leucocite curs

SÂNGELESÂNGELELeucociteleLeucocitele

LeucociteleLeucocitele

TerminologieMetode: frotiul, citometria in fluxExista 5 tipuri de leucocite:

neutrofile, eozinofile, bazofile, limfocite, monocite Numar, durata de viata, functieMorfologie clasica si ultrastructuraModificari ale numarului,

morfologiei si tinctorialitatii in cursul unor boli

“leuko”-, “leuco”- (Gr. leukos) - albalb

“poli” (Gr. “polys”) - mai multe

“morfo”- (Gr. “morphe”) - formă

“granula” (lat. “granula”) - particulă de mici dimensiuni

“cit” (cytos) – (Gr. kytos) - - celulă

TerminologieTerminologie

“chemotaxie” (Gr. “chemo” + “taxis”, aranjament) - orientare a unei celule de-a lungul unui gradient de concentraţie chimică sau mişcarea în direcţia gradientului

leucopenie (leucocit + Gr. “penia”, sărăcie) - reducerea numărului de leucocite

leucemie (Gr. “leukos”, alb + emia, derivat de la “haima”, sânge)

TerminologieTerminologie

Coloraţia uzuală: MAY – GRUNDWALD – GIEMSA

Ingrediente: COLORANTI baziciCOLORANTI bazici

albastru de metilen

azurul de metilen COLORANT acidCOLORANT acid

eozina

TTehnica frotiuluiehnica frotiului

Examenul electronomicroscopicExamenul electronomicroscopic

Citometria Citometria îîn fluxn flux

LeucociteleLeucocitele

Leucocitele, aflate numai în tranzit in spatiul vascular

Sunt populaţii celulare heterogene

Funcţia lor: în ţesuturi

Morfologie clasică şi ultrastructură mai apropiate de modelul conceptual de celulă

Număr:4-11 x 109/l = 4-11 x106/ml = 4.500 - 10.000 celule /l

5 populaţii principaleProporţie relativă = formula leucocitară

Neutrofile: 40-75% Eozinofile: 3% granulociteBazofile: 0,5%Limfocite: 25-50%Monocite: 1-5%

LeucociteleLeucocitele

agranulocite

Modificări ale formulei Modificări ale formulei leucocitareleucocitare

LeucocitozăSplenectomieBoli inflamatoriiLeucemiiStressArsuriDupă tratament cu: epinefrina, aspirina, heparina,

corticosteroizi

Leucopenie Insuficienţă a măduvei osoase hematogeneLupus eritematosBoli hepaticeAntibiotice, barbiturice,anticonvulsivante, diuretice, citostatice

NeutrofileleNeutrofilele Numar:

3000-6000/l adult Proportie relativa: 40-75% Dimensiuni:

10-12 m pe frotiu Nucleu:

heterocromatic, fara nucleoli forma de potcoava, cel. tanara 2-5 lobi nucleari, uniti prin filamente corpusculul Barr = apendice nuclear

Citoplasma abundenta, roz portocalie

Granule: fine unele roz-portocalii altele violet

N/C: 1:1

Durata de viata: 6 ore in sange 1-4 zile in tesuturi

Morfologia neutrofiluluiMorfologia neutrofilului

May-Grunwald-Giemsa +TEMMay-Grunwald-Giemsa +TEM

NeutrofileleNeutrofileleDistribuţie:

neutrofile circulanteneutrofile marginalizate în vecinatatea

endoteliului capilarelor şi venulelor postcapilare.

Stadiul de evoluţie:Forme celulare finale, diferenţiate

Ultrastructural:detalii privind distribuţia granulelor

Granulele neutrofiluluiGranulele neutrofiluluiHistochimic: - granulele azurofile – reacţie pozitivă pt.:

peroxidazăfosfatază acidă glucuronidază (corespund lizozomilor din alte

celule)

- granulele specificefosfatază alcalină lizozim lactoferinăfagocitine (proteine bazice)

Funcţie: fagocitoza

Neutrofilele - Neutrofilele - mmicrofagociteicrofagociteStări funcţionale: a) celulele inactive,

b) celulele activate (celule anterior inactive), care-şi schimbă comportamentul prin:

agregaredegranulareiniţierea producţiei de agenţi oxidanţi.

Factori ce declanşează activarea neutrofilelor:microorganismefactori chemotactici în concentraţie mare.

Etapele distrugerii unui microorganism:identificarea microorganismeloringestiadistrugerea, liza microorganismuluiprelucrarea materialului rezultat din liză.

Neutrofile - SEMNeutrofile - SEM

Neutrofilele – funcNeutrofilele – funcţţieieIDENTIFICAREA MICROORGANISMELOR

Adeziunea la suprafeţe: necesară pentru migrarea prin ţesuturi la locul unui proces inflamator.

Mecanisme: Molecule de adeziune:glicoproteine de suprafaţă (ex. CD 11/CD 18) ce se leagă de alte proteine de suprafaţă: ICAM - (Inter Cellular Adhesion Molecule), exprimate pe:

- fibroblaste- epitelii- endoteliile vascularea)structură de suprafaţă a neutrofilului, legată de ELAM – 1

(endothelial – leukocyte adhesion molecule).

InteracInteracţţiunea cu endoteliuliunea cu endoteliul

Familii de receptori de adeziuneFamilii de receptori de adeziune

•Integrine

•Caderine

•Selectine

•Imunoglobuline

Molecule de adeziuneMolecule de adeziune

Neutrofilele – funcNeutrofilele – funcţţieie Factori chemotactici: substanţe eliberate continuu

în locul în care microorganismele au invadat un ţesut.

oligopeptide N-formilate fracţiunea C5a a sistemului complementului leucotriena B4 (LTB4), produs al oxidării acidului

arahidonic

Etape: marginalizarea în capilar şi endoteliul postcapilar migrarea prin peretele vasului (enz. colagenază),

prin membrana bazală subendotelială migrare până la locul eliberării factorilor

chemotactici

Neutrofilele – funcNeutrofilele – funcţţieie INGESTIA = Opsonizare: acoperirea unei particule cu o

proteină plasmatică, recunoscută de receptorii neutrofilului ca semnal pentru ingestie.

Opsonine: proteine capabile să opsonizeze ţinte pentru ingestia de către neutrofile

anticorpi din clasa IgG componenta C3b a complementului

Ataşarea particulei de către receptori Fc receptori Receptorii C3 care recunosc receptorii ataşaţi

fracţiunii C3b.

Neutrofilele – funcNeutrofilele – funcţţieie

ATAŞAREA PARTICULEI = SEMNAL PENTRU INGESTIE. Locul digestiei intracelulare: vezicula fagocitică. Digestia – Mecanisme: Degranularea = procesul prin care membrana unei

granule fuzionează cu membrana plasmatică, rezultatul fiind eliberarea conţinutului granulei.

Poate avea loc: - în compartimentul transmembranar – vezicula

fagocitică - în mediul exterior al celulei (Granulele azurofile se degranulează exclusiv în

veziculele de fagocitoză.) Activarea lanţului respirator cu producerea de radicali

liberi, bactericizi.

Neutrofilele – funcNeutrofilele – funcţţieie

EozinofileleEozinofileleOrigine:Origine: măduva osoasă hematogenă - cel. stemDistribuţia:Distribuţia:

în sânge în ţesuturile ce posedă o interfaţă epitelială cu mediul:

ap. respirator ap. digestiv ap. genito-urinar, porţiunea inferioară.

Numărul:Numărul: - 450/l; 1-3 din leucocite

pentru o celulă circulantă există 300 în ţesuturiDurata de viaţă: Durata de viaţă:

mai mare decât a neutrofilelor

în ţesuturi : săptămâni

EozinofileleEozinofilele

Criterii de diagnostic: Diametru :Diametru : 12m Raport nucleo-citoplasmaticRaport nucleo-citoplasmatic: 1:1 Forma nucleuluiForma nucleului: 0-2 lobi nucleari,

arareori 3-4 (filamente de 0,5m între lobii nucleari) (,,în desagă”)

Poziţia nucleuluiPoziţia nucleului: central sau excentric

NucleoliNucleoli: absenţi CCitoplasmitoplasmaa: citoplasmă abundentă,

roz GranuleGranule: prezente, distribuite

uniform, eozinofile

Morfologia eozinofiluluiMorfologia eozinofilului

May-Grunwald-Giemsa +TEMMay-Grunwald-Giemsa +TEM

Eozinofilele Eozinofilele

Ultrastructurălizozomigranulele specifice (care în coloraţia

obişnuită leagă coloranţi acizi tip eozină) – structuri ce conţin un miez cristaloid (diferit în funcţie de specie).

miezul cristaloid - înglobat într-o matrice amorfă sau fin granulară.

Compoziţia granulelor: hidrolaze lizozomale

aril sulfataze glucuronidazăfosfatază acidăhistaminăribonuclează

proteine cationice (nu se află alte tipuri de lizozomi)Proteina bazică principală

(“Major basic protein” = MBP)

PeroxidazăProteina cationică a

eozinofilelorNeurotoxina

EozinofileleEozinofilele - - func funcţţieieApărarea împotriva unor

organisme ce nu pot fagocitate, mai ales paraziţi helmintici, multicelulari

Fagocitoză şi liză bacteriană (funcţie fără importanţă in vivo)

Reacţia de respingere a grefelor;

Mecanism: - utilizarea granulelor proteice cationice citotoxice

Eozinofilele Eozinofilele - - funcfuncţţieieInfecţia parazitară însoţită de:

a) creşterea nivelelor serice de IgE

b) creşterea numărului de eozinofileCele două fenomene date de sinteza de limfokine:

a) IL 4

b) IL 5;Etapa intermediară : activarea mastocitelor, care duce la

creşterea producţiei de IgE şi eliberarea de factor chemotactic pentru eozinofile.

Unii paraziţi : acoperiţi cu IgE şi IgG.Eozinofilele aderă => eliberare de proteine cationice şi

peroxidază.

EozinofileleEozinofilele - - func funcţţieieactivarea eozinofilelor poate fi toxică pentru organismul

gazdă:ÎN BOLILE ALERGICE, inclusiv astmul bronşic,

eozinofilele eliberează mediatori lipidici (leucotriena C4) şi factor activator plachetar, care pot declanşa:

- contracţia muşchiului neted vascular

- modificarea permeabilităţii vasculare

- creşterea secreţiei de mucus

- eliberarea de mediatori din mastocite şi bazofile

Funcţii bazate pe cooperarea cu alte celule (limfocitele) - în curs de investigare.

Astmul bronşicAstmul bronşic

Eozinofilele şi LTEozinofilele şi LT

BazofileleBazofilele

Origine:Origine: celulele stem din măduva osoasă hematogenăCelulele cu proprietăţi asemănătoare cu mastocitele din

ţesutul conjunctivNumăr:Număr: 15-20/l; aproximativ 100 milioaneDurata de viaţă:Durata de viaţă: scurtăStadiul de evoluţie:Stadiul de evoluţie: - formă celulară finală, nu se mai

divide

BazofileleBazofileleCriterii de diagnostic DiametruDiametru: 12-15mN/C/C: 1:1Forma nucleuluiForma nucleului: incomplet segmentat, în

“frunză de trifoi”Pozitia nucleuluiPozitia nucleului: central sau excentricAspectul nucleuluiAspectul nucleului: heterocromaticNucleoliNucleoli: absenţiCitoplasmaCitoplasma: abundenta, bazofilăGranuleGranule: prezente

neuniformeculoare albastru închis / negruhidrosolubile

Morfologia bazofiluluiMorfologia bazofilului

Bazofilele ME + histochimieBazofilele ME + histochimieUltrastructurăcomplex Golgipuţine mitocondriiR.E. ceva mai abundent

decât în alte leucociteparticule de glicogenGranule : - specifice, sunt

rotunde sau ovale, aproximativ 0,5 m, acoperă nucleul

electronodense

Compoziţia granulelor: histaminăheparinănu există date care să arate

prezenţa hidrolazelor lizozomale comune

MastociteMastocite

Bazofilele Bazofilele - - funcfuncţţieie proporţie mică din totalul leucocitelor: tendinţa de a le considera neimportante;

degranularea lor rapidă: consecinţe severe;

la anumiţi indivizi, anumite antigene pot induce formarea unei clase distincte de imunoglobuline: IgE;

Bazofilele au receptori pentru IgE în membrane

Consecutiv unei expuneri la antigen, IgE se acumulează pe suprafaţa bazofilelor şi mastocitelor

Re-expunerea individului la acelaşi antigen poate duce în decursul a câteva minute – la legarea antigenului de IgE de pe bazofile sau mastocite, urmată de degranularea rapidă, cu eliberare de HISTAMINĂ şi alţi mediatori.

Se poate precipita o criză de astm bronşic sau urticarie, cea mai gravă consecinţă putând fi şocul anafilactiv.

LimfociteleLimfociteleOrigineOrigine: Celulele stem din măduva osoasăNumărNumăr: 1500-3000/l; 5-10 miliarde în circulaţie,

2x1012 în întregul organismDistribuţiaDistribuţia în organism

în sânge în organe limfoide specializate ca: timusul, ganglionii

limfatici, splina, amigdala palatină etc.Durata de viaţăDurata de viaţă:

lungă, întrucât cea mai mare parte sunt continuu recirculate.

ParticularitateParticularitate: recirculaţia limfocitelor depinde de interacţiunile

specifice între suprafaţa celulară limfocitară şi suprafaţa unor celule endoteliale din vasele organelor limfoide

migrările : ghidate de receptori de pe limfocite şi liganzi pentru aceşti receptori (contra-receptori) de pe celulele endoteliale.

Stadiul de evoluţieStadiul de evoluţie – celulele capabile de diferenţiere şi proliferare.

LimfociteleLimfociteleCriterii de diagnosticDiametruDiametru:

limfocite mici 6-8 m limfocite mari 12 m limfocite medii : 10 m

N/CN/C: 4:1 (3:1)Forma nucleuluiForma nucleului: rotund sau

indentat, excentricAspectAspect: tahicromatic ,,în pată

de cerneală”NucleoliNucleoli: de regulă absenţiCitoplasmăCitoplasmă: inel perinuclear,

bazofil, ,,albastru – cer senin”GranuleGranule: de regulă absente.

LimfociteleLimfociteleUltrastructurăStare de repaus : complex Golgi foarte redus, o pereche de

centrioli, câteva mitocondriinu se pot deosebi limfocitele T, de limfocitele BStare activată:

celulele B (stadiu final plasmocit): sunt pline cu structuri ale R.E.R. (sinteză de Ig);

celulele T : relativ puţin RER, dar conţine numeroşi ribozomi liberi.Populaţii de limfociteCriterii de diferenţiere:

• M.O. – nu• M.E. – numai în stare activată• Metode imunocitochimice: identificarea unor markeri specifici de suprafaţă.

Morfologia limfocituluiMorfologia limfocitului

Limfocitele funcLimfocitele funcţţieieSistemul imun : compus din milioane de clone (familii) de

limfocite. Limfocitele fiecărei clone posedă un receptor de suprafaţă unic (= aparţine numai acelei clone).

Acest receptor permite legarea unui determinant antigenic specific.

Clase mari de limfocite:B – produse în măduvă, sintetizează anticorpiT – produse în timus : participă la răspunsuri mediate

celular.Memorie imunologică şi toleranţă imunăîn evoluţia limfocitelor 3 stadii:- celule ,,naive”- celule ,,cu memorie”- celule ,,activate”

Limfocit B - SEMLimfocit B - SEM

Limfocite T - SEMLimfocite T - SEM

Limfocitele Limfocitele - - funcfuncţţieie

Limfocite naive

Prima întâlnire cu Ag

Proliferare Activare

Limfocite cu memorie

Limfocitele BLimfocitele B - - func funcţţieieLipsa de răspuns faţă de structurile proprii: toleranţă

imunologică.Mecanisme: - distrugerea clonelor ,,autoreactive”/ inactivareaReactivarea unor clone autoreactive : boli auto-imune.Anticorpii (imunoglobulinele)

= molecule sintetizate de limfocitele B diferenţiate în plasmocite.

= molecule ce posedă un situs de recunoaştere a antigenului specific şi regiuni care pot activa complementul şi fagocitele (care posedă receptori pentru Ac)

Fiecare plasmocit sintetizează un singur tip de anticorp.

AnticorpiiAnticorpiiAnticorpul este plasat de

plasmocit pe suprafaţa sa ca un receptor.- formă de Y- 4 lanţuri polipeptidice

- 2 grele; - 2 uşoare

• 5 clase de Ig: Ig A, Ig D, Ig E, Ig G, Ig M, fiecare cu lanţuri grele specifice.

Limfocitele TLimfocitele T - - claseclase Limfocite T citotoxice CD8 – lizează direct celule infectate

(mai ales cu virusuri)

Limfocite T ajutătoare (helper) CD4 – facilitează producerea de anticorpi de către limfocitele B şi determină macrofagele să ingere şi să distrugă bacterii;

Limfocite NK “natural killer” – recunosc antigenul prezentat de CD1a

Limfocite T supresoare – LT reglatoare - în timus

Limfocite cu memorie

Limfocitele TLimfocitele T - - func funcţţiiii

Receptorii celulelor T recunosc fragmente de proteine care sunt expuse pe suprafaţa celulelor gazdă în asociere cu molecule ale sistemului major de histocompatibilitate (MHC).

Există 2 clase de astfel de molecule:

clasa I, exprimate pe aproape toate celulele nucleate;

clasa II, exprimate numai celulelor ce interacţionează cu limfocitele T.

Limfocitele TLimfocitele Tcc: func: funcţţiiii

Lizează direct celulele ţintă infectate. Mecanisme:

inducerea apoptozei (moarte celulară programată)

Etape mecanism I: eliberarea unei proteine denumită perforină: ce

polimerizează şi formează canale transmembranare; eliberare prin exocitoză locală; pătrundere a unor proteaze ce provoacă proteoliza unor

molecule şi provoacă inducerea morţii celulare programate;

Etape mecanism II: activarea unui receptor de suprafaţă; semnalizare => moarte celulară programată via receptori membranari.

Limfocitele TLimfocitele Tcc CD8 CD8 : func: funcţţiiii

Limfocitele TLimfocitele Thh: func: funcţţiiiiActivează limfocitele B şi macrofagele.Mecanism:Mecanism: activarea LTh necesită 2 semnale:

a) complexul proteine ale clasei II a sistemului major de histocompatibilitate;

b) un semnal al celulei care prezintă antigenul.

Consecinţa activării:Consecinţa activării:

a) stimularea propriei proliferări prin secreţia de IL-2

b) activarea celulelor ţintă prin secretarea de molecule – semnal şi molecule legate de membrană.

Limfocitele TLimfocitele Thh CD4 CD4: func: funcţţiiii

Limfocitele şi eozinofileleLimfocitele şi eozinofilele

MonociteleMonociteleOrigine: Celulele stem din măduva osoasăNumăr: 300-500/l; 2-3 miliarde în sangeDistribuţia în organism si durata de viata

în sânge 12-48 de ore în ţesuturi: macrofage tisulare

Particularitate: - monocitele împrumută o varietate de caracteristici morfologice tinctoriale în ţesuturi;

poartă markeri de suprafaţă care facilitează identificarea lor cu ajutorul unor anticorpi monoclonali îndreptaţi împotriva acestor markeri- aceeaşi markeri se află pe suprafaţa: ¶ macrofagelor conjunctive¶ macrofagelor alveolare¶ celulelor KUPFFER hepatice

Stadiul de evoluţie:- capacitate limitată de diviziune- capacitate limitată de diferenţiere: MACROFAG- nu există dovezi ale re-circulării lor după

trecerea în ţesutul conjunctiv.

MonociteleMonociteleCriterii de diagnosticDiametru : 12-20 mN/C: 2:1 sau 1:1Forma nucleului: plicaturată (cerebriformă)

sau alungită, în formă de potcoavă, central sau excentric

Aspect: formă reticulară, “în tablă de şah” (alternanţă hetero/encromatină)

Nucleoli: absenţiCitoplasma: - abundentă, bazofilă, albastru

închis (“cerul înainte de furtună”)Granulaţii: foarte fine (granule primare)

palide, roz, prăfoase, dispersate, la limita de rezoluţie a M.O.

Morfologia monocituluiMorfologia monocitului

May-Grunwald-Giemsa +TEMMay-Grunwald-Giemsa +TEM

Ultrastructura monocituluiUltrastructura monocitului Nucleul:

cromatina este mai puţin condensată decât în limfocite

nucleoli vizibili Citoplasma:

mici complexe Golgi câteva cisterne ale R.E. particule de glicogen

dispersate număr moderat de

ribozomi liberi granule dense

corespunzând granulelor azurofile, vizibile la M.O.

Monocitele Monocitele - - histochimiehistochimie

Citochimic: granulele reacţionează pozitiv pentru hidrolazele acide,

caracteristice lizozomilor.

Monocitele Monocitele - - funcfuncţţieie Rol funcţional: comun pentru sistemul fagocitelor

mononucleare- secreţie- ingestie- interacţiune cu limfocitele

Secreţia: substanţe proteice neproteice

StareaStarea funcţională a funcţională a monocituluimonocitului

RepausCelulă activată

LizozimIL-1

Leucotriene

Lizozim Proteaze neutre

ElastazăColagenază

Activator de plasminogenSuperoxid

MonociteleMonocitele - - func funcţţieie

Ingestia: Material ingerat: celule senescente, detritusuri celulare

Ex. eritrocitele senescente – macrofagele splenice material străin (non-self): bacterii şi produşi de

degradare (splină, ficat) proteine denaturate, fragmente proteice,

proteine formate ,,in vivo” (factori de coagulare)

Mecanismele ingestiei - pinocitoză - fagocitoză

Monocitele: Monocitele: particularităţi faţă de particularităţi faţă de neutrofileneutrofile

Monocitele se pot ataşa via mai multe tipuri de molecule de adeziune

Pot fagocita proteinele opsonizate atât cu IgE cât şi cu IgG.

Deplasarea: ca urmare a unor factori chemotactici limfocitari

Receptori pentru manoză - pot fagocita bacterii fără opsonizare prealabilă.

Liza propriu-zisă: prin oxidanţi de tip radical hidroxil

Pot distruge particule cu localizare intracelulară - dar fagocitul trebuie să fie activat.

Interacţiunea cuInteracţiunea cu limfocitelelimfocitele

Etape: ingestia unei particule purtătoare de Ag degradarea particulei în peptide mici transferarea pe suprafaţa fagocitului, care exprimă complexul major II

de histocompatibilitate, legat de acesta legarea limfocitului T care poartă un receptor adecvat secreţia de mediatori de către ambele celule:

limfocitele T : limfokine : gama – interferon factor chemotactic pentru monocite

mononuclearele : monokine : - stimulează proliferarea limfocitelor T IL-1; prin promovarea secreţiei de interleukină 2 TNF (tumor necrosis factor).

Receptori şi molecule de adezivitate Receptori şi molecule de adezivitate ale monocituluiale monocitului

Macrofagele Macrofagele - - funcfuncţţieie

Macrofage – funcMacrofage – funcţţieie