarea proteinkinazelor, creşterea niveluluiintracelular de cAMP care activează factorul nuclear stimulator pentru limfociteleB ce se fixează la DNA, activarea PLC legată la fosfatidil-etanol-amină, acalmodulinei, şi exprimarea genelor c-fos, c-myc, c-jun, etc [21].


35

Interleukina 2 (IL-2) este un factor solubil produs de către limfocitele Tstimulate cu antigene, aloantigene sau mitogene. Molecula are greutate de 15 kDacu 133 resturi de aminoacizi. Sinteza acestei glicoproteine cu rol de "hormonimunologic" este sub controlul unei gene localizate pe cromozomul 4 şi esteasociată cu exprimarea concomitentă a receptorului pentru ea (IL-2R) pe suprafaţamembranei plasmatice a celulei care o sintetizează. Activitatea de sinteză are loc înprimele 4 ore după stimulul antigenic, continuă ascendent până în ziua a 3-a, dupăcare începe un declin cu încetarea sintezei la 5-8 zile de la stimul. Sinteza maximăa IL-2 ar avea loc între 2-5 zile, cu implicarea unor enzime şi metaboliţi aiinozitolfosfatului în interdependenţă cu nivelul citoplasmatic al Ca2+. Este inhibatăde către ciclofosfamidă, cortizon, ciclosporina A, fosfolipaza A2, prostaglandinaE2, etc. şi activată de IL-1, IFN, GM-CSF şi alte citokine.

În afară de limfocitul Th(CD4+) care este şi principalul ei producător, IL-2este sintetizată în cantităţi mici şi de limfocitele T supresoare/citotoxice (CD8+) şipoate de celulele NK [21].

Interleukina 6 (IL- 6) este o glicoproteină cu greutatea moleculară de~ 21 kD şi cu 184 de resturi de aminoacizi cu două situsuri de N- glicozilare şi cudouă punţi disulfidice.

Este produsă de către o mare varietate de celule printre care şi keratinociteşi acţionează asupra a diferite celule ţintă. Este implicată în diferenţierea celuleleorB, sintezei proteinelor de fază acută, proliferarea şi diferenţirea limfocitelor T,promovarea creşterii celulelor mielom, sinteza IL-2 şi exprimarea receptorilorpentru IL-2.

Receptorul pentru IL-6 este exprimat pe suprafaţa celulelor T în repaus, acelulelor B lipsite de IgD pe membrană, pe celulele mielom etc. Receptorul este undimer cu GM = 80 kDa, din familia imunoglobulinelor care, printr-un lanţpolipeptidic adiacent la o glicoproteină (gp 130) ar transmite semnale intracelular.

De aceea această limfokină este implicată în patogeneza unor boli în carenivelul seric al ei este crescut: anomalii policlonale B, boli autoimune de genulartritelor reumatoide, cirozelor hepatice, boli proliferative ca psoriazis sau uneleneoplazii ca plasmocitoame, mieloame, limfoame, leucemii, carcinoame [21].

Creşterea nivelului de exprimare al IL-6 este observată în multe tumorisolide şi în leziuni hiperproliferative (şi glucocorticoid-supresabile) ale psori-azisului. IL-6 sporeşte proliferarea keratinocitelor dar inhibă linia celularăcarcinomatoasă ZR-75-1 şi T-47D [13].

Studii recente au arătat că tegumentul şi în particular tegumentul rănitreprezintă un situs major al producţiei de interlukină-6 (IL-6). Marcajul reglăriigenei interleukinei-6 este indusă de inflamaţiile asociate citokinelor, produşilorbacterieni, infecţiilor virale, şi activarea oricărei din cele trei căi majore alesemnalului de transductie (diacilglicerol- cAMP şi Ca2+ activat) [26]. Exprimarea înexces a IL-6, IL-10 şi TNF-alpha a fost întalnită în limfoamele cutanate culimfocite B. Această exprimare în exces a citokinelor IL-6 şi IL-10 în limfoame


36

primare cutanate cu celule B pot avea o importanţă particulară întrucât acestecitokine sunt considerate a fi suportul creşterii celulelor B [4].

Aplicaţii ale tehnologiei biomoleculare în diagnosticul tumoralMetoda: PCR Polimerase Chain Reaction a fost inventată de către Mullis şi

colaboratori la Cetus Corporation în anul 1985 [19] , deşi principiul metodei fusesedescris în detaliu de Khorana şi colaboratori cu un deceniu anterior [11, 22].

Aplicaţia tehnică constă în producerea unui număr foarte mare de copii(220) ale unei secvenţe specifice de DNA; amplificare până la nivel detectabil.

Aplicaţiile practice constau în recunoaşterea unor secvenţe în scop dediagnostic, obţinerea unei anume gene, în scopul realizării profilului de restricţie(RFLP); obţinerea unui fragment DNA, în scopul realizării unei construcţii genice.

Componentele biologice pe care se realizeaza PCR sunt:DNA genomic, DNAc provenit din reverstranscrierea mRNA (RT-PCR),

DNA plasmidic.DNA-ul genomic este diferit de DNA-ul plasmidic deoarece primul dă un

număr mic de copii ale secvenţei de amplificat spre deosebire de cel plasmidic caredă un număr mare de copii.

Partenerii de reacţie sunt:1) Catena DNA care poate fi genomic, plasmidic, DNAc "matriţa" sau

master- conţinând secvenţa de interes.2) Scurte fragmente DNA complementare extremităţilor 5' şi 3' ale

secvenţei de interes (de amplificat) primeri.3) DNA-polimeraza ---- Taq polimeraza izolată din Termophylus aquaticus4) dNTP deoxinucleotidetrifosfat: dATP, dGTP, dTTP şi dCTP.Mediul de reacţie este o soluţie tampon ce conţine MgCl2 (volum total

50µl).Reacţia de amplificare genică în lanţ, mediată de DNA polimeraza (Taq-

polimeraza) [5].a) amplificarea genică prin sinteză bilaterală (cu ajutorul unei perechi de

amorse de reacţie: sens- antisens)

produsul de reacţie (220 copii)


37

b) amplificarea genică prin sinteză unilaterală (cu ajutorul unei perechi deamorse dintre care o amorsă este în exces)

amorsă"sens" în exces

c) "Nested" PCR (reacţie PCR care are loc prin intermediul a două perechide amorse). Această reacţie reprezintă cel mai performant mijloc de diagnostic prinamplificare genică.

Metoda : RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) constă înstabilirea polimorfismului electroforetic al lungimii fragmentelor DNA rezultateprin digestia cu endonucleaze a unui fragment DNA "ţintă".

Fragmentul DNA "ţintă" supus digestiei enzimatice poate fi o moleculăcromozomală separată ori un produs PCR (LCR) sau de simpla hibridare.

produs de reacţie 220 copii

Reacţie generată de I-a perechede amorse

Reacţie generată de a II-apereche de amorse

Produs final de reacţie 240

copii


38

Analiza mutaţiilor apărute în tronsonul genic HLA-DR prinmetoda PCR-RFLP

Una dintre cele mai folosite tehnici pentru detectarea genelor sau amarkerilor genetici este PCR-RFLP (Polimerase Chain Reaction - RestrictionFragment Length Polymorphism). În mod tradiţional această tehnică implicădigestia enzimatică pentru aproximativ 5µg de DNA genomic amplificat prin PCR,urmată de electroforeză sau Southern blot [15]. Folosirea reacţiei PCR face posibilăamplificarea unei regiuni scurte din DNA în apropierea unui situs specific de accesal unei endonucleaze cunoscute. DNA amplificat este separat şi vizualizat în UVdirect pe gel de agaroză conţinând bromură de ethidium.

Gel de agaroză (bromura de ethidium)

Digestie enzimatică

Separare electroforetică

marker proba 1 proba 2

DNA

1 2 3 4


39

Selecţia şi amplificarea primelor (amorselor de reacţie)

Pentru realizarea PCR-RFLP a fost necesară cunoaşterea secvenţei DNAdin jurul situsului de restricţie al enzimei Alu I. În scopul analizei RFLP este dedorit să existe o distanţă scurtă între primeri, distanţa ideală fiind 100-200 bp, iarsitusul de restricţie să fie situat aproximativ central. Aceste condiţii au fost strictrespectate.

Protocolul standard de PCR a cuprins 30 cicluri de amplificare, suficientpentru a produce o bandă puternică pentru o singură secvenţă în 50 ng de DNAgenomic.

Digestia cu endonucleaze de restricţie

În cele mai multe cazuri se ia o parte din DNA amplificat şi se adaugăenzima de restricţie care recunoaşte specific anumite situsuri din secvenţa de DNA,apoi se separă şi se vizualizează cum s-a descris anterior prin electroforeză. EnzimaAlu I folosită în aceste experimente nu a fost compatibilă cu soluţia tampon tipPCR, fiind necesară purificarea fragmentelor de DNA amplificate anterior digestieiprintr-o metodă modernă de afinitate la granule de sticlă (Glass beads). S-a evitatdigestia parţială care ar fi condus la apariţia de probe false, apărând aspecteheterozigote pentru situsul de restricţie în cauză. Această tehnologie de diagnosticimplica folosirea de probe DNA de control provenite de la indivizi homozigoţi şiheterozigoţi pentru gena studiată.

Electroforeza în gel

Fragmentele DNA cu talia moleculară cuprinsă între 10 bp si 2 kb pot fiuşor separate într-un gel de agaroză de concentraţie corespunzătoare. De exempluîntr-un gel de 6% se pot separa fragmente cu talia moleculară cuprinsă între 56 bpşi 64 bp. În cazul de faţă un gel de 2% sau de 3% a fost suficient pentruvizualizarea fragmentelor cu talia moleculară cuprinsă între 50 bp până la 500 bp.În unele cazuri când a fost necesară o rezoluţie foarte înaltă de separare afragmentelor de DNA s-au folosit geluri de poliacrilamidă nedenaturate.

Bromura de ethidium (EtBr) poate fi adaugată în gel la o concentraţie de1µg/ml sau gelul poate fi colorat dupa migrarea electroforetică cu EtBr şi vizualizatîn UV. De asemenea se foloseşte un marker care va confirma mărimea corectă abenzii amplificate [16].

Aspectul electroforetic al DNA izolat din sângele periferic oferă informaţiide ordin cantitativ despre concentraţia DNA. De asemenea poate fi măsuratădensitatea optică DO260 a DNA, o unitate de absorbanţă indică în proba respectivă ocantitate de 50 µg DNA dublu catenar şi/sau 37 µg DNA monocatenar.

Gradul de puritate DNA într-o probă se apreciază în funcţie de valoarearaportului: λ260 = 1.8 ~ 2

λ280


40

Figura 1. Electroforeza în gel de agaroză 1%a DNA izolat din sange periferic:(1) 500 ng/µl DNA; (2) 1000 ng/µl;(3) 400 ng/µl; (4) 200 ng/µl;(5) 100 ng/µl DNA.

Figura 1 prezintă imagineaelectroforezei dată de DNA izolat dinsângele periferic prin liza celulelor şidegradarea totală a proteinelor cu proteinazăK (10mg/ml), urmată de precipitareaproteinelor cu NaCl 6M şi apoi precipitareaDNA-ului cu etanol absolut. Tamponul demigrare al electroforezei este TBE (Tris-Borat-EDTA) 0.5x.

Acest tip de analize a permisidentificarea mutaţiilor apărute în tronsonulgenic HLA-DR, la doi din cei şase pacienţi studiaţi. Profilul electroforetic derestricţie a fost diferit în tumoră faţă de profilul expus de DNA extras din sângeleperiferic.

La carcinoamele cutanate bazocelulare nu se identifică modificări HLA.Carcinoamele bazocelulare sunt agregate de celule tumorale superficiale careseamănă macrostructural cu bulbii piloşi. Organizarea acestor celule poate fi subformă de coloane, cordoane sau cuiburi de celule bazale. Epidermul ca structură nueste deranjat în mod semnificativ şi nici nu există interferenţe structurale întreformaţiunile tumorale adiacente. Unele celule carcinomatoase cresc şi din epiteliilefoliculare. Foarte rar foliculii care mărginesc un carcinom bazocelular apardisplazici şi sunt predispuşi transformării maligne.Tot rar se întâmplă ca tumorilebazocelulare să aibă origine în leziunile de actinită keratozică.

Cele mai des întâlnite forme de carcinom bazocelular sunt acelea cuextindere radială clar delimitată, capabile să inducă reacţii stromale imunologice şichiar să stimuleze formarea unei strome de care se separă printr-o crevasă.Aspectul general este acela de cuiburi ataşate epidermului. Citologic există douăgrade de diferenţiere a carcinoamelor bazale:

a) bine diferenţiate, când au stroma fibro-mucioasă, celularitate redusă,infiltrat limfocitar rezervat şi

b) slab diferenţiate, când stroma este inflamată şi prezintă ţesut fibroslaminat [23].

În ambele cazuri apare o mică crevasă cu mucus, separând tumora destroma inflamată, semnificând benignitatea leziunii. În cadrul carcinoamelorbazocelulare diferenţiate există o accentuare deosebită a fenomenului de moarte


41

celulară programată (nuclei picnotici, condensarea cromatinei perinuclear) faptcare conferă un scor şi mai ridicat prognosticului, în timp ce tumorile bazocelulareslab diferenţiate şi prezentând mitoze sunt considerate mai agresive [28].

La niciunul dintre pacienţii investigaţi care prezentau carcinom bazocelularnu au apărut modificări în structura genică a alelelor HLA, în schimb s-a observatcă modificările HLA apar numai la pacienţii cu tumori spinocelulare, iar eficienţatratamentelor de tip imunologic, în acest caz este dependentă de mutaţiile apărutela nivel local în blocul genic HLA.

PCR-SSP � reacţii de polimerizare în lanţ cu amorsare desecvenţă specifică

Folosirea unor secvenţe specifice de primeri este bazată pe observaţia că oamplificare enzimatică apare doar când capatul 3' al primerului este complementarcu secvenţa ţintă. Alelele individuale sau grupuri de alele sunt diferenţiate deamplificarea produsului PCR specific. Astfel, primerii sunt aleşi în aşa fel caamplificarea să se realizeze în prezenţa alelelor ţintă individuale sau de grup(Figura 2). Această metodă a fost concomitent dezvoltată de mai multe grupuri şi,astfel, apare sub diferite nume şi prescurtări cum ar fi ASA (allele � specificamplification), PASA (PCR amplification of specific alleles) sau ARMS(amplification refractory mutation system). Ca matriţă PCR este folosit DNA-ulgenomic. Ulterior produsul obţinut după reacţia PCR serveşte ca matriţă pentrudiferenţierea alelelor � specifice PCR [31].

PCR-ul este o realizare majoră în analiza DNA şi RNA pentru căsimplifică atât tehnologia existentă dar permite şi dezvoltarea rapidă de noi tehnicicare nu ar fi fost altfel posibile [16].

Figura 2. SSP-PCR reacţie polimerazică în lanţ, întrepătrunsă test de înaltă rezoluţie.

fragment I

3

fragment II210 copii

210 copiiDNA

bicatenar

4

2

1mutaţie

1, 2: primeri externi3, 4: primeri interni


42

Identificarea configuraţiei antigenice a HLASerologic

Pentru diagnosticarea in vitro a antigenelor HLA pentru testul delimfocitoxicitate se folosesc pl[ci de microtitrare cu serul anti-HLA gata aplicat îngodeuri.

Principiul testului:Serurile anti-HLA reacţionează cu antigenele limfocitare corespunzătoare.

Adăugarea complementului modifică membrana celulară a limfocitelor astfel încâteozina poate pătrunde în celule, modificându-le culoarea (reacţie pozitivă).Limfocitele care nu reacţioneză nu se colorează (reacţie negativă).

Izolarea limfocitelor T şi B se realizează prin amestecarea a cca 5 ml sângeheparinizat proaspăt recoltat cu acelaşi volum de soluţie Hank. Se pune într-un tubLimfoflot şi se adaugă aceeaşi cantitate de probă diluată, în aşa fel încât să nu seamestece cele două soluţii, după care se centrifughează la 2800 rpm (1000 x g)timp de 20 min. Limfocitele se sedimentează sub forma unui inel alb, la limitadintre plasmă şi Limfoflot. Se extrage inelul celular, se pune într-o eprubetă ceconţine soluţie Hank şi se spală limfocitele de două ori; centrifugare la 1000 rpm(150 x g). Se aduc limfocitele la 2000-3000 celule/µl cu limfostabil. Limfocitele Tse utilizează pentru determinarea HLA-ABC, iar limfocitele B pentru determinareaHLA-DR.

Imunologic

Susceptibilitatea faţă de fenomenele de proliferare celulară tumoralăprecum şi reacţiile pacienţiilor în cauză la imunoterapie sunt frecvent asociate cudistribuţia alelelor HLA I şi/sau II. În cazul pacienţilor cu melanom, naturarăspunsului imun a fost clarificată o dată cu descoperirea peptidelor derivate dinantigenele tumorale sau asociate tumorilor.

Nu s-a găsit o asociere între răspunsul anticorpului la antigenul HLA şiapariţia cancerului de piele în cazul transplantaţilor renal. Asocierea cu HLA-DR 7indică un control genetic al dezvoltării sau regresiei cancerului cutanat, implicândgenele din regiunea clasei II a complexului major de histocompatibilitate [4].

Reacţia de polimerizare în lanţ folosită este o metodă foarte sensibilă deamplificare a probelor de DNA chiar în câteva minute. Prin această metodă se potamplifica uneori şi urmele care contaminează probele de DNA conducând la unrezultat fals pozitiv sau la rezultate care nu pot fi interpretate. O sursă importantăde contaminare a probelor este DNA amplificat care vine în contact cu DNA încăneamplificat. Chiar şi picături mici de DNA amplificat din aer (amplificate cu altăocazie şi vaporizate), conţin suficiente copii ale moleculelor ţintă carecontaminează alte probe. Pentru a evita asemenea contaminări încrucişate se separăpregătirea probelor de DNA ce urmează a fi amplificate în laboratoare diferite, pre-PCR (P1- protecţie de gradul 1) şi post-PCR (P2- protecţie de gradul 2).


43

a. Activitatea pre-PCR � constă în prepararea şi păstrarea soluţiilor tamponnecesare pentru extracţia DNA din sânge şi amplificarea lui prin PCR. Acest tip deactivitate implică întreaga tehnologie de extracţie a DNA-ului.

b. Activitatea post-PCR - este reprezentată prin toate procedurile post-PCR inclusiv electroforeza în gel de agaroză şi interpretarea rezultatelor.

Tipizarea DNA permite obţinerea de informaţii de mare acurateţe asupraalelelor HLA. Deşi puţine studii privesc complexele HLA II-DRB1, -DQA1, şi �DQB1, se menţionează din ce în ce mai des că alela DQB1-0301 este elementdeterminant pentru malignizarea melanoamelor.

Alela HLA-DQB1* 0301 poate fi utilă în cercetarea clinică a pacienţilor cumelanom. Pentru determinarea prezenţei sau absenţei HLA-DQB1* 0301 genomics-a preferat metoda SSP-PCR care este mai rapidă, neradioactivă şi foloseşte sângeintegral ca substrat, faţă de metoda SSO (sequence specific oligonucleotide)-PCRcare este radioactivă şi implică utilizarea de radioizotopi [14].

Peptidele derivate din diferenţierea antigenelor melanocitelor au fostidentificate ca ţinte pentru limfocitele T citotoxice CTL în melanomul uman.

Teste imonohistochimice au dat informaţii despre intensitatea şimicroheterogenitatea expresiei antigenului care nu poate fi detectat prin analizamRNA la nivel molecular deoarece evită recunoaşterea lor de către limfocitele Tcitotoxice [10].

Oncogenele şi alţi markeri moleculari tumorali care prezic agresivitateatumorală pot permite individualizarea şi optimizarea terapiei chirurgicale amelanomului. Au fost examinate exprimările unor markeri cum sunt antigenulHLA-DR, proteina de şoc termic HSP-70 (heat shock protein-70) şi oncogene c-myc în melanomul primar şi nodulii regionali. Aceste proteine nu sunt corelate cuprezenţa unor noduli metastazici [12].

S-a comparat prezenţa alelelor HLA clasa II cu anumite tipuri histologicede melanom (melanomul lentiginos, melanomul nodular, melanomul superficialdiseminat şi melanomul malign), găsindu-se o asociere între alelele DR5 şimelanomul superficial diseminat. Acest rezultat confirmă observaţiile lui Muller-Eckhardt (1984) şi în cazul populaţiei caucaziene româneşti, întărind ideea căexistă diferenţe de etiopatologie după criterii etnice. Analizând datele prezentate înTabelul 2 se poate uşor observa că alela DRB1*0802 este prezentă în genotipulromânesc în cazul tuturor tipurilor de melanoame luate în studiu.

Din punct de vedere statistic se remarcă prezenţa constantă la toţi indiviziia alelelor: DRB1*1602,DRB1*0403, DRB1*1302, si DRB1* 0901 (Tabelul 2).Acest profil parţial ar putea fi considerat specific genotipului populaţionalcaucazian din România, frecvenţa alelelor depăşind procentul de 80 %.


44

Tabelul 2 � Frecvenţa alelelor HLA-DR la pacienţi cu melanom

Alele HLA-DR Control � voluntari sănătoşi clinic Pacienţi cu melanom % n = 6 n = 6 global

DRB1*0101 3 1 33DRB1*1501 6 4 83DRB1*1502 2 2 33DRB1*1602 6 5 91DRB1*0401 1 2 33DRB1*0403 6 4 83DRB1*0405 3 3 50DRB1*0406 4 2 50DRB1*0410 5 3 66DRB1*1101 2 4 50DRB1*1202 1 2 25DRB1*1302 6 6 100DRB1*1402 4 4 66DRB1*1406 3 1 33DRB1*0802 3 6 75DRB1*0803 4 2 50DRB1*0901 6 5 91DRB1*1001 1 0 8DRB1*0408 2 2 33DRB1*1102 0 0 0DRB1*1301 3 2 41DRB1*1305 1 3 33

În Tabelul 2 s-a realizat şi un calcul estimativ privind repartiţia alelelorHLA-DR pe întregul lot de 12 persoane (sănătoase clinic şi cu melanom), fiind maiuşor de apreciat frecvenţa globală a fiecărei alele. Astfel s-a constatat că anumitealele pot constitui baza unui profil caracteristic al populaţiei din România.

Analiza HLA-DR (Figura 3) s-a realizat amplificând DNA genomic prinreacţii SSP-PCR.

Identificarea configuraţiei genice a sistemului HLAMetodologia moleculară utilizată este bazată pe reacţia polimerazică în lanţ

(PCR). Tehnic, metoda constă în analiza prin reacţii de polimerizare în lanţ de tipSSP-PCR (sequence specific priming), şi tipare HLA secvenţială pentru alelelemenţionate. Reacţia se petrece cu amorsarea specifică a secvenţei de DNAutilizând amorse (primeri) selective pentru tronsoanele genice ale exonilor 1 şi 2,


45

permiţând analiza alelică HLA-I în 95 de variante şi HLA-II în 24 de variante(Figura 3).

În vederea realizării reacţiei PCR s-a izolat DNA genomic prin extracţie cuamestec fenol-cloroform urmată de deproteinare cu un amestec de pronazăE/proteinază K şi digestia RNA cu RN-aza A. Fiecare reacţie PCR a cuprins:250 ng DNA genomic, 200 µM din fiecare nucleotidă (dATP, dCTP, dTTP,dGTP), 1 µM din fiecare amorsă (primer) de reacţie, 2U Taq polimerază(Fynnzyme) într-un volum final de soluţie tampon de reacţie conţinând: 10 mMTris-HCl pH 8.7, 50 mM KCl 0,01% gelatină şi 0,02% Nonidet P 40. Aceastămixtură de reacţie a fost supusă la 37 cicluri de amplificare într-un termo-amplificator Biometra Uno-II. Fiecare ciclu termic de amplificare este compus dintrei categorii de etape: denaturare DNA la 96 oC, 1 min, hibridizarea primerilorîntre 54 oC - 60o C 1 minut, extinderea primerilor 2 minute la 72 oC. Între etapelede acest tip s-au interpus şi cicluri termice unice în care temperaturile dehibridizare a primerilor au crescut graduat: respectiv la 56 oC, 58 oC şi ultima, de60 oC. Produsul de reacţie a fost separat prin electroforeză în gel de agarozăconţinând bromură de etidium şi vizualizat în UV. Reacţiile PCR s-au realizatfolosind truse Pel-Freez (Canada).

În Figura 3 se prezintă criteriile de diagnostic HLA-DR cuprinse într-unpanel de 24 de reacţii SSP-PCR. Se observă că fiecare godeu al gelului arată obandă de control cu excepţia liniei 24 care este banda de control negativă. Grupulde alele amplificate se găsesc pe liniile 3, 16, 22 şi 23, restul fiind negative. Taliamoleculară a fragmentelor amplificate este cuprinsă între 170pb şi 235pb.

Alele amplificate se găsesc pe liniile: 3, 16, 22 şi linia 23. Primeriineutilizaţi formează o bandă difuză care migrează în front.

În sprijinul acestei metodologii s-a întocmit fotografia gelului de agaroză(EtBr) în care s-au separat fragmentele de DNA amplificate.

Figura 3. Profilul electroforetic alproduşilor de reacţie SSP-PCR(Sequence Specific PrimingPolymerase Chain Reaction)obţinut prin amplificarea aleleorHLA-DR.

Amplificare specifică pe liniile 3, 16,22, 23, restul reacţiilor fiind negative.

HLA-DR 7 1 alelaHLA -DR 15 (2) 8 aleleHLA-DR 16 (2) 6 aleleHLA-DR 4 23 aleleHLA-DR 9 1 alelaHLA-DR 53 5 alele


46

Există o diferenţă în distribuţia tisulară a antigenelor de clasa I şi II, la omantigenele de clasa II sunt exprimate şi pe limfocitele T activate. Dar, atât la om câtşi la alte specii, antigenele MHC intră în componenţa complexului trimolecularreceptor pentru antigen + antigen + MHC realizând recunoaşterea epitopului decătre limfocitul T "sub restricţie MHC". Ele conferă statutul de "reactant"diferiţilor indivizi faţă de un anumit antigen şi participă efectiv la selecţia pozitivăşi negativă a limfocitelor.

În afară de importanţa cunoştinţelor fundamentale privind rolul biologic alsistemului MHC, acestea au şi aplicaţii practice, în sensul precizării asocierii lui cuunele boli [21].

AcknowledgementThis work was supported by the grand CNFIS 41891/1999-cod 213.

Lista de abrevieri

CTL = limfocite T citotoxiceGM-CSF = factor de stimulare a coloniilor de granulocite- macrofageHLA = antigene leucocitare umane (Human Leukocyte Antigens)IFN-γ = interferon-γMHC = complexul major de histocompatibilitatePCR = Polymerase Chain Reaction � reacţie polimerazică în lanţPGE2 = prostaglandinePCR-RFLP = Polimerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length

PolymorphismRT-PCR = PCR-reverstranscriptazaSSP-PCR = sequence specific primingTGF-β = transforming growth factorTNF-α = factorul de necroză tumorală

Bibliografie

1. H.F. ABTS, T. WELSS, A. MIRMOHAMMADSADEGH, K. KOHRER, G.MICHEL, T. RUZICKA - J. Mol. Biol. 293 : 29-39 (1999)

2. K. ABBAS ABUL, H. ANDREW LICHTMAN, S. JORDAN POBER.- Cellularand Molecular Immunology, 2nd ed.:231-232, (1994)

3. K. ASADULLAH , S. GELLRICH , A. HAEUSSLER-QUADE , M.FRIDRICH, W.D. DOCKE, S. JAHN, W. STERRY - Exp.Dermatol., 9: 71-76(2000)

4. J.N. BAVINCK, L. GISSMANN, F.H. CLAAS, F.J. VAN DER WOUDE, G.G.PERSIJIN, J. TER SCHEGGET, B.J. VERMEER, I. JOCHMUS, M.MULLER, G. STEGER, et. al. - J. Immunol., 151: 1579-1586 (1993).


47

5. B. ALBERTS, D. BRAY, J. LEWIS, M. RAFF, K. ROBERTS, J. D.WATSON.Molecular Biology of the Cell, 3th ed.Garland Publishing, Inc. 291-318 (1994).

6. R.D. CAMPBELL, J. TROWSDALE - Immonol.Today, 14: 349-352 (1993)7. M. CUMBERBATCH, C.E. GRIFFITHS, S.C. TUCKER, R.J. DEARMAN, I.

KIMBER - Br.J.Dermatol., 141: 192-200 (1999).8. A. GANDARILLOS, L.A. GOLDSMITH, S. GSCHMEISSNER, I.M. LEIGT,

F.M. WATT - Exp.Dermatol., 8: 71-79 (1999).9. C. GUTIERREZ-STEIL, T. WRONE-SMITH, X. SUN, J.G. KRUEGER, T.

COVEN, B.J. NICKOLOFF - J.Clin.Invest., 101 : 33-9 (1998).10. E. JAGER, M. RINGHOFFER, M. ALTMANNSBERGER, M. ARAND, J.

KARBACH, D. JAGER, F. OESCH, A. KNUTH - Nt J.Cancer, 71 : 142-147(1997).

11. K. KLEPPE, E. OHSTUKA, R. KLEPPE, L. MOLINEUX, H.G. KHORANA -J. Mol. Biol., 56, 341 (1971).

12. M.M. KONSTADOULAKIS, M. VEZERIDIS, E. HATZIYIANNI, C.P.KARAKOUSIS, B. COLE, K.I. BLAND, H.J. WANEBO - Ann.Surg.Oncol., 5:253-260 (1998).

13. J. KRUEGER, A. RAY, I. TAMM, P.B. SEHGAL - J.Cell.Biochem., 45 : 327-34 (1991).

14. M. LU, W.A. THOMPSON, D.A. LAWLOR, J.D. REVEILLE, J.F. LEE - J.Immunol. Methods, 199 : 61-68 (1996).

15. T. MANIATIS, E. FRITSCH, J. SAMBROOK (ed.): Molecular Cloning: ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY (1982).

16. M.J. MCPHERSON, P. QUIRKE, G.R. TAYLOR. - PCR A PracticalApproach, Oxford University Press, 21-23 (1993).

17. N. MOONEY , D. CHARRON - Internat. J. Immunopathol. Pharma., 1: 51-56,(1988).

18. I. MORARU, Imunologie, Editura Medicală, Bucureşti, 376 (1984)19. K. MULLIS, F. FALOONA - In Methods in enzymology, 155, ed.R.Wu,

Academic Press, New York, 335 (1987).20. M.I. NISHIMURA, D. AVICHEZER, M.C. CUSTER, C.S. LEE, C. CHEN, M.R.

PARKHURST, R.A. DIAMOND, P.F. ROBBIMS, D.J. SCHWARTZENTRUBER,S.A. ROSENBERG - Cancer Res., 59 : 6230-6238 (1999).

21. A. OLINESCU - Imunologie, Editura didactică şi pedagogică Bucureşti, 278-279, 158-173, 280-288 (1995).

22. A. PANET AND H.G. KHORANA - J. Biol. Chem., 249, 5213-21 (1974).23. R.J. REED In Hartmann W. (ed): New Concepts in Surgical Pathology of the

Skin.New York, John Wiley& Sons, 116 (1976).24. S.L. ROBBINS, V. KUMAR , R.S. COTRAN - The Skin, Pathologic Basis of

Disease, 5th ed., W.B.Saunders Company, 1173 (1994).


48

25. T. SATO, T. IWAI, T. SAKAI, H. SATO, M. SEIKI, Y. MORI, A. ITO, - Br.J.Cancer, 80: 1137-43 (1999).

26. P.B. SEHGAL - J.Invest.Dermatol., 94: 2S-6S. (1990).27. C.H. Smith, M.H. Allen, R.W. Groves, J.N. Barker - Br.J.Dermatol., 139: 239-

46 (1998).28. S.G. SILVERBERG. Principles and practice of surgical pathology, vol.1

Churchill Livingstone Inc., 169-170, (1988).29. J. TROWSDALE - Br.Med.Bull., 43: 15-36, (1987).30. K.B. VASUNIA, M.L. MILLER, A. PUGA, C.S. BAXTER - Carcinogenesis,15 : 653-60 (1994).

31. R. WASSMUTH - Biotest Bulletin, 5: 539-551 (1997).32. G. ZARNEA, GR. MIHĂIESCU - Imunologie, Editura Universităţii Bucureşti,

82-91, 158-161 (1995).

analiza molecular a a alelelor hla

Documents