ministerul educa iei, cercet rii, tineretului i sportului ... · se eviden iaz anizocitoza, celule...
Post on 12-Sep-2019
3 Views
Preview:
TRANSCRIPT
MINISTERUL EDUCA�IEI, CERCET�RII, TINERETULUI �I SPORTULUI
UNIVERSITATEA DE VEST „VASILE GOLDI�” ARAD FACULTATEA DE �TIIN�E CATEDRA DE BIOLOGIE
Annamaria (Pallag) Ritli
EFECTELE TERAPIEI ANTICANCEROASE ASUPRA METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR
Rezumatul tezei de doctorat
Conduc�tor �tiin�ific Prof. univ. dr. Aurel Ardelean
- ARAD, 2010 –
2
CUPRINS INTRODUCERE............................................................................................................. 6 PARTEA I. ASPECTE GENERALE............................................................................
10
CAPITOLUL 1. RELA�IA METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR CU PROCESELE FIZIOLOGICE �I BIOCHIMICE CELULARE NORMALE �I MALIGNE.......................................................................................................................
10 1.1. Generalit�i privind metabolismul energetic celular............................................ 10 1.1.1. Explicarea nevoilor de energie ale materiei vii................................................... 11 1.1.2. Transferul energiei în metabolism....................................................................... 12 1.2. Organizarea structural-func�ional� a mitocondriilor.......................................... 14 1.2.1. Fosforilarea oxidativ� în lan� respirator............................................................. 15 1.3. Schimburile efectuate între mitocondrie �i citosol................................................ 18 1.4. Efectul Warburg �i metabolismul energetic celular............................................ 22 1.5. Apoptoza �i metabolismul energetic celular.......................................................... 26 1.5.1. Mitocondriile �i apoptoza..................................................................................... 28 1.6. Rolul mitocondriilor în generarea speciilor reactive ale oxigenului................... 34 1.7. Hipoxia, angiogeneza �i rela�ia cu mecanismele metabolismului celular...............................................................................................................................
38
CAPITOLUL 2. CELULA MALIGN� �I CHIMIOTERAPIA ANTINEOPLAZIC�.....................................................................................................
42 2.1. Caracteristicile fenotipice ale celulei maligne....................................................... 42 2.2. Generalit��i despre chimioterapia antineoplazic�................................................ 45 2.2.1. Principiile generale ale chimioterapiei antineoplazice...................................... 46 2.2.2. Clasificarea medicamentelor antineoplazice...................................................... 48 2.3. Modalit��i de urm�rire a efectelor chimioterapiei............................................... 50 PARTEA A II-A. CERCET�RI PROPRII..................................................................
54
CAPITOLUL 3. OBIECTIVELE CERCET�RII.......................................................
56
CAPITOLUL 4. MATERIALE �I METODE UTILIZATE......................................
59
4.1. Organizarea cercet�rii............................................................................................. 59 4.1.1. Stabilirea loturilor de studiu pentru tumori solide……………........................ 59 4.1.1.1. Organizarea loturilor pentru studiul tumorilor mamare.............................. 59 4.1.1.2. Organizarea loturilor pentru studiul tumorilor colorectale.......................... 61 4.1.1.3. Descrierea administr�rii ciclurilor de tratament antiangiogenetic………... 63 4.1.2. Alegerea �i stabilirea loturilor de studiu pentru hemopatii maligne................ 65 4.1.2.1. Organizarea lotului de studiu LA..................................................................... 69 4.1.2.2. Organizarea lotului martor LA-M................................................................... 71 4.2. Metode �i tehnici utilizate în studiul efectelor terapiei antineoplazice asupra metabolismului energetic celular în tumori solide �i hemopatii maligne...................
71
4.2.1. Metode histologie................................................................................................... 71 4.2.2. Tehnici histoenzimatice........................................................................................ 73
4.2.2.1. Metoda Wachstein i Meissel pentru determinarea activit�ii adenozintrifosfatazei (ATP-azei).............................................................................
75
4.2.2.2. Metoda Hess-Scarpelli-Pearse pentru determinarea activit�ii lactatdehidrogenazei (LDH)..........................................................................................
75
4.2.2.3. Metoda Nachlas-Tsou-Souza-Chang-Seligman pentru determinarea activit��ii succinatdehidrogenazei (SDH)......................................................................
76
3
4.2.3. Tehnici imunohistochimice................................................................................... 77 4.2.4. Tehnici biochimice................................................................................................ 81 4.2.4.1. Determinarea malondialdehidei prin metoda colorimetric�......................... 81 4.2.4.2. Determinarea ceruloplasminei prin metoda colorimetric� (metoda Ravin)…………………………………………………………………………………...
84
4.2.5. Metode �i tehnici hematologice............................................................................ 86 4.2.5.1. Testul cu nirtobleu tetrazolium (NBT)............................................................. 86 4.2.5.2. Studiul apoptozei prin analize de citometrie în flux....................................... 87 4.2.6. Metode pentru evaluarea statusului metabolic �i nutri�ional în timpul tratamentului antineoplazic �i a tratamentului antiangiogenetic...............................
90
4.2.6.1. Utilizarea m�sur�torilor antropometrice....................................................... 92 4.2.6.2. Utilizarea chestionarelor pentru evaluarea st�rii de s�n�tate �i a st�rii func�ionale ......................................................................................................................
93
CAPITOLUL 5. REZULTATE �I DISCU�II.............................................................
94
5.1. EFECTELE TERAPIEI ANTICANCEROASE ASUPRA METABOLISMULUI ENERGETIC CELLULAR ÎN TUMORI SOLIDE.............
94
5.1.1. Rezultatele analizelor histologice......................................................................... 96 5.1.2. Rezultatele analizelor histoenzimatice................................................................ 104 5.1.3. Studiul neoangiogenezei……………………....................................................... 122 5.1.4. Studiul apoptozei cu ajutorul tehnicii imunohistochimice de eviden�iere a citocromului c citosolic……………………….………………………………………..
134
5.1.5. Influen�a terapiei antineoplazice asupra nivelului speciilor reactive ale oxigenului �i a sistemelor antioxidante plasmatice......................................................
144
5.1.6. Evolu�ia statusului metabolic �i nutri�ional în timpul tratamentului antiangiogenetic...............................................................................................................
149
5.1.7. Evaluarea calit��ii vie�ii........................................................................................ 152 5.1.8. Discutarea rezultatelor ob�inute.......................................................................... 156 5.2 STUDIUL EFECTELOR POLICHIMIOTERAPIEI ANTINEOPLAZICE ÎN HEMOPATII MALIGNE ASUPRA METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR.......................................................................................................................
159 5.2.1 Studiul activit��ii enzimelor oxidoreduc�toare în timpul polichimioterapiei antineoplazice în leucemii acute……………….............................................................
160
5.2.2. Studiul apoptozei în leucemii acute prin citometrie în flux.............................. 165 5.2.3. Influen�a polichimioterapiei antineoplazice asupra nivelului speciilor reactive ale oxigenului �i a sistemelor antioxidante plasmatice în leucemiile acute.
173
5.2.4. Discutarea rezultatelor ob�inute……….............................................................. 179 CONCLUZII …………...................................................................................................
182
BIBLIOGRAFIE............................................................................................................. 186 Lista lucr�rilor �tiin�ifice publicate din teza de doctorat…………………................ 202 Anexe................................................................................................................................ 204
4
“Metabolismul celulelor maligne
reprezint� tendonul lui Achile pentru tumori.” �������������� �������������
PARTEA I. ASPECTE GENERALE
Se cunoa�te de mult faptul c� celula tumoral� are un metabolism modificat. La începutul secolului XX. cercet�torul german O. Warburg a ini�iat cercet�ri privind
leg�tura dintre alterarea respira�iei mitocondriale �i apari�ia celulelor canceroase. El a propus un mecanism pentru a explica transform�rile care duc la procesul carcinogenezei, punând în eviden�� c� la baza carcinogenezei st� “stricarea ma�in�riei respiratorii” �i cre�terea sintezei de ATP pe cale glicolitic� (Warburg O., 1956; Carew J.S. �i colab., 2002).
Celulele maligne î�i satisfac necesit��ile energetice prin producerea unei cantit��i mari de ATP prin glicoliz� �i nu prin fosforilare oxidativ�, dar astfel aceste celule vor consuma cantit��i mult mai mari de glucoz�.
Aceasta reprezint� o deosebire dintre celulele maligne �i normale, care utilizeaz� fosforilarea oxidativ� pentru sinteza de ATP, proces cu eficien�� mult mai mare.
Organitele celulare implicate direct în desf��urarea metabolismului energetic celular sunt mitocondriile.
Etapele metabolismului energetic celular au leg�turi strânse cu generarea speciilor reactive ale oxigenului, cu ini�ierea procesului de apoptoz� celular�, precum �i cu fenomenele de hipoxie, perturbarea ciclului celular �i angiogenez�. Orice perturbare la nivelul acestor mecanisme vor avea ca rezultat modific�ri sesizabile la nivelul întregului organism.
În ultimii ani, au fost eviden�iate o multitudine de evenimente �i mecanisme biologice ce reflect� interac�iunea permanent� a celulelor maligne cu organismul gazd�, rezultatul fiind un proces selectiv continuu �i secven�ial.
Medicamentele antineoplazice sau citostaticele utilizate ac�ioneaz� prin inhibarea diviziunii sau prin distrugerea celulelor canceroase �i au o selectivitate foarte variat�.
Aten�ia cercet�torilor se îndreapt� azi c�tre posibilit��ile terapeutice oferite de medicamentele care ac�ioneaz� prin modificarea metabolismului energetic al celulelor tumorale.
PARTEA II. CERCET�RI PROPRII
Pornind de la aceste premize am considerat util� ini�ierea unui studiu pentru eviden�ierea mecanismelor metabolismului energetic care sunt modificate în urma tratamentului antineoplazic. Pornind de la nivel celular, molecular �i ajungând la nivelul organismului am studiat efectele terapiei antineoplazice asupra metabolismului �i în special asupra metabolismului energetic.
Din dorin�a de a ob�ine rezultate cât mai exacte �i complete, având în vedere în acela�i timp diversitatea neoplaziilor maligne, a manifest�rilor clinice �i patofiziologice extrem de complexe, cercet�rile noastre s-au orientat spre cele dou� mari grupe de neoplazii maligne, tumorile solide �i hemopatiile maligne. Din acest punct de vedere partea practic� a lucr�rii se împarte în dou� subcapitole independente.
În cadrul tumorilor solide studiul s-a realizat cu scopul investig�rii evenimentelor ce caracterizeaz� metabolismul energetic celular în timpul terapiei antineoplazice cu bevacizumab. Au fost inclu�i în studiu pacien�i cu neoplazie mamar� �i colorectal� care au parcurs tratamentul primar antineoplazic cu r�spuns par�ial (RP) sau boal� sta�ionar� (BS). Nu au fost inclu�i pacien�i care au prezentat r�spuns complet (RC) sau boal� în evolu�ie
5
(BEv) dup� tratamentul primar. În lotul A sunt inclu�i pacien�ii cu tumori mamare, în lotul B pacien�ii cu tumori colorectale.
În lotul A.I. de studiu, format din 21 paciente (vârsta medie 56,50 ± 10,60 ani), au fost inclu�i paciente care dup� parcurgerea tratamentului oncologic primar nu au primit tratament antiangiogenetic. Acest lot reprezint� lotul martor din punct de vedere a cercet�rii r�spunsului la tratamentul antiangiogenetic. În lotul A.II. de studiu, format din 22 paciente (vârsta medie 53,75 ± 12,77 ani), au fost inclu�i paciente care dup� tratamentul oncologic primar au urm�rit un tratament antiangiogenetic cu bevacizumab.
Lotul B.I. sau lotul martor cuprinde 24 pacien�i (vârsta medie 57,55± 9,80 ani) care dup� parcurgerea tratamentului oncologic primar nu au primit tratament antiangiogenetic, iar în lotul B.II sau lotul de studiu au fost inclu�i 22 pacien�i (vârsta medie 54,95 ±10,25 de ani) care dup� tratamentul oncologic primar au urm�rit un tratament antiangiogenetic cu bevacizumab.
În cazul hematopatiilor maligne s-au urm�rit acelea�i efecte de modificare a metabolismului energetic în urma aplic�rii de tratamente citostatice polichimioterapeutice standard.
Lotul de studiu LA cuprinde 21 bolnavi cu leucemie acut�, din care 18 cu LAL (leucemie acut� limfoblastic�), 3 cu LAM (leucemie acut� mieloblastic�), copii cu vârsta cuprins� între 0-16 ani. Pentru oganizarea lotului martor M-LA, am selectat caz pereche, 20 persoane s�n�toase, care prezint� urm�toarele caractere comune cu lotul de studiu LA: vârst�, sex, mediul de provenien��.
Obiectivele stabilite de la început ne-au permis s� apreciem în mod punctual:
- efectul tratamentului antineoplazic la nivel celular în tumori solide prin evaluarea intensit��ii desf��ur�rii metabolismului energetic; - corela�ia dintre ac�iunea biologic� a tratamentului antiangiogenetic, neoangiogeneza �i poten�ialul apoptotic al celulelor tumorale; - evolu�ia nivelului speciilor reactive ale oxigenului în timpul tratamentului citostatic �i antiangiogenetic; - evaluarea statusului metabolic �i nutri�ional precum �i a st�rii de s�n�tate în timpul tratamentului antiangiogenetic; - impactul produs de tratamentul antineoplazic polichimioterapeutic în hemopatii maligne, asupra celulelor prin corelarea procentului de celule apoptotice, activitatea enzimelor oxidoreduc�toare �i evolu�ia nivelului speciilor reactive ale oxigenului; - corelarea datelor ob�inute �i punerea în eviden�� a importan�ei practice
Pentru realizarea obiectivelor propuse am efectuat o gam� complex� de analize bazate pe metode �i tehnici biochimice, hematologice, histologice, histoenzimatice �i imunohistochimice, dar �i m�sur�tori antropometrice �i chestionare pentru evaluarea calit��ii vie�ii pacien�ilor.
REZULTATE �I DISCU�II
EFECTELE TERAPIEI ANTICANCEROASE ASUPRA METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR ÎN TUMORI SOLIDE
Analizele au început la nivel macroscopic a pieselor proaspete preluate de la sec�ia
de chirurgie imediat dup� extirpare (10-15 minute), continuate apoi de analize histologice, histoenzimologice �i imunohistochimice în laboratorul de Anatomie patologic�, a Spitalului Clinic Jude�ean de Urgen��, Oradea.
Fiecare caz din studiu reprezint� un pacient de la care s-a recoltat material biopsic, fie prin interven�ie minim�, fie prin interven�ie larg�. Colora�ia uzual� HE pune în eviden�� structura tisular� general� �i unele tr�s�turi celulare, fiind utilizate pentru toate tipurile de
6
preparate histologice. La pacine�ii din lotul AI, cu carcinom ductal invaziv cu recidive loco-regionale la colora�ia hematoxilin�-eozin� (HE), apar microscopic celule carcinomatoase dispuse sub form� de glande sau sub forma unor grupuri izolate. Se eviden�iaz� anizocitoza, celule gigante, o morfologie foarte variat� a nucleilor, cromatina granular� neomogen�, raportul nucleo-citoplasmatic evident modificat în favoarea nucleului, distrofie la nivelul citoplasmei, alterând cu zone în care citoplasma este eozinofil�.
Fig.II.11. Lotul AI Carcinom ductal invaziv. a -
mitoz� atipic�, b - vas de sânge intratumoral,
c - distrofie citoplasmatic� (HE X400)
Fig.II.12. Lotul AI Carcinom ductal invaziv.
cu s�geat� sunt marcate mitoze atipice (HE
X400)
La lotul de studiu AII, la colora�ia cu hematoxilin�-eozin�, apare invazie tumoral�,
boal� în plin� evolu�ie. Dup� �ase luni de tratament antiangiogenetic, în urma anlizelor f�cute în colora�ia hematoxilin�-eozin�, la obiectivul X40 �i detaliu, s-au putut identifica corpii apoptotici (Fig II.17, II.18.). În loturile BI �i BII au fost inclu�i pacien�i cu cancer metastatic colonorectal la care s-au ob�inut rezultate asem�n�toare.
Fig. II.17. Lotul AII (luna 6) Carcinom ductal
invaziv Eviden�ierea corpilor apoptotici,(HE X
400)
Fig. II.18. Eviden�ierea corpilor apoptotici,
a- cromatina nuclear� în form� de semilun�; b-
halou clar în jurul celulei (HE X 1200 ) Rezultatele analizelor histoenzimatice Colora�iile speciale, cum sunt cele histoenzimologice �i imunohistochimice permit
eviden�ierea unor mecanisme �i structuri moleculare. Analizele histoenzimatice au fost incluse astfel în protocolul experimental, cu ajutorul lor se poate preciza desf��urarea diferitelor procese metabolice în celule �i �esuturi (Mure�an E. �i col.,1976) permi�ând eviden�ierea unei activit��i enzimatice în chiar situsul celular în care se produce aceasta (Ross M.H. �i col., 2007). Pe de alt� parte, integritatea frac�iunilor subcelulare poate fi demonstrat� printr-o activitate specific� mare a enzimelor caracteristice acelei frac�iuni. Astfel, pentru mitocondrii �i activitatea enzimatic� mitocondrial� marker enzimatic specific este adenozintrifosfataza (ATP-aza) �i succinatdehidrogenaza (SDH), (Mixici �i col, 1997), iar pentru matricea citoplasmatic�, terenul glicolitic, lactat dehidrogenaza (LDH). (Rusu �i col. 2005, Cucuianu M.. �i col., 1998, Rusu M.A. �i col., 1980).
7
Deoarece tehnicile de colorare histoenzimatice utilizate nu permit vizualizarea structurilor tisulare, pentru analiza imaginilor microscopice �i cuantificarea rezultatelor s-au achizi�ionat câte trei imagini la m�rimea X200, imaginile au fost captate cu camer� digital� �i stocat� ca fil� JPEG (1550x1070 pxl, 16,7 milioane culori, 24-bit). la nivelul acestor imagini s-au ales aleator 10 câmpuri diferite, în care evaluarea activit��ii enzimatice s-a realizat semicantitativ, astfel:
� = lipsa activit��ii enzimatice; �/+ = activitate enzimatic� sc�zut�; + = activitate enzimatic� intens�; ++ = activitate enzimatic� foarte intens� (Tudose N., Laz�r E, 1996; Olinici C.D.,
Vaida M.F., 1997; Fox S.B., Harris A.L, 2004; Bancroft J.D., Gamble M., 2007). Rezultatele ob�inute s-au centralizat, astfel am primit o imagine real� �i cuantificat�
asupra activit��ii enzimelor studiate.
Studiul activit��ii adenozintrifosfatazei (ATP-azei) ATP-aza se vizualizeaz� printr-o colora�ie brun� prin metoda Waschstein �i Meissel.
Lot A I. Luna 0 Lot A I. Luna 6 Lot A II. Luna 0 Lot A II. Luna 6
++ 28,3
+/- 30,5
+ 41,2
++ 37,1
+/- 26,4
+ 36,5
++ 24,2
+/- 27,3
+ 48,5
++ 8,7
+/- 52 +
39,3
Fig.II.29. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii ATP-azice la loturile AI �i AII
Atât la lotul de studiu AII cât �i la lotul de studiu BII se observ� o sc�dere a activit��ii
ATP-azice în urma tratamentului antiangiogenetic.
Lot B I. Luna 0 Lot B I. Luna 6 Lot B II. Luna 0 Lot B II. Luna 6
++38,1
+/- 25,9
+ 36
++40,5
+/- 23
+ 36,5
++ 34
+/- 27,9
+ 38,1
++5
+/- 38,4
+ 56,4
Fig. II.34. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii ATP-azei la loturile BI �i BII
Fig. II.35. Lotul BII (luna 0) Adenocarcinom
de colon. Activitate ATP-azic� (X100);
cu s�ge�i sunt marcate zonele cu activitate
enzimatic� intens�
Fig. II.36. Lotul BII (luna 6) Adenocarcinom
de colon ascendent Activitate ATP-azic�
(X100);cu s�ge�i sunt marcate zonele cu
activitate enzimatic� intens�
8
Studiul activit��ii lactatdehidrogenazei (LDH)
Enzima lactat dehidrogenaza (LDH) localizat� în citoplasm� se eviden�iaz� histoenzimatic printr-o colora�ie albastru închis�.
Lot A I. Luna 0 Lot A I. Luna 6 Lot A II. Luna 0 Lot A II. Luna 6
+ 49,4
+/- 11,3
++40,3
+ 54,4
+/- 9,5
++36
+ 48,4
+/- 17,4++
34,2
++ 35,1
+/- 7,4
+ 57,5
Fig. II.39. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii LDH la loturile AI �i AII
Fig. II.38. Lotul AII (luna 0) Activitatea LDH
(X100); cu s�ge�i sunt marcate zonele cu
activitate enzimatic� intens�
Fig.II.40. Lotul AII (luna 6) Activitatea LDH
(X100); cu s�ge�i sunt marcate zonele cu
activitate enzimatic� intens�
Se remarc� o cre�tere a activit��ii LDH la loturile de studiu AII �i BII fa�� de loturile martor AI �i BI (Fig. II.39, II.44).
Lot B I. Luna 0 Lot B I. Luna 6 Lot B II. Luna 0 Lot B II. Luna 6
+ 56
+/- 6,6
++37,4
+ 52,4
+/- 8,1
++39,5
+ 53,6
+/- 10,1
++36,3
++ 56,1
+/- 6,2
+ 47,7
Fig. II.44. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii LDH la loturile BI �i BII
Studiul activit��ii succinatdehidrogenazei (SDH)
Succinatdehidrogenaza (SDH) a fost pus� în eviden�� cu ajutorul metodei Nachlas-Tsou-Souza-Chang-Seligman.
Locurile tisulare cu activitate enzimatic� apar colorate în albastru. Activitatea enzimei d� indica�ii despre func�ionarea ciclului Krebs.
9
Lot A I. Luna 0 Lot A I. Luna 6 Lot A II. Luna 0 Lot A II. Luna 6
+ 31
+/- 46,4
++22,6
++ 20,3
+/- 51,2
+ 28,5
+ 42,3
+/- 47,3
++10,4
+ 28,5
+/- 67,5
++4
Fig. II.48. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii SDH la loturile AI �i AII
Fig. II.50. Lotul BII (luna 0) Activitatea SDH
(X100);cu s�ge�i sunt marcate zonele cu
activitate enzimatic� intens�
Fig. II.51. Lotul BII (luna 6) Activitatea SDH
(X100)cu s�ge�i sunt marcate zonele cu
activitate enzimatic� intens�
Lot B I. Luna 0 Lot B I. Luna 6 Lot B II. Luna 0 Lot B II. Luna 6
++ 19,5
+/- 49,7
+ 30,8
++ 21,6
+/- 48,4
+ 30
++ 23,5
+/- 50,4
+ 26,1
+ 32 +/-
61,2
++6,8
Fig. II.52. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii SDH la loturile BI �i BII
Medicamentul antiangiogenetic analizat ac�ioneaz� asem�n�tor la nivelul enzimelor
metabolismului energetic indiferent de localizarea tumorii. Studiul neoangiogenezei Am considerat deosebit de important studiul neoangiogenezei având în vedere faptul c� medicamentul antineoplazic studiat este un anti-angiogenetic.
Evaluarea extinderii re�elei vasculare nou formate s-a exprimat cantitativ prin aprecierea la microscop a densit��ii microvasculare (microvessel density) - MVD pe baza num�r�rii vaselor neoformate.
Determinarea MVD, prin identificarea celulelor endoteliale, constituentele de baz� ale vaselor, s-a f�cut prin metoda anatomopatologic� de rutin� �i prin examen imunohistochimic. Identificarea imunohistochimic� a endoteliilor vasculare a utilizat anticorpul monoclonal anti-CD31. Am apelat la reac�ia imunohistochimic�, deoarece examenul histopatologic la colora�ia de rutin� nu a permis diferen�ierea între vasele sanguine normale �i cele intratumorale.
10
S-a efectuat tehnica imunohistochimic� de rutin�, utilizând anticorpul monoclonal CD31. CD31 s-a exprimat pe suprafa�a celulelor endoteliale.
Am utilizat metoda semicantitativ�, propus� de Korkolopoulou �i colaboratorii (2001), astfel:
- s-au prelucrat sec�iuni colorate pentru CD31; - prin examinare, cu obiectiv mic �i mare, s-au identificat ariile de capilare �i vase
mici cu densitate maxim�; - s-a ales câmpul microscopic x 200, cu densitatea cea mai mare; - imaginea a fost captat� cu camer� digital� �i stocat� ca fil� JPEG (1550x1070 pxl,
16,7 milioane culori, 24-bit); - când nu a fost evident� o arie de maxim� vasculariza�ie, s-au ales 3 câmpuri, �i s-au
stocat MVD; - s-a luat în considerare doar câmpul cu vasculariza�ie maxim�; - s-au exclus din interpretare ariile cu infiltrat abundent, necroze �i ulcera�ii; - celulele endoteliale, izolate sau în grupuri mici, au fost considerate vase individuale;
au fost excluse din num�r�toare vasele cu perete muscular; - s-au apreciat cantitativ tipurile de vase intratumorale: imature, intermediare �i
mature, calculându-se a�a numitul indice de pozitivare pentru fiecare caz în parte, �i s-a calculat media (câmp conven�ional de 0,5/0,5 cm);
- s-a f�cut cuantificarea MVD pe fiecare caz în parte. (Korkolopoulou �i colab., 2001).
Vasele intratumorale observate au avut o structur� heterogen�, adesea peretele fiind incomplet maturat. Vasele intratumorale au fost împ�r�ite pe baza dimensiunii perfuz�rii, respectiv a prolifer�rii celulelor endoteliale �i a prezen�ei pericitelor, în trei categorii:
- vase imature; - intermediare; - mature.
AI luna 0 AI luna 6 AII luna 0 AII luna 6
Vase imature
43%
Vase mature
31%
Vase interme
diare26%
Vase interme
diare36%
Vase imature
12%
Vase mature
52%
Vase imature44,7%
Vase mature31,3%
Vase interme
diare24%
Vase imature24,3%
Vase mature6,6%
Vase interme
diare69,1%
Fig. II.55. Cuantificarea procentual� a densit��ii microvasculare pentru lotul AI �i AII
7
2 3
9
4
13
16
7
11
22
19
26
13
4,3
7,8
12,9
9,3
18,6
0
5
10
15
20
25
30
IMATURE
luna 0
IMATURE
luna 6
INTERMED
luna 0
INTERMED
luna 6
MATURE
luna 0
MATURE
luna 6
Fig. II.61. Num�rul minim, maxim �i mediu de vase neoformate la lotul AI
11
6
02
45
0
20
5
109
18
2
14,5
1,8
7,8
5,2
10,1
0,50
5
10
15
20
25
IMATURE
luna 0
IMATURE
luna 6
INTERMED
luna 0
INTERMED
luna 6
MATURE
luna 0
MATURE
luna 6
Fig.II.62. Num�rul minim, maxim �i mediu de vase neoformate la lotul AII
BI luna 0 BI luna 6 BII luna 0 BII luna 6
Vase imature
46%
Vase interme
diare21% Vase
mature33%
Vase imature
15%
Vase interme
diare28%
Vase mature
57%
Vase imature41,3%
Vase interme
diare28,5
Vase mature30,2%
Vase imature
23%
Vase interme
diare68,6
Vase mature8,4%
Fig. II.63. Cuantificarea procentual� a densit��ii microvasculare la lotul BI �i BII
Fig. II.65. Lotul BII (luna 0) Adenocarcinom de
colon, a - imunoreac�ie pozitiv� pentru CD 31;
b – glande atipice transformate malign, celule
cu nuclei tahicromi pseudostratifica�i;(X 400)
Fig. II.67. Lotul BII (luna 6) Adenocarcinom
de colon,Cu s�ge�i sunt marcate zonele cu
imunoreac�ie slab pozitiv� pentru CD 31;(X
400)
9
42
8
4
9
21
12 12
16
20
30
15,5
5,67
10,4 11
21,2
0
5
10
15
20
25
30
35
IMATURE
luna 0
IMATURE
luna 6
INTERMED
luna 0
INTERMED
luna 6
MATURE
luna 0
MATURE
luna 6
Fig. II.69. Num�rul minim, maxim �i mediu de vase neoformate la lotul BI
12
10
13
4 4
0
21
7
1311
15
3
14,4
2,3
10
7,1
10,5
0,90
5
10
15
20
25
IMATURE
luna 0
IMATURE
luna 6
INTERMED
luna 0
INTERMED
luna 6
MATURE
luna 0
MATURE
luna 6
Fig. II.70. Num�rul minim, maxim �i mediu de vase neoformate la lotul BII
În perioada studiat� apar modific�ri majore atât la nivelul num�rului de vase f�r� a
�ine cont de diferen�ierea pe tipuri de vase, dar �i la nivelul vaselor diferen�iate în cele trei tipuri, atât la lotul de studiu AII cât �i la lotul de studiu BII. Aceste diferen�e demonstreaz� clar ac�iunea antiangiogenetic� a medicamentului bevacizumab, care const� în supresia marcat� a angiogenezei, reducerea num�rului de vase intratumorale, inhibarea dezvolt�rii de noi vase sangvine, inhibarea matur�rii vaselor existente.
Studiul apoptozei cu ajutorul tehnicii imunohistochimice de eviden�iere a citocromului c citosolic Pentru eviden�ierea �i evaluarea procesului apoptotic s-a efectuat tehnica imunohistochimic� de rutin�, utilizând anticorpul monoclonal citocrom c, kitul Cytochrome c Ab-2 (Clone 7H8.2C12). Kitul utilizat marcheaz� citocromul c eliberat din spa�iul intermembranar mitocondrial în citosol, eveniment necesar pentru finalizarea apoptozei. Citocromul c citosolic activeaz� caspaza-3 �i moleculele enzime, cistein proteazelor din familia ICE, care sunt efectorii cheie al apoptozei.
S-a efectuat tehnica imunohistochimic� de rutin�, utilizând anticorpul monoclonal citocrom c, care s-a exprimat la nivel citoplasmatic celular.
Sec�iunile colorate pentru cit c au fost examinate cu obievtive diferite, s-au identificat ariile cu imunoreac�ie pozitiv�, s-au ales câte 3 câmpuri microscopice x 200 pentru fiecare caz în parte, imaginile au fost captate cu camer� digital� �i stocat� ca fil� JPEG (1550x1070 pxl, 16,7 milioane culori, 24-bit). La nivelul acestor imagini s-au ales aleator 10 câmpuri diferite, în care num�rul de celule cu imunoreac�ie pozitiv� sau negativ� pentru anticorpul monoclonal utilizat, a fost evaluat semicantitativ astfel:
� = imunoreac�ie negativ�; �/+ = rare elemente cu imunoreac�ie pozitiv�; + = elemente cu imunoreac�ie pozitiv� prezente constant; ++ = numeroase elemente cu imunoreac�ie pozitiv�.
Lot A I. Luna 0 Lot A I. Luna 6 Lot A II. . Luna 0 Lot A II. Luna 6
�
64,3
+/- 35,7
�
87,7
+/- 12,3
� 62,6
+/- 37,4
+ 43,2
+/- 25,1
++ 31,7
Fig. II.75. Cuantificarea procentual� a imunoreactivit��ii pentru citocromul c la lotul AI �i AII
13
Fig. II.79. Lotul AII luna 0. Imunoreac�ie slab
pozitiv� pentru citocromul c ,(X 800); cu
s�ge�i sunt marcate celulele în care citoplasma
prezint� imunoreac�ie pozitiv� pentru
citocromul c
Fig.II.81. Lotul AII luna 6 Imunoreac�ie
intens pozitiv� pentru citocromul c (X 1200);
cu s�ge�i sunt marcate celulele tumorale cu
nucleu balonizat, meganucleoli, citoplasm�
cu imunoreac�ie pozitiv� pentru citocromul c
Lot B I. . Luna 0 Lot B I. Luna 6 Lot B II. . Luna 0 Lot B II. Luna 6
� 76,8
+/- 23,2
+/- 10,5
� 89,5
� 67,5
+/- 32,5
+
36,4
+/-
21,2++
42,4
Fig. II.82. Cuantificarea procentual� a imunoreactivit��ii pentru citocromul c la lotul BI �i BII
Rezultatele ob�inute arat� cre�terea imunoreactivit��ii pentru citocromul c în urma tratamentului antiangiogenetic. Influena terapiei antineoplazice asupra nivelului speciilor reactive ale oxigenului i a sistemelor antioxidante plasmatice
Am studiat efectele terapiei antineoplazice antiangiogenetice asupra sintezei de specii reactive ale oxigenului prin m�surarea malondialdehidei serice (MDA), care este unul din produ�ii de peroxidare lipidic�, determinarea ei din sânge reprezintând o metod� standard pentru evaluarea stresului oxidativ. Pentru urm�rirea ac�iunii antioxidan�ilor plasmatici în timpul tratamentului antineoplazic am urm�rit nivelul ceruloplasminei serice.
Nivelul seric al malondialdehidei �i al ceruloplasminei s-a determinat la debutul studiului �i lunar în cele �ase luni de studiu.
La loturile de studiu (AII �i BII) are loc o cre�tere a nivelului seric de MDA fa�� de loturile martor, împreun� cu o cre�tere progresiv� a nivelului seric de CP.
Comparând valorile ob�inute pentru luna 0 �i luna 6 pentru nivelul seric al malondialdehidei �i a ceruloplasminei la lotul martor �i la lotul de studiu se constat� c� diferen�ele penrtu MDA nu sunt semnificative statistic (p > 0,05) dar cele ob�inute pentru CP sunt semnificative statistic (p < 0,05). Nivelele de semnifica�ie sunt asem�n�toare penrtu pacien�ii cu tumori mamare �i tumori colorectale,
Evolu�ia statusului metabolic �i nutri�ional în timpul tratamentului antiangiogenetic
Evaluarea statusului metabolic �i nutri�ional s-a f�cut în func�ie de determin�rile antropometrice periodice, lunare. Indicatorii antropometrici urm�ri�i au fost: greutatea, înâl�imea, rata metabolismului bazal (RMB) �i indicele de mas� corporal� (IMC).
14
La toate loturile luate în studiu a sc�zut rata metabolismului bazal dar �i a indicelui de mas� corporal� în decursul celor �ase luni, dar diminuarea parametrilor urm�ri�i au fost mai evidente în cadrul loturilor martor f�r� tratament antiangiogenetic.
���
���
���
���
���
���
���
����
����
����
p < 0.05
RM
B
LOT MARTOR BI 991,53 1000,13 1011,32 1017,32 995,92 968,87 915,33
LOT STUDIU BII 1004,4 999,62 997,52 1000,87 994,75 991,88 975,53
0 1 2 3 4 5 6
Fig.II.97. Evolu�ia ratei metabolismului bazal (RMB) la pacien�ii cu neoplazii colorectale
Evaluarea calit��ii vie�ii Dup� completarea lunar� a chestionarelor de evaluare a st�rii de s�n�tate �i a st�rii func�ionale, a avut loc prelucrarea datelor. Se constat� c� are loc sc�derea nivelului st�rii func�ionale �i a st�rii de nutri�ie în decursul celor �ase luni, dar la pacien�ii care au urm�rit tratamentul antiangiogenetic sc�derea a fost mult mai lent� comparativ cu lotul martor, iar dup� �ase luni atât starea de nutri�ie cât �i starea func�ional� a fost mult mai bun� la lotul de studiu decât la lotul martor. Diferen�ele între loturile martor �i cele aflate în terapie sunt semnificative statistic în ceea ce prive�te starea de s�n�tate �i starea func�ional�, indiferent de localizarea tumorii.
Urm�rind curbele de supravie�uire se constat� beneficiul semnificativ statistic adus de terapia antiangiogenetic� administrat� pe parcursul celor �ase luni de studiu. Diferen�ele de supravie�uire sunt mai pronun�ate în cazul loturilor de studiu cu cancer colorectal, iar influen�a negativ� a bolii asupra statusului biologic �i metabolic al organismului se traduce printr-o mortalitate mai mare decât în cazul loturilor de studiu cu neoplasm mamar. (Fig. II. 104, II. 105)
Fig.II.104.Curba de supravie�uire la loturile
de studiu cu cancer mamar Fig.II.105. Curba de supravie�uire la loturile
de studiu cu cancer colorectal
STUDIUL EFECTELOR POLICHIMIOTERAPIEI ANTINEOPLAZICE ÎN HEMOPATII MALIGNE ASUPRA
METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR
În aceast capitol am studiat pe loturi de pacien�i cu leucemii acute diversele aspecte ale modific�rilor metabolismului energetic în timpul tratamentului antineoplazic. Boala
15
leucemic� trebuie v�zut� nu numai ca o proliferare necontrolat� a unei clone celulare ci ca o boal� a întregului organism. Am eviden�iat activitatea enzimelor oxidoreduc�toare �i viabilitatea celular�, desf��urarea procesului de apoptoz�, precum �i varia�ia nivelului speciilor reactive ale oxigenului �i a antioxidan�ilor plasmatici. Toate procesele studiate sunt p�r�i integrante sau legate foarte strâns de procesele metabolismului energetic celular. Studiul activit�ii enzimelor oxidoreduc�toare în timpul polichimioterapiei antineoplazice în leucemii acute
Am studiat intensitatea metabolismului energetic celular prin punerea în eviden�� a activit��ii enzimelor oxidoreduc�toare, atât înainte cât �i în timpul tratamentului antineoplazic, cu ajutorul testului cu nitrobleutetrazolim (NBT).
Înainte de începerea tratamentului în medie 14,73 % dintre celulele studiate prezint� o activitate oxido-reduc�toare intens�. Acest procent este apropiat de cel ob�inut la lotul mator. Rezultatele procentuale medii sunt prezentate tabelul 2.3. �i figura II. 106.
înainte de tratamentzi 1-3
zi 15/33
0
2
4
6
8
10
12
14
16
% c
elu
le N
BT
po
ziti
ve
Momentul
recolt�rii
Varia�ia procentului de celule sangvine NBT pozitive
LA
MLA
Fig.II .106. Varia�ia procentului de celule sangvine NBT pozitive
la lotul LA fa�� de lotul martor M LA
Realizând o compara�ie între valorile procentuale medii de celule NBT pozitive de la
cele dou� tipuri de leucemii acute, se constat� diferen�e mici, nesemnificative (p > 0,05). O caracteristic� ce le deosebe�te semnificativ r�mâne momentul în care se ating
valorile minime, cu valoare predictiv� a r�spunsului la tratament, reprezentat� de ziua 15 dup� tratament la loturile LAM �i ziua 33 la LAL. Studiul apoptozei în leucemii acute prin citometrie în flux
Interesul tot mai mare pentru studiul apoptozei a stimulat introducerea unor metode variate de detectare, una dintre ele fiind utilizarea coloran�ilor fluorescen�i în citometria în flux. Analizele s-au realizat din sângele periferic recoltat de la pacien�ii cu leucemie acut� limfoblastic� �i leucemie acut� mieloblastic�, fiind inclu�i în lotul de studiu LA. Popula�ia de celule din sângele periferic în leucemia acut� are în general urm�torul spectru: în faza de diagnostic, de invazie blastic� se caracterizeaz� prin prezen�a de bla�ti leucemici în propor�ie de 80-95% �i celule normale 5-20%.
Rezultatele ob�inute sunt reprezentate grafic în programul Cell-Quest sub form� de citograme (dot plot Annexin V-PE/7-AAD). Pe citogramele rezultate, bidimensionale, fiecare eveniment (celul�) este reprezentat printr-un punct.
16
Înainte detratament
zi 1-3zi 33
5,2
37,15
59,57
0,2
38,18
8,55
94,6
24,67
31,88
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Pro
cen
t ce
lule
Momentul evalu�rii
Evolu�ia poten�ialului apoptotic al celulelor sangvine la pacien�ii cu LAL
Celule vii
Celule în proces
Celule moarte
Înainte detratament zi 1-3
zi 15
Cel ule vi i
Celule în proces
Celule moart e
7,27
29,59
52,38
0,35
38,01
13,56
92,38
32,4 34,06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Pro
cen
t ce
lule
Momentul evalu�rii
Evolu�ia poten�ialului apoptotic al celulelor sangvine la pacien�ii cu LAM
Celule vii
Celule în proces
Celule moarte
Fig.II.116. Evolu�ia poten�ialului apoptotic al celulelor sangvine la pacien�ii cu LAL �i LAM
Fig.II.118. Citograme ob�inute prin analiz� de citometrie în flux în 1-3 zile (24-72 ore) de la
începerea tratamentului antineoplazic conform protocolului ALL-IC BFM 2002 (Dot plot Annexin-
PE/7-AAD). Nr. de celule num�rate: 10000. Rezultatele prezentate prin citograme sunt reprezentative
pentru lotul de studiu LA, pacien�i cu leucemie acut� limfoblastic�. (LAL).
Rezultatele noastre arat� c� eviden�ierea apoptozei prin citometrie de flux este o metod� sigur� �i extrem de sensibil� petru aprecierea gradului de r�spuns la ac�iunea medicamentelor antineoplazice, pe tot parcursul tratamentului polichimioterapeutic. Coroborat� cu datele clinice ale pacien�ilor devine o metod� foarte util� în luarea deciziilor terapeutice subsecvente de continuare sau de modificare a terapiei.
Influena chimioterapiei antineoplazice asupra nivelului speciilor reactive ale oxigenului i a sistemelor antioxidante plasmatice în leucemii acute
Pân� acum, nu s-a stabilit cu precizie dac� stresul oxidativ prezent la pacien�ii cu boli neoplazice rezult� dintr-o producere crescut� a radicalilor liberi în organism sau dintr-un e�ec al sistemului fiziologic antioxidant. În cercetarea de fa�� am urm�rit nivelul seric al ceruloplasminei în timpul polichimioterapiei în paralel cu nivelul seric al malondaldehidei, determinarea lor din sânge reprezentând o metod� standard pentru evaluarea stresului oxidativ.
17
înainte de tratamentzi 1-3
zi 33
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Val
ori
med
ii M
DA
(n
mo
l/ml)
Momentul evalu�rii
Evolu�ia valorilor medii pentru malondialdehid� seric�
MLA LA
Fig.II.122. Evolu�ia valorilor medii pentru malondialdehida seric� (lotul de studiu LA
comparativ cu lotul martor M LA)
înainte de tratamentzi 1-3
zi 15/33
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
Val
ori
med
ii C
P (
mg
/ml)
Momentul evalu�rii
Evolu�ia valorilor medii ale CP la loturile LA/MLA
LA
Martor MLA
Fig.II.126. Evolu�ia valorilor medii pentru ceruloplasmina seric� (lotul de studiu LA comparativ cu
lotul martor M LA )
Înainte de începerea tratamentului exist� un nivel u�or crescut al speciilor reactive al oxigenului în sângele periferic al pacien�ilor cu leucemie acut�, împreun� cu un nivel sc�zut al antioxidantului plasmatic, ceruloplasmina.
Nivelul sc�zut al ceruloplasminei (CP) men�inut pe tot parcursul terapiei împreun� cu un nivel mult crescut al malondialdehidei (MDA), arat� c� stresul oxidativ persist�, iar ceruloplasmina se consum� în reac�iile antioxidante din organism, sc�zând capacitatea lui de sintez� în ficat. Organismul r�spunde astfel la stersul oxidativ ap�rut, încercând s� anihileze ac�iunea distructiv� a speciilor reactive acumulate. CONCLUZII
Cercet�rile noastre s-au orientat spre cele dou� mari grupe de neoplazii maligne, tumorile solide �i hemopatiile maligne. Cele dou� sunt tratate separat reprezentând fa�ete diferite ale temei cercetate, nu beneficiaz� de compara�ii deoarece arat� aspecte particulare diferite ale celor dou� tipuri de tumori �i au fost realizate pe loturi diferite de pacien�i.
Prin urm�rirea efectelor terapiei antineoplazice antiangiogenetice asupra metabolismului energetic celular, cu ajutorul metodelor �i tehnicilor histologice, histoenzimatice, imunohistochimice �i biochimice, prin urm�rirea evolu�iei st�rii generale de s�n�tate, comparând rezultatele ob�inute pentru loturile de studiu cu cele ob�inute pentru loturile martor, putem formula urm�toarele concluzii:
1. Studiile au eviden�iat înaintea ini�ierii tratamentului un metabolism glicolitic foarte intens, demonstrat prin activitatea excesiv� a LDH-ului. Sinteza de ATP se realizeaz�
18
mai ales pe cale glicolitic�. La nivel mitocondrial, activitatea metabolic� este de o intensitate mai redus�, dar mitocondriile au membranele integrale, citocromul c nu se elibereaz� în citosol, celulele nefiind antrenate în procesul apoptotic;
2. S-a eviden�iat prezen�a vasculariza�iei intratumorale, furnizând oxigen �i substan�e nutritive celulelor tumorale, care împreun� cu prezen�a unei glicolize intense demonstreaz� ac�iunea efectului Warburg în celulele tumorale;
3. În timpul tratamentului antiangiogenetic scade activitatea ATP-azic�, se amplific� u�or glicoliza împreun� cu diminuarea activit��ii mitocondriale. Datorit� amplific�rii hipoxiei glicoliza devine mai intens�, activitatea enzimatic� mitocondrial� scade prin reducerea fosforil�rii oxidative �i a activit��ii ciclului acizilor tricarboxilici;
4. Exist� o activitate antiangiogenetic� accentuat� în urma tratamentului antineoplazic, ac�iune anti-VEGF (VEGF – factor de cre�tere endotelial vascular), care se realizeaz� printr-o supresie marcat� a vasculogenezei, inhibarea dezvolt�rii de noi vase sangvine dar �i printr-un efect asupra vaselor sangvine tumorale deja existente, prin inducerea apoptozei celulelor endoteliale. Se remarc� reducerea semnificativ� a num�rului de vase sanguine, precum �i a tipurilor de vase, mai ales a celor imature (inhibarea dezvolt�rii de noi vase) �i mature (distrugerea vaselor existente);
5. Reducerea vasculariza�iei tumorale, determinând sc�derea aportului de oxigen, duce la aprofundarea st�rii de hipoxie. În aceast� stare se destind invagin�rile mitocondriale, cristele, scade sinteza de ATP la nivel mitocondrial, astfel se activeaz� calea glicolitic� a metaboliz�rii glucozei. Datorit� acumul�rii acidului lactic scade pH-ul care determin� inhibarea enzimelor celulare �i duce la autoliza celulei. Tot hipoxia induce �i activarea factorului HIF (hypoxia inducing factor) care stimuleaz� angiogeneza prin reglarea factorului VEGF, fapt ce explic� utilitatea administr�rii anticorpului monoclonal bevacizumab pân� la evolu�ia bolii;
6. Rezultatele ob�inute arat� c� poten�ialul apoptotic al celulelor maligne cre�te semnificativ în timpul tratamentului antiangiogenetic, împreun� cu reducerea vasculariza�iei tumorale, este activat� calea apoptotic� mitocondrial� prin eliberarea citocromului c din spa�iul intermembranar mitocondrial;
7. În timpul tratamentului antiangiogenetic se dimiueaz� gradul de peroxidare lipidic�. O sc�dere a nivelului seric de specii reactive ale oxigenului se constat� �i la loturile martor incluse în studiu dar într-o m�sur� mult mai mic�;
8. Capacitatea antioxidant� a organismului pentru neutralizarea activit��ii radicalilor liberi cunoa�te o cre�tere progresiv� semnificativ� (p < 0,05);
9. Evaluarea statusului metabolic �i nutri�ional, evolu�ia st�rii generale de s�n�tate arat� o diminuare progresiv�, dar mult mai lent� la loturile de studiu decât cea observat� la loturile martor, f�r� tratament antiangiogenetic;
10. În privin�a aspectelor metabolismului energetic celular studiate la nivel celular, nu exist� diferen�e semnificative între tumorile mamare �i colorectale, dar rezultatele m�sur�torilor antropometrice, a st�rii de s�n�tate �i func�ionale, arat� c� la loturile de pacien�i cu cancer colorectal degradarea biologic� este mai rapid� decât la loturile cu cancer mamar, probabil �i datorit� influen�ei mai mari a localiz�rii tumorii în statusul metabolic general al organismului, împiedicând frecvent un aport �i o metabolizare eficient� a nutrien�ilor;
11. Curbele de supravie�uire realizate arat� beneficiul semnificativ statistic adus de terapia antiangiogenetic� administrat� pe parcursul celor �ase luni de studiu. Diferen�ele de supravie�uire sunt mai pronun�ate în cazul loturilor de studiu cu cancer colorectal, iar influen�a negativ� a bolii asupra statusului biologic �i metabolic al organismului se traduce printr-o mortalitate mai mare decât în cazul loturilor de studiu cu neoplasm mamar;
12. Pe tot parcursul studiului am comparat rezultatele cu cele ob�inute la loturile martor �i am constatat c� administrarea acestui medicament a determinat urm�toarele rezultate pozitive: a crescut poten�ialul apoptotic al celulelor maligne, s-a diminuat gradul de peroxidare lipidic�, a crescut capacitatea antioxidant� a organismului, starea general� a
19
organismului, statusul metabolic �i nutri�ional au fost mai pu�in afectate, s-a încetinit evolu�ia bolii împreun� cu cre�terea supravie�uirii generale a pacien�ilor;
13. Rezultatele ob�inute descriu un tablou complex metabolic al ac�iunii medicamentului antineoplazic studiat �i reprezint� o contribu�ie original� în ceea ce prive�te investigarea evenimentelor ce caracterizeaz� metabolismul energetic celular în timpul terapiei antiangiogenetice.
Rezultatele studiului efectelor polichimioterapiei antineoplazice asupra metabolismului energetic celular, în leucemiile acute, arat� c�:
1. Medicamentele antineoplazice au o ac�iune semnificativ� de inhibare a proliferativit��ii �i viabilit��ii celulare prin diminuarea accentuat� a activit��ii enzimelor oxidoreduc�toare. Diminuarea este semnificativ� (p < 0,05) deja în primele 1-3 zile de tratament;
2. Inducerea apoptozei are loc la 1-3 zile de la începerea tratamentului, iar propor�ia celulelor moarte prin apoptoz� cre�te semnificativ pân� la induc�ia remisiei. Deficien�a c�ii apoptotice ar determina rezisten�a celulelor la polichimioterapie, ducând la sc�derea ratei de remisie. Studiul poten�ialului apoptotic, prin tehnica citometriei în flux, confer� informa�ii valoroase pentru aprecierea gradului de r�spuns la ac�iunea medicamentelor antineoplazice, pe tot parcursul tratamentului polichimioterapeutic;
3. Perturbarea echilibrului oxidant/antioxidant este confirmat. Sub ac�iunea terapiei antineoplazice se ini�iaz� peroxidarea lipidic� poten�ând stresul oxidativ. Substan�ele citotoxice activeaz� o succesiune de c�i metabolice în urma c�rora sunt generate specii reactive de oxigen. Concentra�ia acestor specii reactive a crescut semnificativ (p < 0,05) în timpul tratamentului polichimioterapeutic, deteriorând mecanismul de ap�rare antioxidant endogen, a c�rui nivel scade semnificativ (p < 0,05);
4. Antioxidantul endogen, ceruloplasmina se consum� în reac�iile antioxidante din organism, sc�zând capacitatea lui de sintez� în ficat. Organismul r�spunde astfel la stersul oxidativ ap�rut, încercând s� anihileze ac�iunea distructiv� a speciilor reactive acumulate;
5. Aspectele metabolismului energetic celular supuse studiului efectuat asupra hemopatiilor maligne nu arat� diferen�e semnificative în r�spunsul la nivel celular la tratamentul polichimioterapeutic între cazurile de leucemie acut� limfoblastic� �i cazurile de leucemie acut� mieloblastic�;
6. Datele prezentate reflect� atât condi�iile de metabolism celular caracteristice celulelor tumorale cât �i tulbur�rile induse de citostatice. Separarea acestor dou� elemente nu are consecin�e practice, ne intereseaz� imaginea global� care poate s� sugereze puncte de interven�ie diagnostic�, prognostic�, de supraveghere �i poate explica anumite fenomene atât pentru cercet�tor cât �i pentru clinician.
Rezultatele studiilor întreprinse î�i aduc aportul în domeniul cercet�rilor fundamentale,
prin eviden�ierea unor mecanisme moleculare ale metabolismului energetic, implicate în r�spunsul la tratamentul antineoplazic. În acela�i timp studiul prezint� posibilit��i reale de aplicabilitate în modificarea strategiilor �i standardelor terapeutice din domeniul oncologiei �i onco-hematologiei.
BIBLIOGRAFIE
1. Ardelean A., Biologia molecular� a medicamentului, “Vasile Goldi�” University Press, Arad, 2009, 49-53. 2. Carew J.S., Huang P., Mitochondrial defects in cancer, Molecular Cancer, 2002; 1:9, 7. 3. Kopper L., Fesus L., Apoptozis, Medicina Konyvkiado R.T., Budapest, 2002, 103-115. 4. Korkopoulou P., Konstantinidou A.E., Kavantzas N., Patsouris E., Pavlopoulos P.M., Cjristodoulou P., Thomas-Zsalgi E., Davaras P. - Morphometric microvascular characteristics predict prognosis in superficialand invasive bladder cancer, Virchows Arch, 2001, 438: 603-611.
20
5. Kroemer G., Pouysseger J., Tumor cell metabolism: Cancer’s Achilles Heel, Cancer Cell, 2008, 13, 6:472-482. 6. Lopez-Lazaro M., A new view of carcinogenesis and an alternative approach to cancer therapy, Molecular Medicine, 2010, 16 (3-4), 144-153. 7. Lopez-Lazaro M., Role of oxygen in cancer looking beyound hypoxia, Anticancer Agents Medical Chemystry, 2009, 9: 517-525. 8. Lopez-Lazaro M., The Warburg effect why and how do cancer cells activate glycolysis in the presence of oxygen, Anticancer Agents Medical Chemistry, 2008, 8(3): 305-312. 9. Mixich F., Ardelean A., Principii fundamentale de biologie molecular�, Editura Medical� Universitar� Craiova, 2002, 292-305. 10. Mure�an, E., Bogdan, A.T., Gaboreanu, M., Baba, A.I., Tehnici de histochimie normal� �i patologic�, Ed. Ceres, Bucure�ti, 1976, 5-74, 185-214, 317-319. 11. Nagy V. Principii de cancerologie, Celula malign� �i fenotipul malign, Editura Medical� Universitar� Cluj-Napoca, 2007, 46-67. 12. Nicolau S. Popa I., Oncologie general� �i oncopediatrie, Editura Helicon, Timi�oara, 1999, 358-379. 13. Ross M.H., Pawlina W., Histology: A Text and Atlas, With Correlated Cell and Moleclar Biology, Fifth Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2007, 459-472. 14. Verde� D., Mitocondria, Editura Mirton, Timi�oara, 2000, 78-106. 15. Warburg O., On the origin of cancer cells, Science, 1956; 123: 309-314. Lista lucr�rilor tiinifice publicate din teza de doctorat cuprinde 9 titluri Anexa 1 cuprinde Formular de informare �i consim��mânt Anexa 2 cuprinde Chestionarul de evaluarea st�rii de s�n�tate �i func�ional�
top related