prezentare elisa pcr

Tehnica ELISA

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

Biochimie Medicina dentara

•Ce este ELISA?

•Tipuri

•Aplicatii

•Principiu

ELISA

Biochimie Medicina dentara

ELISA

Biochimie Medicina dentara

Ce este?• Evaluarea prezentei si concentratiei anticorpilor si antigenilor dintr-o proba

• Primele studii au fost facute in 1971 folosita pentru screeningul HIV

• O tehnica biochimica folosita in special in imunologie

• Primul si cel mai comun test folosit pentru detectarea unui patogen dintr-o proba

• Avantaje - sensitiva (0.01-10ng/ml) - cantitativa - reproductibila - format de kit

ELISA

Biochimie Medicina dentara

Tipuri • ELISA Calitativa- rezultatele sunt pozitive sau negative

• ELISA Cantitativa- densitatea optica a probei este comparata cu un standard

• ELISA - indirecta - competitiva - sandwich (directa)

ELISA

Biochimie Medicina dentara

Aplicatii • Evaluarea cantitativa/calitativa a anticorpilor si antigenilor dintr-o proba

• Medicina: metoda de diagnostic - HIV, holera, boli venerice, gripa aviara sau porcina, hormoni (sarcina)

• Industria alimentara: detectarea alergenilor din mancare lapte, alune, oua

• Toxicologie: detectarea drogurilor

• Cercetare

ELISA

Biochimie Medicina dentara

Principiu •Ce este un antigen? •Ce este un anticorp?

Anticorp

Antigen

Epitop

•Enzyme-linked immunosorbent assay: numele sugereaza 3 componente

Anticorp - permite detectia analitului de interes Faza solida - suportul unde are loc adsorbtia Enzima - determina schimbarea de culoare-semnalul

ELISA

Biochimie Medicina dentara

Primul anticorp

Antigenul

Al doilea anticorp conjugat cu enzima

ELISA-sandwich direct

Principiu

2

1

3

ELISA

Biochimie Medicina dentara

Principiu

substrat

produs

standard

proba

Tehnica PCRPolymerase Chain Reaction

Biochimie Medicina dentara

PCR

•Ce este PCR?

•Tipuri

•Aplicatii

•Principiu

Biochimie Medicina dentara

PCR

Ce este?

Biochimie Medicina dentara

• Polymerase Chain Reaction (Reactia in lant a polimerazei)

• Mullis & Faloona – Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction, 1987

• Mullis: Premiul Nobel, Chimie, 1993

• Amplificarea cu ajutorul unei enzime (ADN-polimeraza) a numărului de copii ale unei regiuni specifice dintr-un lanţ ADN

Kary Mullis

PCR

Tipuri

Biochimie Medicina dentara

• Exista multe variatii ale acestei tehnici: long PCR, late PCR in situ PCR, colony PCR, single cell PCR

• Cele mai folosite:

- standard PCR- RT-PCR ( real-time)

PCR

Aplicatii

Biochimie Medicina dentara

•Testarea unor mutatii (ex.: fibroza chistica, gene tumorale)

•Testare prenatala (si screening preimplantare)

•Infectii virale (HIV), bacteriene (BK)

•Teste de histocompatibilitate

•Medicina legala

•Teste de paternitate

•Identificarea de persoane

•Cladistica

clade

PCR

Principiu

Biochimie Medicina dentara

Materiale

•ADN de amplificat: Sange, Sperma, Par, Periuta de dinti, Insecte (in chilhlimbar), Mumii, Amprente, Urina

•Primeri (oligonucleotide, amplimeri) : 20-30 de dezoxiribonucleotide complementare extremitatilor 5’ sau 3’ ale fragmentului de amplificat

•ADN-polimeraza : enzima care catalizeaza polimerizarea dTNP in catene ADN (elongarea primerilor)

•dNTP (dezoxiribonucleotid trifosfati)

•Solutie tampon

Colectare probe ADN

PCR

Principiu

Biochimie Medicina dentara

Etapele PCR

• Denaturarea ADN-ului dublu catenar

• Cuplarea primerilor de ADN-ul simplu catenar

• Extensia primerilor

PCR

Principiu

Biochimie Medicina dentara

Denaturarea ADN

• 94-98 ºC, 20-30 de secunde• ADN-ul este desfasurat in doua lanturi ADN simplu-catenare complementare

Cuplarea primerilor

• 50-65 ºC, 20-40 de secunde• Lant dublu-catenar hibrid – primeri si ADN de amplificat

Extensia primerilor• ADN-polimeraza: Se leaga de lantul hibrid „Citeste” secvenţa lantului ADN-tinta; Alungeste primerii prin adaugarea de dNTP, pe baza regulii complementaritatii

PCR

Principiu

Biochimie Medicina dentara

Amplificarea

MW: dimensiuni cunoscute1: ~1850 bp2: ~800 bp3: nu s-a amplificat4: ~800 bp5: benzi multiple

Vizualizare produsi de amplificare