medicina celulara lp 05 anticorpi

Procedee microscopice de

investigare celulară

prin folosirea

anticorpilor

Dr. Cătălin Gabriel MANOLE

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Definiţia noţiunii de anticorp

• ANTICÓRP s. m. proteină specifică elaborată de organism ca răspuns la pătrunderea unui antigen. (< fr. anticorps) (DEX)

N.B. Prin antigen înţelegem orice proteină străină de organismul care produce anticorpul.

O imunoglobulină, în forma literei “Y”, produsă de limfocitele B, folosită de sistemul imun pentru identificarea și neutralizarea particulelor străine.

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Epitop

Paratop

Definiţia noţiunii de anticorp

Interacționează specific cu o

secvență de aminoacizi

(EPITOP) din structura unei

proteine (ANTIGEN)

Fiecare braț al anticorpului

conține un paratop, care este

specific pentru un singur

epitop.

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Epitop

Paratop

1. Regiunea Fab

2. Regiunea Fc

3. Lanț greu

4. Lanțurile ușoare

5. Paratop

6. Regiune balama

Structura generală

a anticorpilor

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

• Imunomarcare pentru microscopia optică

– Imunohistochimia

– Imunofluorescența

• Imunomarcare pentru microscopia electronică

– Imuno-electrono-microscopia

Metode de utilizare a

anticorpilor în microscopie

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Metode de

imunomarcare pentru microscopie

• Metoda directă

• Metoda indirectă

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

• Reprezintă totalitatea tehnicilor care folosesc

anticorpi pentru localizarea antigenelor

corespunzătoare

– pe secțiuni tisulare

• Criosecțiuni

• Secțiuni la parafină

– pe celule în cultură

• Face posibilă vizualizarea distribuției și localizării

componentelor celulare în microscopie optică

Imunomarcarea

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Principiul metodei

• Recunoașterea specifică a unui antigen (Ag) de către un un

anticorp (Ac)

• Ac sunt purificați din serul animalelor de laborator

• Ac vor fi cuplați cu un sistem de detecție

– ENZIMĂ căreia i se furnizează un SUBSTRAT care va fi

transformat într-un compus colorat (IMUNOHISTOCHIMIE)

• Vizualizare în microscopie optică, cu lumină directă

– MOLECULE FLUORESCENTE (IMUNOFLUORESCENȚĂ)

• Vizualizare în microscopie de fluorescență

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Metoda directă

- anticorp primar marcat -

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Metoda indirectă

anticorp primar nativ și anticorp

secundar marcat

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

{ IMUNOHISTOCHIMIA

Imunohistochimia

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Enzimă Substrat Culoare

Proxidaza de hrean Horseradish peroxidase

(HRP)

3,3'-diaminobenzidină (DAB) Brun-negru

Forfataza alcalină Alkaline phosphatase (AP)

Combinație de clorură de

tetrazoliu (nitro blue tetrazolium

chloride NBT) și 5-bromo-4-cloro-

3-indolil-fosfat (BCIP)

Negru – violet

http://www.ihcworld.com/products/ihc-detection-system/Chromogen.htm

DAB+ kit

BCIP/NBT

• Structuri membranare

• Organite celulare

• Componente nucleare

Ce structuri celulare pot fi

marcate ?

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Ac pentru ribozomi

ovar

Ac pentru mitocondrii

colon

Ac pentru

componente ale membranei plasmatice

ficat ficat

Ac pentru

componente ale invelișului nuclear

Evaluarea proliferării celulare

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Evaluarea apoptozei

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

IMUNOFLUORESCENȚA

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

• O variantă de luminiscență

• O moleculă capabilă de fluorescenţă (fluorofor,

sau fluorocrom) excitată cu lumină de o anumită

lungime de undă, va emite o radiație

electomagne-tică cu o lungime de undă

superioară, în spectrul vizibil

• Parametrii:

– Spectru de absorbție/excitație

– Spectru de emisie

– Intensitate

– Durată

Fluorescența

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Spectrul

electromagnetic

Microtubuli

ADN

Ribozomi

Filamente de actină

ADN

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

ADN (cromozomi)

Microtubuli (fus de diviziune)

Imuno-electrono

microscopia

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

• Metoda a fost introdusă pentru prima oară în

1971 de către Faulk & Taylor

• Folosește anticorpi adsorbiţi pe particule de aur

(5-30 nm)

• După caracteristicile anticorpului primar şi

structura celulară căreia se adresează

marcarea se poate realiza:

– pre-includere

– post-includere

• Metoda mai scumpă și mai laborioasă

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Date generale

- Cea mai bună metodă pentru detectarea și

localizarea proteinelor în diferite

compartimente celulare datorită puterilor de

mărire și de rezoluție superioare

Scop

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București

Prolactină în

granule de secreţie

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968432811001417

http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=2800001_jkms-25-16-g005&req=4

http://www.bio.davidson.edu/people/kabernd/BerndCV/Lab/EpithelialInfoWe

b/Transcytosis.html

În celule endoteliale din ficat

În endoteliul

aortic

IMUNOHISTOCHIMIE

IMUNOELECTRONOMICROSCOPIE

Evidenţieri

pentru

caveolină 1