Ameliorarea genetică a speciilor forestiere

Curs pentru învăţământul la distanţă Conf. univ. dr. Liviu FĂRTĂIŞ

Anul universitar: 2009-2010 UNIVERSITATEA „ŞTEFAN CEL MARE” SUCEAVA

FACULTATEA DE SILVICULTURĂ Departamentul de Învăţământ la Distanţă

CUPRINS

I. CAPITOL INTRODUCTIV 1.1.Ameliorarea arborilor. Definiţie şi specificul disciplinei………………………………… 1.2 Scurt istoric………………………………………………………………………………. II. OBIECTIVELE AMELIORĂRII ARBORILOR 2.1. Trăsături genetice specifice arborilor…………………………………………………… 2.2. Obiective cantitative……………………………………………………………………. 2.3. Obiective calitative……………………………………………………………………… 2.3.1. Obiective calitative extrinseci………………………………………………………. 2.3.2. Obiective calitative intrinseci………………………………………………………. III. METODE CLASICE DE AMELIORARE FORESTIERĂ 3.1. Selecţia…………………………………………………………………………………... 3.1.1. Principii fundamentale ale ameliorării prin selecţie………………………………… 3.1.2. Formele selecţiei artificiale………………………………………………………….. 3.1.3. Determinarea efectelor selecţiei……………………………………………………... 3.1.4. Ameliorarea prin selecţie – etape generale………………………………………….. 3.1.4.1. Ciclul de selecţie şi ciclul de ameliorare………………………………………… 3.1.4.2. Repetarea ciclurilor de selecţie………………………………………………….. 3.1.5. Limitele selecţiei…………………………………………………………………….. 3.1.5.1. Limite genetice şi biologice……………………………………………………... 3.1.5.2. Limite metodologice…………………………………………………………….. 3.1.6. Strategii de selecţie………………………………………………………………….. 3.1.7. Etapele principale ale unui program de selecţie…………………………………….. 3.1.7.1. Alegerea provenienţelor…………………………………………………………. 3.1.7.2. Identificarea populaţiilor semincere…………………………………………….. 3.1.7.3. Crearea populaţiilor de producţie – plantaţii semincere, plantaje………………. 3.2. Hibridarea……………………………………………………………………………….. 3.2.1. Principii generale privind aplicarea tehnicilor de hibridare………………………… 3.2.2. Criterii şi modalităţi concrete de hibridare………………………………………….. 3.2.3. Particularităţi ale reproducerii sexuate la arbori…………………………………….. 3.2.3.1. Aspecte teoretice şi practice asupra înfloririi şi fructificaţiei la arbori………….. 3.2.3.2. Fenomenul de incompatibilitate interspecifică în ameliorarea forestieră……….. 3.2.3.3. Explicarea fenomenului de androsterilitate…………………………………….... IV. METODE MODERNE DE AMELIORARE FORESTIERĂ 4.1. Mutageneza şi implicaţiile practice în ameliorarea forestieră…………………………… 4.1.1. Interesul obţinerii de varietăţi poliploide la speciile forestiere……………………… 4.1.2. Obţinerea de poliploizi la răşinoase…………………………………………………. 4.1.3. Obţinerea de poliploizi la răşinoase…………………………………………………. 4.1.4. Mutaţii genice şi cromozomiale la speciile forestiere……………………………….. 4.2. Cultura in vitro de celule şi ţesuturi vegetale……………………………………………. 4.2.1. Specificul activităţii în cadrul unui laborator de culturi in vitro…………………….. 4.2.2. Aclimatizarea în seră şi repicajul în pepinieră………………………………………. 4.2.3. Rezultate obţinute la speciile forestiere……………………………………………..

4.3. Inducerea şi obţinerea de haploizi………………………………………………………. 4.3.1. Obţinerea de haploizi prin androgeneză……………………………………………. 4.3.2. Obţinerea de haploizi prin ginogeneză……………………………………………… 4.3.3. Importanţa genetică a haploizilor…………………………………………………… 4.4. Cultura de embrioni sexuaţi in vitro……………………………………………………. 4.5. Embriogeneza somatică şi seminţele artificiale………………………………………… 4.5.1. Embriogeneza somatică…………………………………………………………….. 4.5.2. Tehnologia obţinerii seminţelor artificiale………………………………………….. 4.6. Obţinerea şi cultura protoplaştilor. Hibridarea celulară (somatică)……………………. 4.6.1. Obţinerea de protoplaşti…………………………………………………………….. 4.6.2. Fuzionarea protoplaştilor…………………………………………………………… 4.7. Transferul de gene şi obţinerea plantelor transgenice………………………………….. 4.7.1. Obţinerea pe cale biologică (indirectă) a ADN-ului recombinant………………….. 4.7.2. Transferul de gene la arbori cu ajutorul plasmidelor Ti şi Ri………………………. 4.7.3. Transferul direct de gene (transfecţie)……………………………………………… 4.7.4. Strategii sens şi antisens…………………………………………………………….. 4.7.5. Realizări în sectorul agricol……………………………………………………….... 4.7.6. Realizări în silvicultură……………………………………………………………... 4.7.7. În loc de concluzii…………………………………………………………………... V. PRINCIPIILE SILVICULTURII CLONALE 5.1. Tehnici de multiplicare vegetativă……………………………………………………… 5.1.1. Altoirea…………………………………………………………………………….... 5.1.2. Marcotajul…………………………………………………………………………… 5.1.3. Drajonarea…………………………………………………………………………… 5.1.4. Butăşirea…………………………………………………………………………….. 5.1.5. Micropropagarea…………………………………………………………………….. 5.2. Utilizarea clonelor………………………………………………………………………. 5.2.1. Modele de silvicultură clonală………………………………………………………. 5.2.2. Tentative noi în silvicultura clonală………………………………………………… 5.2.3. Riscuri şi limite în silvicultura clonală……………………………………………… VI. CONSERVAREA RESURSELOR GENETICE FORESTIERE (RGF) 6.1. Definiţii, generalităţi şi grupe principale de resurse genetice la principalele specii forestiere……………………………………………………………………………………... 6.2. Importanţa studiului diversităţii biologice în perspectiva identificării, conservării şi utilizării durabile a RGF……………………………………………………………………... 6.3. Conservarea germoplasmei forestiere…………………………………………………… 6.3.1. Conservarea in situ a RGF…………………………………………………………... 6.3.1.1. Crearea de parcuri şi rezervaţii naturale………………………………………… 6.3.1.2. Rezervaţiile de seminţe………………………………………………………… 6.3.1.3. Interzicerea accesului şi exploatărilor preferenţiale……………………………. 6.3.2. Conservarea ex situ a RGF…………………………………………………………. 6.3.2.1. Arboretum-urile şi parcurile dendrologice…………………………………… 6.3.2.2. Culturile comparative de provenienţe şi hibrizi………………………………... 6.3.2.3. Parcurile de clone………………………………………………………………. 6.3.2.4. Livezi de seminţe………………………………………………………………. 6.3.2.5. Băncile de gene………………………………………………………………….

I. CAPITOL INTRODUCTIV

1.1.Ameliorarea arborilor. Definiţie şi specificul disciplinei

În sens strict genetic, ameliorarea este disciplina care se ocupă cu îmbunătăţirea calităţilor plantelor cultivate şi animalelor domestice, în sensul ameliorării eredităţii acestora în direcţia dorită de către om (ameliorator).

Deşi multă vreme (secole sau chiar milenii) a fost realizată empiric (de bază fiind selecţia fenotipică pentru nevoi imediate), ameliorarea plantelor şi animalelor s-a impus treptat, cu timpul devenind o ştiinţă, prin apariţia lucrărilor fundamentale ale unor mari savanţi din domeniul ştiinţelor biologice precum Darwin, Mendel, Morgan, de Vries, Vavilov etc. În ceea ce priveşte ameliorarea speciilor forestiere trebuie ţinut cont de specificitatea biologică a arborilor în raport cu alte specii vegetale, de rolul lor structural şi funcţional fundamental în cadrul ecosistemelor forestiere şi, nu în ultimul rând, de faptul că sunt specii “sălbatice” foarte vechi (gimnospermele au apărut încă din era primară, cu apogeu în mezozoic) ce posedă sisteme genetice complexe şi foarte greu de modificat (Stănescu, 1983). De asemenea, arborii sunt plante perene, policarpice, cu maturitate târzie, au cicluri de viaţă foarte lungi şi o lentă manifestare fenotipică a caracterelor legate de structurile lor genetice. Dacă mai adăugăm şi dimensiunile mari pe care le realizează, precum şi o foarte redusă accesibilitate la flori şi fructe, putem alcătui un tablou complet privind dificultăţile ce apar pe linia întreprinderii unor cercetări de genetică forestieră teoretică şi aplicată. Cu toate acestea, în ultimele decenii, cercetările şi activităţile specifice domeniului ameliorării forestiere s-au perfecţionat şi extins extrem de mult, astfel încât în tot mai multe ţări există şi se derulează programe foarte complexe pe linia ameliorării forestiere. În acest mod sunt atinse tematici vaste ce pornesc de la studiul provenienţelor şi selecţia de populaţii valoroase şi se încheie cu abordarea celor mai noi şi performante tehnici moderne specifice biologiei şi geneticii moleculare. 1.2 Scurt istoric Încă din neolitic au existat preocupări de a se obţine forme mai productive la plantele cultivate şi, în acest sens, oamenii din acele timpuri au utilizat o formă empirică de selecţie şi o depozitare a seminţelor pentru scurte perioade de timp. Referitor la speciile de arbori, aceste preocupări au fost mult mai recente, când spre sfârşitul secolului al XVIII-lea s-au efectuat primele recoltări şi utilizări de seminţe aparţinând celor mai frumoase exemplare de arbori, inclusiv pentru speciile forestiere exotice (Stănescu, 1983). La mijlocul secolului al XVIII-lea, Amiralitatea suedeză recomanda recoltarea de seminţe de pin silvestru de la cei mai drepţi arbori din nordul ţării şi cultivarea lor mai la sud pentru a constitui o sursă de materie primă mai apropiată, în vederea construirii navelor (Lucău, 1998). Au trecut mai bine de două secole de când Duhamel de Monceau, unul dintre fondatorii conceptului de silvicultură, a semnalat existenţa unor diferite rase în cadrul speciilor lemnoase şi, la iniţiativa sa, se înfiinţează în Franţa primele plantaţii comparative de pin silvestru cu seminţe din Rusia, Scoţia sau Europa de sud.

1

Tot în Franţa, între anii 1823-1850, Philippe Andre de Vilmorin a experimentat primele teste comparative de provenienţe la pinul silvestru, având în vedere rectitudinea tulpinii, forma coroanei, dispoziţiei ramurilor pe trunchi, etc. Cu această ocazie, în regiunea împădurită a Parisului se realizează multe altoiri pe pin silvestru cu material biologic provenit din Corsica de Pinus laricio pentru aclimatizarea acestei specii în condiţiile mai nordice specifice capitalei franceze. În a II-a jumătate a secolului XIX-lea, prin intensificarea studiilor asupra diferitelor rase de arbori, în mod deosebit în Germania, s-au putut pune bazele stabilirii unei taxonomii mai aproape de realitate a unor grupuri intraspecifice Începutul secolului XX a coincis cu redescoperirea legilor lui Mendel privind ereditatea şi punerea bazelor teoriei mutaţioniste de către Hugo de Vries. În domeniul forestier, o importanţă deosebită a avut-o Correns van Tschermak, creîndu-se o adevărată efervescenţă şi emulaţie în rândul specialiştilor forestieri care erau destul de dezamăgiţi de recentele eşecuri în ceea ce priveşte rezultatele unor vaste acţiuni de reîmpădurire în Franţa, Belgia sau Germania. Rezultatele mediocre obţinute s-au datorat, în principal, utilizării unui material seminal de origine incertă sau de slabă calitate, ca cel de larice de Alpi, pin silvestru din zona Haguenau (Franţa) în Germania şi, invers, material originar din Darmstadt (Germania) în Franţa. Sensibilizarea specialiştilor forestieri s-a manifestat şi exprimat concret în cadrul primei reuniuni internaţionale asupra originii materialului seminal de pin silvestru (1906) dar, mai ales, în cadrul Congresului internaţional IUFRO (Uniunea internaţională a instituţiilor de cercetare forestieră) de la Bruxelles (1910)(Nanson, 2005). O parte a populaţiilor semincere actuale de pin silvestru şi duglas din Belgia reprezintă consecinţa directă şi benefică a acţiunilor întreprinse în acea perioadă. După primul război mondial, urmează o perioadă de regres în genetica forestieră şi, din păcate, mulţi dintre cei angrenaţi în domeniu nu au dat atenţia cuvenită greşelilor şi eşecurilor anterioare. În consecinţă, prin neglijarea provenienţei seminţelor, a crescut numărul de populaţii semincere mediocre, cu exemplare neperformante ce prezentau ramuri groase şi care erau devastate adesea de boli produse de Rhabdocline pseudotsugae sau Phaeocryptopus gaeumannii (Nanson, 2005). Cu toate acestea, în unele ţări din Europa Centrală şi de Vest au fost create bazele privind crearea unui cadru legislativ şi instituţional pe linia cercetării agricole, în general, precum şi a celei forestiere, în special. Astfel, în Belgia a luat fiinţă, în anul 1929, Staţiunea de Cercetări a Apelor şi Pădurilor, cu sediul la Groenendaal, lângă Bruxelles, cu scopul principal de a reda pieţii seminţe cunoscute ca provenienţă şi de bună calitate. De asemenea, Delevoy a început instalarea experienţelor comparative de provenienţe. În Danemarca, Syrach Larsen a creat, cu adevărat, o disciplina autonomă de genetică şi ameliorare a arborilor forestieri, iar în 1926 a efectuat prima cartare seminologică şi o sistematizare a populaţiilor semincere. De asemenea, el a pus la punct tehnici clonale şi de polenizare artificială la arbori, a realizat primul program complet de ameliorare şi selecţie a arborilor plus, de creare a primelor livezi de seminţe şi teste de descendenţă. În mod independent, în Suedia, Langlet a efectuat în 1936 primele observaţii în legătură cu variabilitatea geografică a pinului silvestru în funcţie de climat, deschizând calea viitoarei genetici ecologice, cu mult înainte de Stebbins (1950). Geneticianul Nilsson-Ehle a descoperit exemplare de plop triploid (Populus tremula var. gigas), iniţiind astfel şirul unor lucrări de referinţă în domeniul poliploidiei. În ciuda acestor realizări cu totul remarcabile, se pare că ele nu au avut un impact major în practica forestieră mondială şi nu puţini silvicultori (unii chiar şi în prezent) au rămas

2

la convingerea că dezvoltarea arborilor şi a pădurii ar depinde numai de mediu (Nanson, 2005). În perioada interbelică, graţie marilor descoperiri în domeniul geneticii, încep să se elaboreze şi să se aplice primele programe sistematice pe linia ameliorării diferitelor specii forestiere. În acest sens se evidenţiază programul propus şi iniţiat de către Fabricius, în Germania, o amplă acţiune de ameliorare bazată pe introducerea practicilor de autofecundare, de selecţie, hibridare şi sistem clonal de înmulţire. Tot în această perioadă, în Statele Unite ale Americii, ia fiinţă un institut de genetică forestieră la Placerville (California), în timp ce în mai multe ţări din Europa (Germania, Danemarca, Suedia, Canada, Italia) apar numeroase şi importante organizaţii, comitete şi asociaţii în domeniul ameliorării genetice a arborilor (Stănescu, 1983). După cel de-al II-lea război mondial, un nume de referinţă ce s-a impus în dezvoltarea ameliorării speciilor forestiere a fost cel al suedezului Lindquist (1948), al cărui concept era ca programele în domeniu să urmeze filiera: populaţii semincere, arbori plus şi livezi de seminţe. Acest concept avea să prezinte un mare ecou până în Statele Unite şi în Japonia. După 1950, în urma apariţiei unor discipline de mare importanţă precum genetica evolutivă şi cea a populaţiilor, bazate pe lucrările de excepţională însemnătate ştiinţifică ale lui Dobzansky, Stebbins şi Mayr, s-a putut descifra rolul fundamental ce-l deţine variabilitatea intra şi interpopulaţională în cadrul ameliorării genetice forestiere. Ca urmare, s-a putut trece la o selecţie sistematică a primelor populaţii semincere în Europa (ex. în Belgia), înfiinţarea primelor livezi de seminţe în sistem clonal (Scandinavia, Germania şi Statele Unite) cu material provenit de la arbori plus aparţinând populaţiilor locale, populaţii care s-au dovedit a fi cele mai productive şi mai bine adaptate. Ulterior, prin dezvoltarea studiilor de provenienţă, s-a dovedit că ecotipurile locale nu sunt întotdeauna cele mai bune. Tot în această perioadă s-au înfiinţat primele parcuri de clone cu genotipuri dintre cele mai valoroase şi s-au creat metode statistice eficiente în vederea stabilirii unor comparaţii precise şi elocvente între diferite populaţii de arbori. Apariţia geneticii cantitative după 1960 (Falconer şi Lerner), coroborată cu dezvoltarea studiilor de variabilitate intraspecifică la arbori, a permis perfecţionarea şi ajustarea criteriilor de selecţie a indivizilor performanţi necesari în activitatea de ameliorare. În acest sens, în mai multe ţări din Europa (mai ales în Belgia şi Franţa) s-a mărit semnificativ aria de culturi comparative de provenienţe, plantaţiile respective fiind ulterior repetate în mai multe regiuni, în condiţii ecologice din cele mai diverse. De asemenea, în Statele Unite, Noua Zeelandă şi Australia au luat amploare aceste culturi, aplicându-se tot mai mult aceste metode ale genetice cantitative. Rezultatele obţinute au stat la baza definitivării şi delimitării celor mai valoroase arborete surse de seminţe şi, în consecinţă, la elaborarea unei legislaţii clare în domeniul provenienţei, transferului şi utilizării materialului biologic provenit din aceste formaţiuni forestiere. După anul 1970 s-au perfecţionat şi a luat amploare utilizarea tehnicilor biochimice, respectiv metode de electroforeză privind determinarea unor indici biochimici ca izoenzimele, terpenele şi taninuri. Acestea au permis caracterizarea genotipurilor şi populaţiilor de arbori şi o estimare rapidă şi precisă a gradului de variabilitate intra şi interpopulaţională. În paralel, în unele ţări precum Franţa, a luat amploare multiplicarea vegetativă în masă prin utilizarea unor metode moderne specifice culturilor in vitro, respectiv micropropagarea. După 1980, descoperirile de mare performanţă în domeniul biologiei moleculare, specifice analizelor de ADN (RFLP, RAPD, AFLP, marcheri QTL microsateliţi) şi ale ingineriei genetice (hibridare somatică şi transfer de gene), au stat la baza apariţiei

3

biotehnologiilor moderne cu mare impact şi în cercetările de ameliorare genetică arborilor. Utilizarea acestor tehnici de mare performanţă şi-au găsit o tot mai largă aplicabilitate şi, în prezent, contribuie din plin la elucidarea unor importante aspecte privind refugiile şi migrările postglaciare, structura genetică a populaţiilor de arbori şi gradul acestora de heterozigoţie. În ţara noastră, primele preocupări sistematice în domeniul ameliorării genetice a arborilor sunt relativ recente şi cercetători silvici ca Zaharia Przemeţki, Anton Rădulescu, Petre Grunau, Marian Petcuţ, Marin Rădulescu, Sergiu Paşcovici au adus primele contribuţii concrete în metodologia de ameliorare forestieră bazată pe selecţie. Pe această linie, la iniţiativa lui Zaharia Przemeţki se promovează studiile de provenienţe şi alegerea ecotipurilor în culturile forestiere, prin aceasta reducându-se semnificativ ciclurile de producţie (Stănescu, 1983). Odată cu înfiinţarea I.C.A.S. Bucureşti, în anul 1948, s-au organizat şi întreprins primele lucrări sistematizate de selecţie, hibridare şi instalare de culturi comparative de provenienţe. Între anii 1950-1960 s-au pus la punct şi aplicat primele experimente privind stimularea fructificaţiei la cvercinee, elaborându-se totodată primele instrucţiuni şi îndrumări de selecţie a arborilor şi arboretelor în vederea stabilirii rezervaţiilor de seminţe de stejar. În deceniul următor, la iniţiativa şi pe baza cercetărilor efectuate de către colectivul coordonat de V. Enescu, s-a derulat o acţiune extrem de importantă, respectiv s-a introdus primul sistem specific de cartare seminologică pe baza căruia s-au identificat şi delimitat cele mai reprezentative arborete surse de seminţe de la noi din ţară. Astfel, între anii 1962 – 1965, s-au identificat peste 5000 de arborete semincere, totalizând o suprafaţă de peste 120 000 ha, din care peste 2/3 specii de răşinoase. Toate aceste formaţiuni forestiere au fost descrise şi clasificate în funcţie de valoarea lor seminologică şi s-au stabilit totodată măsurile specifice de îngrijire şi transformare a celor mai valoroase arborete în rezervaţii de seminţe.

După 1970 s-a intensificat ritmul selecţiilor şi hibridărilor între cei mai valoroşi arbori în cadrul ameliorării unor specii, astfel încât s-a extins destul de mult aria plantajelor de seminţe (peste 200 ha), majoritatea suprafeţei fiind ocupată cu specii de răşinoase (larice, pin, duglas etc.). Înfiinţarea primelor colecţii de clone a dat un impuls şi activităţii de conservare a resurselor genetice forestiere concretizate prin genotipuri de mare valoare la unele dintre cele mai importante specii de arbori. În paralel, s-au intensificat cercetările şi observaţiile în domeniul sistematicii şi variabilităţii la mai multe specii forestiere importante (pin, larice, stejar, molid) sau de stabilire a cariotipului la molid, pin etc.

În cadrul activităţii de ameliorare a unor specii forestiere se pot aminti câteva realizări deosebite în ceea ce priveşte utilizarea unor clone de plop de mare productivitate, începând cu anul 1976, precum şi obţinerea unor clone selecţionate de salcie şi răchită, ambele categorii manifestând creşteri semnificative pe unitate de timp şi suprafaţă.

II. OBIECTIVELE AMELIORĂRII ARBORILOR

În esenţă, prin ameliorarea forestieră se urmăreşte obţinerea unor exemplare de arbori mult mai performante ca productivitate şi calităţi tehnologice, mai bine adaptate la mediu în sensul creşterii rezistenţei la acţiunile nocive ale factorilor biotici (boli, dăunători) sau abiotici (inclusiv accidente climatice), în scopul satisfacerii unor cerinţe economice mereu crescânde. În ultima perioadă sunt avute în vedere şi cerinţe ecologice – reconstrucţia ecologică a zonelor distruse sau calamitate, împădurirea unor zone aride, soluri sărăturoase sau ameninţate cu deşertificarea.

4

Paleta obiectivelor cantitative şi calitative urmărite în activitatea de ameliorare a arborilor este extrem de diversă, ţinând cont de complexitatea acestor organisme vegetale (în special complexitatea structurii genetice), de ciclurile lor de viaţă lungi şi foarte lungi, maturitate târzie şi fructificaţia extrem de abundentă. De aici se pot defini câteva trăsături genetice specifice care deosebesc fundamental arborii de restul speciilor vegetale.

2.1. Trăsături genetice specifice arborilor

1. Arborii sunt posesorii unei uriaşe rezerve de variabilitate genetică, în sensul că în structura lor genotipică predomină, într-o proporţie covârşitoare, heterozigoţia pentru multe caractere. Această trăsătură a fost pusă în evidenţă prin efectuarea mai multor teste şi investigaţii şi prin utilizarea unor tehnici de vârf ca marcheri genetici, biochimici, inclusiv “amprentele genetice”. Marea diversitate genetică inter şi intrapopulaţională a arborilor se datorează faptului că aceste specii au evoluat, de-a lungul timpului, în cele mai diverse nişe ecologice şi, pe de altă parte, panmixia atinge în arboretele naturale cotele cele mai ridicate datorită alogamiei şi capacităţii enorme de înflorire şi fructificare. 2. O trăsătură extrem de importantă şi cu largi implicaţii în procesul de ameliorare forestieră o reprezintă marea frecvenţă a sistemelor poligenice şi polialelice, arborii caracterizându-se printr-un număr mare de caractere de ordin cantitativ (bioacumulări) rezultate din multiple şi complexe interacţiuni genice alelice şi nealelice. Această caracteristică prezintă o mare importanţă speciilor forestiere şi în plan ecologic, conferindu-le o mai mare plasticitate şi capacitate sporită de adaptabilitate. 3. Spre deosebire de alte specii de plante (cele cultivate sau chiar din flora ierboasă spontană), arborii au un echipament genetic mult mai stabil, format dintr-un număr mai mare de cromozomi şi, în general, de mai mici dimensiuni, aceasta reprezentând o consecinţă a vechimii acestor specii (mai ales gimnospermele) şi evoluţiei lor îndelungate în nişe ecologice foarte variate. 4. În ciuda structurii lor genetice complexe, a ciclurilor lungi de viaţă şi a maturităţii târzii, arborii manifestă o accentuată susceptibilitate la diferiţi factori de mediu. De aceea, în cadrul diferitelor etape ale procesului de ameliorare forestieră bazate pe selecţie şi hibridare, problema interacţiunii dintre genotipul unui arbore şi mediu să prezinte o foarte mare importanţă pentru amelioratori în sensul utilizării eficiente a unor metode de testare şi ameliorare a diferitelor caractere.

5. Pronunţatul caracter de sociabilitate a arborilor este demonstrat de însăşi modul lor de existenţă, aceştia edificând, în majoritatea cazurilor, populaţii extinse, comunităţi largi, în care selecţia naturală a acţionat sistematic în condiţiile specifice mediului de viaţă. În populaţiile alogame de arbori s-a creat o constelaţie bogată şi specifică de gene, supuse unui flux panmictic intensiv, acest fenomen datorându-se existenţei unor suprafeţe de schimb de gene foarte mari (cantităţi uriaşe de polen, inflorescenţe la partea superioară a coroanei, etc.). De aceea, aceste populaţii naturale constituie adevărate centre de germoplasmă utilă pentru activitatea de ameliorare dar şi cea de conservare a unui fond genetic extrem de valoros prin varietate şi o mare capacitate de recombinare.

6. Tot la arbori, mai ales în interiorul populaţiilor mari, homeostazia genetică se manifestă cu deosebită intensitate, fapt explicabil prin prezenţa masivă a heterozigoţilor care menţin heterogenitatea populaţiilor respective. Acest fapt face posibilă menţinerea echilibrului şi fluxului constant de gene chiar şi în interiorul unor colectivităţi de arbori relativ restrânse şi izolate (ex. cele de fag din nordul Dobrogei). Mecanismele stabilităţii genetice, ale rezistenţei

5

la schimbările structurale profunde, sunt, în acest caz, cu mult mai puternice decât efectele consangvinizării sau derivei genetice care, în cazul altor specii, s-ar manifesta mult mai pregnant.

Izolarea reproductivă poate cauza totuşi întreruperi din arealul unei specii şi duce la apariţia unor diferenţieri genetice ca urmare a reducerii fluxului panmictic şi a influenţelor mediogene cu puternice efecte selective. Acest fenomen stă la baza apariţiei unor populaţii locale, ecotipuri sau rase geografice, dar, chiar şi în aceste condiţii, se păstrează constelaţia de bază a genelor, fără modificări bruşte ale structurii genofondului şi, în consecinţă, aceste formaţiuni restrânse rezistă destul de bine la puternice şi bruşte variaţii de mediu.

2.2. Obiective cantitative În cadrul acestei categorii sunt incluse toate caracteristicile legate de creşteri şi

bioacumulări, respectiv producţia de masă lemnoasă, capacitate de fructificare şi producere de seminţe. Aceste trăsături sunt supuse controlului unui număr mare de gene (gene minore), precum şi interacţiunilor între genele alele şi nealele. În acest caz, influenţa factorilor de mediu este mare, iar eritabilitatea (în ce măsură se transmite un caracter de la părinţi la urmaşi) este redusă.

Obiectivul prioritar urmărit în ameliorarea caracterelor cantitative la arbori îl reprezintă producţia de masă lemnoasă, respectiv producţia totală în volum pe unitate de suprafaţă şi timp sau maximul creşterii medii anuale exprimată în m3 / ha / an. Productivitatea totală a unei populaţii este aproape în exclusivitate determinată de condiţiile de mediu specifice fiecărei staţiuni pe de-o parte, dar şi de materialul genetic utilizat, pe de altă parte. Tratamentele aplicate, în special cele privind gradul de intensivitate a răriturilor, nu au un efect direct semnificativ asupra producţiei totale. Condiţiile de mediu reprezintă un factor fix şi, de cele mai multe ori, defavorabil ameliorării în populaţiile naturale. În cadrul plantaţiilor, dimpotrivă, silvicultorii pot alege mult mai uşor şi cu costuri mult reduse cel mai potrivit material biologic pentru viitoarele generaţii şi pot prognoza mult mai uşor evoluţia regenerării naturale a materialului plantat.

În ceea ce priveşte producţia de biomasă, speciile forestiere se caracterizează printr-o eritabilitate relativ redusă a caracterelor de creştere care sunt controlate de un număr foarte mare de gene, fiind implicate, de asemenea, multiple şi complexe interacţiuni alelice şi nealelice. De aceea, pe linia ameliorării producţiei totale de biomasă, selecţia în favoarea exemplarelor cu cele mai mari creşteri dimensionale (înălţime dominantă) poate să nu conducă întotdeauna la rezultatele scontate şi, în consecinţă, geneticienii amelioratori ar trebui să o aplice cu precădere în perioada de juvenilitate a arborilor selectaţi. În cazul unor specii, cum ar fi de exemplu la molid, în cadrul culturilor comparative, diferenţele dintre provenienţele cele mai bune fenotipice şi cele mai slabe au înregistrat valori spectaculoase în ceea ce priveşte producţia totală de biomasă, acestea atingând pragul de aproape 300%. Totuşi, cea mai recomandabilă măsură ar fi promovarea unor genotipuri polivalente, cu caracteristici calitative remarcabile, cu largă adaptabilitate ecologică, rezistente la maladii şi la condiţii climatice neprielnice (Stănescu, 1984).

Este cunoscut faptul că producţia totală de materie uscată este mai mare decât producţia economică şi nu toată cantitatea de lemn ce se poate recolta se poate utiliza economic. De aceea, în relaţia dintre producţia biologică (Ybiol) şi cea economică (Yec) este introdus indicele de recoltă net (IRnet) care exprimă procentul de lemn, în greutate şi volum,

6

recoltat din pădure şi utilizat. Deci, în anumite condiţii de mediu, dinamica relaţiilor dintre cele două producţii este:

Yec = Ybiol x IR Un factor favorizant privind reuşita ameliorării producţiei de biomasă ar fi existenţa unor variaţii genetice la cel puţin unul din factorii de care aceasta depinde. Pe de altă parte, indicele de recoltă net variază cu specia, provenienţa şi chiar la biotipuri diferite din cadrul aceleaşi populaţii. Nu în ultimul rând, producţia biologică mai depinde de o serie de caractere fixate ereditar dar şi de influenţa, uneori însemnată, a mediului în realizarea lor.

Cele mai importante componente biologice ale producţiei economice sunt înălţimea valorificabilă, suprafaţa de bază fără coajă, factorul de formă, factorul calităţii tulpinii, factorul calităţii lemnului şi densitatea arboretului.

2.3. Obiective calitative Modificarea zestrei ereditare a arborilor ar crea largi posibilităţi şi în ceea ce priveşte ameliorarea a numeroase şi extrem de importante caractere calitative, caractere supuse controlului unui număr restrâns de gene (uneori fiind implicată chiar o singură genă), mult mai puţin sau chiar deloc influenţate de condiţiile de mediu. În general, se pot delimita două mari categorii de trăsături calitative, respectiv caractere extrinseci (exterioare) cum ar fi forma trunchiului, a fusului sau forma ramurilor şi caractere intrinseci (interioare) ca cele legate de calitatea lemnului (fig.1). 2.3.1. Obiective calitative extrinseci A. Rectitudinea tulpinii O bună rectitudine (dacă ar posibil până la mugurele terminal) creşte proporţia de lemn utilizabil prin raportul la volumul de lemn brut total, pe când defectele de formă la nivelul tulpinii reduc în bună măsură calitatea lemnului. Cilindricitatea şi rectitudinea tulpinii reprezintă principalii factori ai indicelui de zvelteţe care se exprimă prin raportul dintre diametrul şi lungimea fusului. Tot legat de calitatea tulpinii, se preferă formele fără înfurciri şi dacă totuşi acestea apar în mod repetat, se pare că ar fi un indiciu al predispoziţiei individuale. De asemenea, este dorită absenţa unor defecte vizibile ca fibre torse, caneluri, gelivuri, etc.

B. Calitatea ramurilor În procesul de ameliorare forestieră se urmăreşte obţinerea de exemplare de arbori cu ramuri cât mai subţiri (noduri mai puţin profunde) şi cu inserţia cât mai apropiată de unghi drept şi fără înfăşurare pe tulpină.

Lungimea ramurilor se corelează cu lungimea coroanei şi a tulpinii. Arborii cu ramuri mai scurte şi cu o coroană îngustă rezistă mult mai bine la rupturile provocate de căderi masive de zăpadă moale. De asemenea, în urma elagajului, rănile sunt mai mici şi superficiale iar procesul de cicatrizare este mult mai rapid.

7

Figura 1. Arbori plus într-o populaţie seminceră de molid (după Nanson, 2005)

2.3.2. Obiective calitative intrinseci A. Însuşirile lemnului Preocupările privind calitatea lemnului au trezit un tot mai accentuat interes al specialiştilor amelioratori şi prin aceea că îmbunătăţirea însuşirile tehnologice a căpătat o semnificaţie practică tot mai profundă. Densitatea lemnului este corelată cu randamentul în pastă, calitatea pastei şi a hârtiei, cu lungimea şi diametrul fibrelor, cu grosimea pereţilor celulari şi procentul de celuloză. Un grad redus de albire sau un conţinut mare de compuşi chimici în lemn poate reduce randamentul de producere a hârtiei, precum şi calitatea acesteia. La unele specii importante economic (pin), variabilitatea intraspecifică crescută a însuşirilor lemnului, în raport cu originea geografică a provenienţelor, prezintă o importanţă deosebită pentru ameliorare. B. Rezistenţă şi adaptare Este vorba, în principal, despre rezistenţa şi adaptabilitatea la unele categorii de agenţi:

a) climatici: - ger timpuriu autumnal, profund hibernal şi târziu de primăvară

- zăpadă moale - vânt - uscăciune; b) biologici: - boli (micoze, bacterioze, viroze) - atacuri de insecte;

8

c) antropici: - poluare atmosferică (CO2, SO2, NOX, O3, F, HF) - animale domestice, vânat. Creşterea rezistenţei biologice a speciilor forestiere la dăunătorii biotici şi abiotici reprezintă un obiectiv cu mare valoare practică, iar eritabilitatea caracterelor legate de rezistenţă este foarte mare. După Zobel (1995), majoritatea caracterelor intrinseci ale lemnului depind în mare măsură de trăsăturile extrinseci. În consecinţă, canalizarea eforturilor în direcţia ameliorării celor din urmă prezintă urmări favorabile şi importante şi asupra caracterelor intrinseci.

III. AMELIORAREA ARBORILOR PRIN METODE CLASICE

În cadrul populaţiilor naturale, cât şi în unele populaţii artificiale sau plantaţii, ameliorarea diferitelor specii de arbori se poate face fără a se modifica rapid (“forţat”) structura genotipică a indivizilor, ci treptat, prin selecţie sau hibridare a genotipurilor existente. Aceste metode se încadrează în categoria metodelor clasice (convenţionale) de ameliorare genetică a arborilor şi se aplică în strategii privind obţinerea unor forme cu productivitate superioară (ex. selecţia) sau a unor exemplare mai rezistente la atacuri masive de boli sau insecte (ex. hibridarea). În cazul existenţei unei variabilităţi accentuate în cadrul unei populaţii de arbori, selecţia poate avea efecte spectaculoase pentru caracterele cantitative specifice bioacumulărilor. În cazul obţinerii unor rezultate rapide în activitatea de ameliorare a arborilor, rezultate ce depind de aplicarea unor tehnici energice dar şi de mare fineţe asupra structurii intime a materialului genetic, sunt utilizate metodele moderne (neconvenţionale), pornind cu mutageneza şi terminând cu tehnicile de mare precizie şi randament specifice ingineriei genetice (fuziunea de protoplaşti, seminţe artificiale, culturi in vitro, tehnici de electroforeză - cromatografie şi până la marcheri genetici moleculari ca PCR, RFLP şi amprente genetice-secvenţe de ADN).

Alegerea şi aplicarea diferitelor metode în procesul de ameliorare a diferitelor specii de arbori depind de obiectele urmărite în cadrul ameliorării, de strategiile adoptate, de specificul eco-biologic al speciei şi, nu în ultimul rând, de posibilităţile concrete avute la dispoziţie (dotare şi personal calificat de specialitate). Deşi aceste metode se pot aplica de sine stătător (mai ales selecţia), programele tot mai complexe de ameliorare forestieră reclamă utilizarea integrată a tehnicilor şi operaţiilor specifice, în funcţie de perspectiva evoluţiei unei anumite populaţii dar şi de cerinţele de moment ce apar în anumite faze ale programului. Astfel, selecţia se poate aplica uşor în diferite subetape pe parcursul derulării unui program de ameliorare forestieră, prin faptul că deţine largi posibilităţi de acţionare. Pe de altă parte, mutageneza, culturile in vitro şi, mai ales, micropropagarea pot scurta semnificativ perioade foarte lungi ale procesului de ameliorare, fapt cu implicaţii practice deosebite, ţinând cont de longevitatea mare şi foarte mare a speciilor de arbori.

3.1 Selecţia

În sens strict genetic, selecţia reprezintă o regrupare într-un număr redus de exemplare de arbori, a unor gene sau combinaţii valoroase de gene cu efect favorabil pentru obiectivul de ameliorare urmărit (Lucău 1998). Din păcate, în cadrul arboretelor naturale sunt foarte mici şanse ca să existe astfel de exemplare de arbori datorită faptului că acţiunea selecţiei naturale

9

se exercită cu intensităţi variabile asupra diferitelor caractere şi, în plus, majoritatea caracterelor (mai ales cele cantitative, legate de bioproductivitate) sunt supuse unui control genetic extrem de complex având un pronunţat determinism poligenic. Genele implicate în manifestarea fenotipică a caracterelor menţionate au o largă răspândire în cadrul unei populaţii datorită unei ample panmixii, iar, pe de altă parte, aceste sisteme poligenice sunt extrem de dificil de identificat astfel încât doar exemplarele purtătoare ale acestor combinaţii să poate fi identificate şi analizate.

Prin dezvoltarea tehnicilor specifice geneticii cantitative şi o interpretare a acţiunii genelor implicate prin extrapolare la caracterele fenotipice, ar fi, în prezent, posibilă o selectare a unor exemplare de arbori posesori de combinaţii deosebit de utile în cadrul ameliorării şi efectuarea, în continuare, de hibridări între indivizii selectaţi în scopul realizării unui cumul de gene favorabile la un număr mai mic de arbori.

Selecţia fenotipică ar consta în alegerea dintr-o populaţie a unor arbori bine dotaţi după simpla observare a manifestării unor caractere exterioare.

Selecţia genotipică constă în selectarea unor exemplare valoroase scopului urmărit în ameliorare numai în urma efectuării unui amplu studiu privind valoarea ereditară a unor caractere, studiu ce ar avea la bază analize şi testări comparative.

Înainte de a prezenta selecţia ca metodă clasică de ameliorare forestieră, vom menţiona câteva dintre cele mai importante principii ce stau la baza iniţierii şi derulării oricărui program de ameliorare a arborilor bazat pe această importantă metodă.

3.1.1. Principii fundamentale ale ameliorării prin selecţie

1. Cele mai sigure garanţii privind eficacitatea unui program de ameliorare forestieră bazat pe selecţie sunt oferite de alegerea şi utilizarea celor mai bune provenienţe. Prin termenul de provenienţă se înţelege locul în care se găseşte o populaţie artificială (furnizor de material reproducător), având ca origine locul unde se găseşte populaţia naturală, sinonimă, în acest caz, cu un ecotip (Nanson, 2005). De exemplu, duglasul ca provenienţă Darrington (statul Whashington ,USA) furnizează seminţe din populaţia autohtonă din această regiune, având rezultate excelente la acţiuni de reîmpădurire aproape peste tot: se poate afirma că Darrington reprezintă o bună provenienţă.

2. În ciuda longevităţii mari a arborilor comparativ cu alte specii vegetale, selecţia şi efectele ei, în limita posibilităţilor, trebuie urmărită pe parcursul mai multor generaţii. Culturile comparative de provenienţe, în acest caz, pot avea un rol extrem de important şi determinant în ceea ce priveşte depistarea mai rapidă a efectelor selecţiei. Pe de altă parte, utilizarea micropropagării la culturile in vitro poate scurta semnificativ, la unele specii de arbori, perioadele lungi de timp ce se scurg între cicluri succesive de selecţie.

3. Numărul de caractere urmărite în cadrul unui ciclu de ameliorare prin selecţie este de preferat să se limiteze la 2, cel mult 3, situaţie în care câştigul genetic este superior atât în cazul caracterelor cantitative, cât mai ales în cazul celor calitative unde eritabilitatea (proporţia în care un caracter este transmis la descendenţă) este maximă.

4. Selecţia artificială nu poate să fie dirijată pe traiectul selecţiei naturale, întrucât cea din urmă cu greu poate fi depăşită privitor la unele caractere şi adaptări formate într-un lung proces grevat pe însăşi evoluţia unei populaţii în cadrul unei anumite staţiuni. De aceea, în cadrul iniţierii şi derulării unui proces de ameliorare forestieră bazat pe selecţie trebuie ţinut cont de specificul fiecărei populaţii locale şi de condiţiile staţionale ce au stat la baza evoluţiei acesteia.

10

5. Întotdeauna, demararea oricărui program de ameliorare forestieră prin selecţie se va face în cadrul unor populaţii mari şi foarte mari de arbori, acest fapt certificând existenţa unei foarte largi baze genetice printr-un grad mare de heterozigoţie. În acest mod este evitată apariţia efectelor nedorite ale consangvinizării, fenomen coroborat cu diminuarea semnificativă a bazei genetice iniţiale.

6. În cele mai multe cazuri, rezultatele cele mai rapide ale acţiunii selecţiei sunt remarcate în cadrul regenerărilor artificiale în comparaţie cu populaţiile naturale de arbori, deoarece, la acestea din urmă, nu este posibilă şi o testare a descendenţelor, aceasta reprezentând o condiţie obligatorie în practica ameliorării forestiere.

7. În general, înainte de iniţierea unui program de ameliorare forestieră se recomandă efectuarea unei inventarieri a populaţiilor existente şi a unor provenienţe remarcabile, precum şi o estimare a gradului de variabilitate intraspecifică generală existent atât pentru speciile autohtone, cât şi pentru cele exotice din cultură (Stănescu, 1983).

3.1.2. Formele selecţiei artificiale Marea diversitate a formelor selecţiei a făcut necesară o diferenţiere a acestei metode

pe mai multe tipuri de criterii. Astfel, în funcţie de valoarea relativă a exemplarelor, care constituie obiectul direct al

activităţii în munca de ameliorare a diferitelor specii de arbori, se disting: - selecţia pozitivă, în situaţia în care sunt selectaţi numai arborii de calitate (de regulă

numai arbori plus cu creşteri excepţionale şi calităţi deosebite), în timp ce restul de arbori sunt îndepărtaţi total sau parţial, în funcţie de priorităţi, acest procedeu fiind caracteristic răriturilor selective;

- selecţia negativă, ce se practică în arboretele surse de seminţe din care se extrag arborii slab dotaţi, defectuoşi şi al căror fond slab de gene nu ar trebui să participe la perpetuarea speciei, conservându-se arborii valoroşi din punct de vedere biologic şi economic. În final, selecţia negativă are efecte pozitive şi este practicată la lucrările de îngrijire de igienizare şi stimulare a regenerării naturale.

După natura caracterelor urmărite în ameliorare, există selecţia fenotipică şi selecţia genotipică, despre care s-au făcut precizările potrivite în subcapitolul anterior.

În funcţie de gradul de intensivitate al lucrărilor, putem avea: - selecţie în masă practicată mai ales în cadrul executării unor lucrări de îngrijire în

cadrul arboretelor surse de seminţe. În acest caz se trece la alegerea unui număr relativ mare de arbori valoroşi de la care se recoltează seminţe amestecate, rezultate în urma unui proces de fecundare liberă, iar evoluţia descendenţei nu este urmărită individual.

- selecţia individuală se execută în cadrul familiilor unde arborii se înmulţesc sexuat (din sămânţă) sau în sistem clonal (multiplicare vegetativă). În cazul aplicării acestui tip de selecţie, exemplarele valoroase de arbori sunt urmărite individual şi în descendenţă, evoluţia fiecărui individ interesând amelioratorii prin prisma unor hibridări şi selecţii viitoare.

După efectele avute asupra structurii genetice a populaţiilor se disting trei tipuri de selecţie:

- selecţia stabilizatoare prin a cărei acţiune sunt eliminate formele de la periferia unei populaţii, care sunt mai puţin adaptate, dar şi exemplarele cu valoare scăzută de reproducere şi supravieţuire. În acest mod sunt conservate şi promovate fenotipurile cu capacitate mare de adaptare şi reproducere în cadrul populaţiei, acestea fiind cantonate,de regulă, în partea de mijloc (fig.2.1). Când condiţiile de mediu sunt relativ constante, între acţiunea factorilor specifici măririi variabilităţii genetice (recombinarea, mutaţia, migraţia) şi acţiunea selecţiei

11

naturale se ajunge la un echilibru, în structura genetică a populaţiei fluxul genelor şi a genotipurilor rămânând constant pe o anumită perioadă de timp (homeostazie genetică);

- selecţia disruptivă reprezintă opusul selecţiei stabilizatoare, în sensul că acţiunea acesteia favorizează câteva fenotipuri (în funcţie de specificul acţiunii şi optimul fiecărui fenotip), restul fenotipurilor intermediare fiind defavorizate în mod discriminator (fig. 2.2). În acest mod răspunsul populaţiei pe ansamblu la acest tip de acţiune se va caracteriza, printre altele, prin apariţia unei pronunţate discontinuităţi în ceea ce priveşte variabilitatea. Astfel sunt evidente manifestările unui pronunţat polimorfism genetic, materializat prin apariţia a numeroase forme distincte în cadrul fiecărui optim şi, în final, o tendinţă clară de divergenţă şi izolare, respectiv apariţia unor subpopulaţii adaptate local. Efectele acestui tip de selecţie sunt foarte rar aplicate în practică şi numai în cazul unor caractere supuse unui puternic control genetic. Intervenţiile neraţionale, uneori iresponsabile, în viaţa pădurii pe de o parte, sau efectul catastrofal al unor calamităţi naturale, pe de altă parte, nu pot avea alt efect decât distrugerea sau alterarea unor ecosisteme forestiere întregi şi o reducere dramatică a diversităţii genetice a populaţiilor şi a variabilităţii intraspecifice la arbori.

- selecţia direcţională se caracterizează prin acţiune sa alternativă asupra unor forme aflate la periferia unei populaţii, prin care sunt promovate fie unele forme superioare sub aspectul unor caracteristici fenotipice (aşa numitele plusvariante), caz în care avem o selecţie direcţională progresivă (fig.2.4), cu efecte pozitive şi asupra fenotipurilor comune, sau asupra unor exemplare mai puţin valoroase (minusvariante), respectiv selecţie direcţională regresivă (fig.2.3). Evident, în practica silvică interesează cel mai mult efectele selecţiei progresive prin faptul că se urmăreşte o înmulţire constantă a numărului de arbori de valoare, cu mult peste media populaţiei prin prisma dimensiunilor, volumului total, etc. În anumite situaţii (mult mai rar), este promovată în ameliorarea forestieră şi selecţia regresivă, mai ales când sunt urmărite unele minusvariante utile în anumite condiţii specifice zonei (ca de ex. arbori cu ramuri subţiri şi coroane înguste preferaţi celor cu lemn de calitate) (fig. 2).

În funcţie de natura genotipurilor din populaţie, promovate sau eliminate prin selecţie, se diferenţiază: selecţie în favoarea sau împotriva homozigoţilor dominanţi (a genelor aditive), selecţie în favoarea sau împotriva heterozigoţilor, selecţie în favoarea sau împotriva homozigoţilor recesivi. Având în vedere mărimea coeficienţilor de selecţie care se folosesc, adică intensitatea selecţiei, aceste tipuri de intervenţie pot fi parţiale sau totale (Stănescu, citat de Lucău,1998).

3.1.3. Determinarea efectelor selecţiei

Eficienţa unui program de ameliorare forestieră este concretizată prin gradul de rentabilitate a metodei (în cazul nostru este vorba de selecţie), legat de parametri specifici şi tehnologia utilizată, dar şi de natura speciei care face obiectul activităţii de ameliorare.

12

Figura 2. Forme ale selecţiei după structura genetică a populaţiei (după Lucău 1998)

Este evident faptul că scopul oricărei iniţiative privind derularea unui program de ameliorare bazat pe selecţie îl constituie realizarea unui câştig de producţie ce se estimează prin calcularea câştigului genetic (ΔG), parametru exprimat prin relaţia:

ΔG = ih2σF în care:

i – reprezintă intensitatea selecţiei şi este dată de raportul n/N (n – nr. de arbori selecţionaţi şi N – nr. total de arbori); este factorul ce poate cel mai mult influenţat de către silvicultor;

h2 – reprezintă eritabilitatea unui caracter urmărit în ameliorare şi este un factor fix asupra căruia silvicultorul nu poate interveni în nici un fel; σF – este ecartul tip fenotipic sau rădăcina pătrată a varianţei fenotipice ce poate estima gradul de variabilitate al caracterului respectiv şi acesta poate varia de la o staţiune la alta sau de la un caracter la altul.

Câştigul genetic poate fi calculat în valori absolute, respectiv în unităţi de măsură specifice caracterului considerat sau în valori relative, cu ajutorul raportului dintre termenii ecuaţiei de mai sus şi valoarea genotipică medie (G) (Stănescu, citat de Lucău,1998):

ΔG ih2σF

G G

13

Procentul de arbori promovaţi din efectivul total al unei populaţii ne precizează dimensiunea reală a proporţionalităţii directe dintre câştigul genetic şi intensitatea selecţiei (i). Pe de altă parte, intensitatea selecţiei, oricât de mare ar fi la nivelul unei populaţii de arbori, nu poate genera un câştig genetic substanţial atunci când existentă o slabă eritabilitate (h2) a caracterului urmărit în ameliorare. În sfârşit, câştigul genetic este influenţat şi de ecartul de tip fenotipic (σF), prin aceea că există o mult mai mare posibilitate de a depista prin selecţie genotipuri valoroase prin prisma existenţei unei mari variabilităţi la un anumit caracter urmărit în procesul ameliorării.

Întotdeauna, în cadrul arboretelor surse de seminţe, chiar şi în condiţiile aplicării unui sistem intensiv de selecţie, câştigul genetic va fi extrem de mic, în primul rând datorită existenţei unui coeficient de eritabilitate redus pentru majoritatea caracterelor. În urma efectuării selecţiei în masă a indivizilor rezultaţi prin polenizare liberă, câştigul genetic este detectabil şi creşte pe măsura aplicării unor rărituri ce favorizează arborii cei mai valoroşi. O cu totul altă situaţie se înregistrează în cadrul livezilor semincere de descendenţe materne în care, în urma selecţiei celor mai bune familii şi a celor mai valoroşi indivizi, câştigul genetic creşte semnificativ. Cele mai spectaculoase creşteri ale câştigului genetic se înregistrează în cadrul livezilor semincere de descendenţe biparentale, în care exemplarele plantate rezultă întotdeauna din încrucişarea controlată a 2 genitori cunoscuţi (tab.1).

Tabelul 1

Câştiguri genetice relative obţinute la diferite forme ale selecţiei, după eritabilitate (după Wright, 1963, citat de Lucău, 1998)

Câştigul genetic în:

Unităţi ΔG % din valoarea medie când eritabilitatea este: Forme de selecţie

0,05 0,10 0,20 0,30 0,05 0,1 0,2 0,3 Arborete surse de seminţe, alegerea semincerilor 0,12 0,12 0,12 0,12 0,05 0,1 0,2 0,4

Plantaje de clone fără teste de descendenţe 1,25 1,25 1,25 1,25 0,5 1,0 2,0 3,0

Plantaje de clone cu teste de descendenţe 2,70 2,06 1,52 1,26 1,1 1,7 2,4 3,0

Plantaje de descendenţe materne; rărituri în favoarea celor mai bune familii

2,03 1,63 1,30 1,14 0,8 1,3 2,1 2,7

Plantaje de descendenţe materne; rărituri în favoarea celor mai buni arbori din cele mai bune familii

2,83 1,83 1,55 1,42 1,1 1,5 2,5 3,4

Plantaje de descendenţe biparentale; rărituri în favoarea celor mai buni arbori din cele mai bune familii

4,91 3,08 2,11 1,88 2,0 2,5 3,3 4,5

14

3.1.4. Ameliorarea prin selecţie – etape generale 3.1.4.1. Ciclul de selecţie şi ciclul de ameliorare

A. Obţinerea de informaţii şi calculul parametrilor genetici pentru stabilirea căilor optime de selecţie

O ameliorare genetică, cu adevărat eficientă, se poate îndeplini numai atunci când toate caracterele urmărite sunt controlate genetic şi prezintă în cadrul populaţiei stabilite un suficient grad de variabilitate. Pe de altă parte, este foarte important de cunoscut gradul de legătură existent între caractere, cunoscut fiind faptul că selecţia pentru o anumită trăsătură poate antrena şi modificarea altei trăsături datorită existenţei fenomenelor de pleiotropie şi linkage.

Controlul genetic şi manifestările fenotipice ale diferitelor caractere ale organismelor depind foarte mult de factorul genetic, de factorul mediu, cât şi de interacţiunea acestora:

F = G + M + GM

în care, F – valoarea fenotipică, G – structura genotipică şi M – influenţa mediului. Factorul genetic rămâne, pentru majoritatea caracterelor, factorul determinant şi, în funcţie de modul său de acţiune, se manifestă sub două forme de bază:

- gene cu efect aditiv (A), ce se transmit prin reproducere pe bază de hazard, sunt independente faţă de alte gene şi au efect propriu asupra manifestării anumitor caractere;

- gene complexe care, de regulă, interacţionează alelic şi nealelic (I) cu multe alte gene, cu efect de dominanţă (D) în cadrul caracterelor specifice bioacumulărilor (cantitative), acestea reprezentând efectul neaditiv (fig. 3).

Figura 3. Efectele interacţiunii dintre alela A2 şi alte alele, fie din acelaşi locus fie din loci diferiţi (după Kremer, citat de Lucău, 1998)

15

Prin urmare, efectele de ansamblu al tuturor genelor implicate (G) asupra unui caracter (ex. volumul unui arboret) s-ar rezuma prin relaţia:

G = A + D + I

Este deja cunoscut faptul că efectele aditive (D şi I ) deţin ponderea cea mai însemnată

în ceea ce priveşte exprimarea fenotipică a celor mai importante caractere urmărite într-un program de ameliorarea genetice, numai că aceste efecte nu pot fi calculate individual, ci numai estimate global.

Referitor la existenţa unui anume grad de variabilitate fenotipică pentru diferite caractere, se poate afirma că în populaţiile forestiere există un grad foarte mare de variabilitate, ceea ce, comparativ cu plantele cultivate (caracterizate de existenţa unei înguste variabilităţi genetice) reprezintă un avantaj enorm privind eficienţa unor metode de selecţie practicate într-un program de ameliorare. Astfel, prin aplicarea selecţiei pe termen scurt a unor exemplare de mare valoare şi multiplicarea în masă a acestora, pe cale sexuată sau în sistem clonal, prezintă o deosebită utilitate în practica silvică. Estimarea gradului de variabilitate în cadrul unei populaţii forestiere este astăzi din ce în mai precisă, graţie metodelor tot mai precise şi performante, cu precădere cele bazate pe marcheri biochimici şi moleculari.

Datorită existenţei numeroaselor legături de ordin genetic între diferite caractere urmărite în ameliorare, selecţia poate avea efecte diferite, în funcţie de natură legăturilor existente. În funcţie de aceasta, pot exista trei situaţii:

- selecţie fără eficienţă, atunci când există legături defavorabile între anumite caractere urmărite a fi ameliorate;

- selecţie relativ eficientă, atunci când sunt legături puţin defavorabile între caracterele urmărite;

- selecţie simultană foarte eficientă, dacă între caracterele vizate nu există legături sau acestea sunt favorabile.

Din păcate, legăturile ce aparţin primei categorii sunt cele mai multe într-o populaţie de arbori şi, de aceea, stabilirea unei metodologii adecvate de selecţie implică mari riscuri şi creează multiple probleme amelioratorilor. Evitarea sau reducerea la minimum a apariţiei acestor riscuri implică apelarea la metode specifice geneticii cantitative, respectiv evaluarea unor parametrii statistici ca eritabilitatea unui anumit caracter, ecartul tip fenotipic sau coeficientul de corelaţie genetică pentru legăturile dintre anumite caractere. Populaţia de arbori destinată culegerii şi interpretării acestor date şi în care se realizează încrucişări libere sau controlate între indivizi reprezintă populaţia de informare (I).

Cunoaşterea acestor parametri ar crea posibilitatea efectuării unei evaluări a eficacităţii selecţiei, eficacitate exprimată concret prin calcularea câştigului genetic dar şi estimarea valorii genotipice a unui arbore, plecând de la valorile sale fenotipice.

B. Stabilirea celor mai valoroase genotipuri Selecţionarea celor mai valoroşi arbori, pe baza trăsăturilor lor fenotipice, se face pe

parcursul lucrărilor de îngrijire în pădure. Totuşi, pentru îndeplinirea unui program riguros de ameliorare, este necesară evaluarea exemplarelor selecţionate şi din punct de vedere al valorii lor genotipice, inclusiv a valorii aditive. Acele populaţii care sunt formate din grupuri de arbori, potenţiali candidaţi la selecţie, şi din care sunt adunate informaţii şi date privind valorile fenotipice specifice selecţiei, constituie populaţiile de evaluare (E).

16

În funcţie de datele culese, valorile estimate şi, ţinând cont şi de legăturile dintre caractere, se poate definitiva acţiunea de selectare a celor mai valoroase genotipuri. Ansamblul de exemplare rezultat în urma selecţiei constituie populaţia de ameliorare.

C. Încrucişările dintre genotipurile selecţionate În acest stadiu al populaţiei de ameliorare, selecţia se poate opri, iar exemplarele cele

mai valoroase pot fi multiplicate intensiv (mai ales în sistem clonal), aceasta constituind sursa de bază în programe de reîmpăduriri. Pe de altă parte, populaţia de ameliorare constituită poate reprezenta un punct de plecare pentru o nouă ameliorare, această populaţie devenind practic o nouă populaţie sălbatică. În urma încrucişărilor care se efectuează între indivizii populaţiei de ameliorare au loc noi recombinări de gene, rezultă noi genotipuri, posesori a noi constelaţii de gene, ce pot servi la realizarea altor obiective urmărite în ameliorare. În acest stadiu, cea mai importantă operaţiune este cea de realizare a încrucişărilor controlate. Sistemul vegetativ ar fi acum cu totul contraindicat pentru realizarea unui spor al câştigului genetic, deoarece nu este valorificat potenţialul ereditar al noilor forme selectate.

Cele trei operaţii prezentate (A,B,C) stau la baza formării unui ciclu de selecţie, fiecare etapă având ca suport specific următoarele formaţiuni (fig. 4):

- dispozitive experimentale cu diferite populaţii de arbori; - teste de descendenţe (pentru populaţii de informare şi evaluare); - parcuri de clone (pentru populaţii de ameliorare) (Lucău, 1998).

Figura 4. Ciclul de selecţie (I - populaţie de infirmare, E – populaţie de evaluare)

3.1.4.2. Repetarea ciclurilor de selecţie În funcţie de obiectivele urmărite în cadrul unui program de ameliorare forestieră, dar

şi de dispozitivul experimental utilizat, vor evolua şi tehnicile de selecţie, urmarea firească fiind separarea populaţiei iniţiale în mai multe subpopulaţii. Acest fapt se datorează urmăririi în ameliorare a mai multor obiective, cantonate, în primă fază, într-un singur dispozitiv experimental. De aceea, principiul de bază în cadrul programelor moderne de ameliorare se referă la repetarea ciclurilor de selecţie prin care câştigurile genetice se acumulează pe parcursul derulării întregului program de ameliorare. De remarcat faptul că pentru fiecare nou ciclu de selecţie, populaţia de plecare este de fapt populaţia de ameliorare a ciclului precedent. Acest tip de selecţie se numeşte selecţie recurentă intrapopulaţională şi constituie metoda

17

curentă de ameliorare prin selecţie a principalelor specii forestiere dar care fixează numai efectele aditive (proprii genelor ce controlează anumite caractere) (fig. 5)

O alternativă mai completă a acestui tip de selecţie este reprezentată de selecţia recurentă reciprocă, în urma căreia populaţia de ameliorare iniţială este subdivizată în 2 subpopulaţii, A şi B, ameliorate independent prin selecţie recurentă normală. Acest subtip de selecţie permite valorificarea completă şi a efectelor neaditive, acestea din urmă constituind baza realizării unor câştiguri genetice reale în ameliorarea forestieră. Acest proces este asigurat prin încrucişarea controlată, la un moment dat, a celor mai bune exemplare din cadrul celor două subpopulaţii, iar rezultantele ar putea fi purtătoare a celor mai interesante combinaţii de gene ce controlează caractere urmărite în ameliorare. Un exemplu concludent în acest sens îl constituie pinul maritim, specie la care s-a observat că aplicarea selecţiei recurente la 2 subpopulaţii separate (cea olandeză viguroasă dar cu formă defectuoasă şi cea corsicană mai slab viguroasă dar cu formă bună) a dus la obţinerea unor provenienţe constituite din arbori cu cele mai bune rezultate la încrucişările dirijate (Kremer citat de Lucău 1998).

Figura 5. Repetarea ciclurilor de selecţie – selecţia recurentă intrapopulaţională (după

Lucău, 1998)

3.1.5. Limitele selecţiei Există două categorii principale de limite ce pot apărea pe măsura repetării ciclurilor

de selecţie, respectiv limite genetice şi limite metodologice, fiecare categorie având un anume grad de impact asupra variabilităţii populaţiei de ameliorare sau asupra gradului de dificultate al metodologiei utilizate în cadrul programelor de ameliorare forestieră.

18

3.1.5.1. Limite genetice şi biologice

Limitele genetice se fac simţite atunci când se face o repetare a ciclurilor de selecţie timp de mai multe generaţii şi, în consecinţă, apare pericolul scăderii, uneori drastice, a bazei genetice, în sensul reducerii gradului de heterozigoţie şi creştere a celui de consangvinizare la nivelul populaţiilor de ameliorare şi de producţie. Creşterea gradului de înrudire între exemplarele supuse încrucişărilor controlate, în acest caz, devine tot mai evidentă, pe măsura reducerii numărului de indivizi. Instalarea unui început de depresiune consangvină este de nedorit şi, pentru acest fapt, se pot lua unele măsuri de contracarare, ca de exemplu:

- alegerea unei populaţii de plecare cu un efectiv numeros şi un grad mare de heterozigoţie;

- urmărirea precisă a pedigreului în cursul generaţiilor – măsură destul de dificil de realizat dar absolut necesară, mai ales în cazul populaţiilor reduse numeric.

Din păcate, încă nu este posibilă o calculare precisă a taliei unei populaţii de plecare, întrucât acest lucru depinde de o multitudine de factori, dintre care cei mai importanţi sunt legaţi de numărul şi natura criteriilor de selecţie, de numărul şi frecvenţa genelor implicate în ameliorare şi de timpul necesar derulării programului de selecţie.

Limitele biologice se fac simţite doar în corelaţie cu o serie de caracteristici biologice specifice arborilor ca perenitatea sau lungimea generaţiilor şi, cel mai adesea, îngreunează efectuarea unei evaluări şi caracterizări mai rapide a genotipurilor existente. În al doilea rând, acest tip de limite afectează rotaţia generaţiilor, în sensul prelungirii perioadelor de succesiune.

3.1.5.2. Limite metodologice De cele mai multe ori, în stabilirea unei strategii de ameliorare forestieră este luată în

calcul însemnătatea economică a unei anumite specii de arbore urmărită în programul de ameliorare, precum şi evoluţia utilizării varietăţilor obţinute în acest program.

Datorită faptului că pe timpul derulării activităţii de ameliorare pe bază de selecţie pot apărea, în diferite etape ale programului, noi obiective conexe şi contingenţe exterioare, se recomandă ca la iniţierea oricărui program să se pornească cu o paletă cât mai largă privind metodele de lucru, fapt ce poate asigura atât o anumită supleţe a programului pe ansamblu, cât şi continuitatea acestuia.

Aceste deziderate pot fi atinse în cadrul unui program complex de ameliorare forestieră dacă se porneşte cu un efectiv numeros de exemplare în populaţia iniţială, coroborat cu o intensitate moderată a selecţiei, precum şi o divizare a acestei populaţii în mai multe subpopulaţii în care să se realizeze independent selecţia recurentă. Acest din urmă aspect ar permite o acţiune de regionalizare a programului de ameliorare, în funcţie de anumite zone ecologice specifice, cu efect benefic asupra unor genotipuri ce prezintă o instabilitate intrinsecă accentuată.

3.1.6. Strategii de selecţie A. Strategii pe termen lung Acest tip de strategii este potrivit pentru unele specii forestiere importante, cu cicluri

lungi şi foarte lungi de viaţă, utilizate pe scară largă în activităţi de împădurire şi reîmpădurire (stejari, molid sau fag). În cadrul adoptării acestor strategii, se practică selecţia de tip recurent în cadrul unor populaţii de ameliorare cu un efectiv de pornire de cel puţin câteva sute de indivizi, cu pondere majoritară deţinută de arborii “plus”. Derularea acestor strategii de ameliorare la speciile menţionate se face pentru mai multe generaţii succesive, cu înfiinţare de

19

livezi de seminţe şi realizarea unor varietăţi policlonale deosebit de valoroase, situaţie ce permite şi o acumulare însemnată a câştigului genetic.

B. Strategii pe termen mediu Aceste strategii sunt potrivite pentru specii de arbori cu cicluri de viaţă mai scurte dar

care sunt utilizate,de asemenea, în activităţi de împădurire şi reîmpădurire. Aici, cele mai potrivite specii de arbori sunt cele care au un efectiv ceva mai redus în populaţiile de plecare (pin, cireş sau larice), selecţia, în acest caz, urmărind caracterizarea exemplarelor sub aspectul capacităţii lor de încrucişare dar şi prin eficacitatea în sistem clonal, mai ales în ciclul iniţial de selecţie. Diferitele varietăţi obţinute (hibride, sintetice sau policlonale) asigură, de asemenea, acumularea câştigului genetic de la prima generaţie (Lucău, 1998).

C. Strategii pe termen scurt În condiţiile unui climat cu influenţe marine sau oceanice, aceste strategii se aplică la

unele specii utilizate în acţiunea de împădurire şi reîmpădurire (ex. cedrul) şi, în care, selecţia conduce la identificarea celor mai valoroase populaţii din cadrul unor teste comparative de provenienţe, în vederea decelării acumulării câştigului genetic.

În funcţie de specie sau de cerinţele economice de moment, apărute în cadrul derulării unui anumit program de ameliorare forestieră, este posibil ca o strategie de durată medie sau chiar scurtă de timp să evolueze întruna de lungă perioadă. În acest caz, este posibil ca o populaţie de ameliorare de la o strategie de termen scurt să se transforme întruna de plecare la o strategie de termen lung.

3.1.7 Etapele principale ale unui program de selecţie Orice program de ameliorare forestieră bazat pe selecţie va include obligatoriu

parcurgerea unor etape importante, după cum urmează: - alegerea provenienţelor; - identificarea de populaţii semincere; - crearea populaţiilor de producţie.

3.1.7.1. Alegerea provenienţelor În cadrul selecţiei, alegerea provenienţelor este prima şi poate cea mai importantă

etapă, întrucât o ameliorare bazată exclusiv pe provenienţele locale ar avea un inconvenient major şi anume, cel al desfăşurării ameliorării într-un ritm mult prea lent, cu creşteri mari ale costurilor. Pe de altă parte, nu întotdeauna provenienţele locale sunt cele mai productive şi cel mai bine adaptate. În aceste condiţii, este extrem de utilă existenţa unei solide baze de date (bănci de date) privind inventarierea completă a celor mai valoroase provenienţe de la o specie sau alta de arbori.

Operaţiuni specifice A. Crearea de plantaţii comparative de provenienţe În cadrul acestei operaţiuni apar 3 probleme importante ce trebuie rezolvate: a) Eşantionajul provenienţelor reprezintă operaţiunea cea mai dificilă deoarece este

extrem de dificil de a se stabili cu exactitate zonele de delimitare (unde începe şi unde se termină arealul unei provenienţe), cu atât mai mult cu cât, la cele mai importante specii de arbori din punct de vedere economic, arealul natural este foarte întins. În cadrul acestor areale continue, variaţiile majorităţii caracterelor sunt gradate (variaţii clinale) şi, din acest punct de vedere, este foarte dificil de a se fixa exact limitele fiecărei provenienţe. În aceste condiţii,

20

numărul de provenienţe fiind foarte mare, este necesară realizarea unui eşantionaj al acestora, în final, alegându-se câte o provenienţă din fiecare regiune.

b) Stabilirea siturilor experimentale se face cu precădere în regiunile reproducătoare cele mai importante dar şi în acele zone în care există posibilităţi de apariţie a unor interacţiuni pedoclimatice puternice. De exemplu, fagul, în această privinţă, este extrem de sensibil la modificări de la nivelul substratului şi manifestă puternice interacţiuni, după natura calcaroasă sau silicioasă a substratului, fapt dovedit de existenţa unor ecotipuri specifice substratului calcaros.

c) Alegerea provenienţelor se face după câteva criterii, dintre care cel mai important este cel al adaptării. Capacitatea de adaptare se apreciază în funcţie de rata de supravieţuire, de rezistenţa la atacuri de boli şi dăunători sau la factori abiotici nefavorabili (căderi masive de zăpadă, vânt, ger, arşiţă, etc.).

Pe lângă estimarea capacităţii de adaptare, în alegerea provenienţelor se mai ţine cont de vigoarea de creştere, dar şi de calitatea lemnului. De asemenea, se va avea în vedere plasticitatea, în acest sens preferându-se provenienţele mai puţin interactive şi care sunt mai uşor adaptabile la situri experimentale diverse.

B. Alegerea provenienţelor în lipsa culturilor comparative În cazul unor specii autohtone sau exotice ale căror culturi sunt relativ bine adaptate, se

pot alege provenienţele locale care sunt deja bine adaptate şi corespund întrutotul principalului criteriu de selectare a provenienţelor. În acest caz nu se mai pune problema apariţiei unor eşecuri în ceea ce priveşte eficienţa acţiunii de ameliorare prin selecţie şi, în subsidiar, în cadrul arealului natural al speciei se realizează conservarea unui fond valoros de germoplasmă.

C. Introducerea de specii exotice Sunt destul de numeroase situaţii când are loc introducerea de specii lemnoase exotice

în diverse culturi forestiere, însă aici se pune problema efectuării unor testări prealabile pentru a se putea determina gradul de compatibilitate a noilor forme la noile locaţii. Efectuarea acestor operaţiuni prezintă adesea riscuri foarte mari şi pierderi pe măsură şi, de aceea, este obligatorie efectuarea acestor testări, chiar şi atunci când condiţiile din regiunea de origine sunt foarte asemănătoare cu cele din regiunea de introducere.

În acest mod au fost introduse în Europa mai multe specii lemnoase aduse din Asia sau America, în scopul reîntregirii fondului european de specii lemnoase serios afectat de ultima glaciaţiune. Astfel s-au introdus mai multe specii de pin, de salcâm, platan negru, nuc negru, etc.

D. Evaluarea provenienţelor Identificarea precisă şi evaluarea eficientă a provenienţelor şi a variabilităţii genetice a

arborilor s-au putut realiza doar în urma punerii la punct a metodelor moderne de utilizare a marcherilor biochimici şi genetici, în acest fel putându-se delimita cu precizie diverse populaţii şi caracteriza provenienţele aparţinând diverselor specii forestiere. Analizele complexe de electroforeză au permis ca, pe baza studiului izoenzimelor, să se identifice şi să se inventarieze numeroase populaţii de arbori, precum şi originea provenienţelor. Stabilirea riguroasă şi precisă a gradului de variabilitate genetică existent în cadrul acestor forme a putut fi realizată în urma perfecţionării tehnicilor de vârf ale tehnologiilor specifice ingineriei genetice. Polimorfismul genetic (al macromoleculei de ADN) s-a putut identifica cu ajutorul metodologiei de analiză a secvenţelor ADN (amprente genetice), analiză ce a permis identificarea unui foarte mare număr de loci genici.

21

3.1.7.2. Identificarea populaţiilor semincere Arboretele surse de seminţe sau populaţiile semincere sunt reprezentate de comunităţi

de arbori pure sau de amestec, majoritatea naturale, care se caracterizează prin calitate şi productivitate (masă lemnoasă şi fructificare) net superioare altor tipuri de arborete, dar şi prin capacitate deosebită de adaptare la condiţiile pedoclimatice ale diferitelor tipuri de staţiuni. Aceste formaţiuni forestiere conţin un număr mare de arbori plus şi constituie sursa principală pentru iniţierea şi dezvoltarea programelor de selecţie forestieră bazate pe selecţie, reprezentând aşa numitele populaţii de plecare.

În urma derulării amplului program de cartare seminologică la principalele specii forestiere din ţara noastră, program iniţiat şi coordonat de către reputatul cercetător silvic Valeriu Enescu în perioada 1965 – 1970 şi reactualizat între anii 1972 – 1973, s-au identificat şi selecţionat peste 4100 de arborete surse de seminţe. Dintre acestea, peste 3000 aparţin mai multor specii de răşinoase (molid, brad, pin, larice), iar restul, de peste 1100, la diferite foioase (fag, cvercinee, plop alb, anin negru, frasin, tei, salcâm, etc.).

În funcţie de origine, provenienţă, compoziţie, clasă de producţie, categorii de calitate, elagaj, starea fitosanitară, vârstă şi suprafaţă ocupată, populaţiile semincere din ţara noastră se împart în două mari categorii:

- arborete surse de seminţe de categoria A (plus) care sunt cele mai valoroase populaţii surse de seminţe şi conţin cel mai mare număr de arbori plus. Aceste formaţiuni forestiere, care constituie şi cele mai valoroase surse de germoplasmă forestieră, au un fond genetic intact şi deosebit de valoros, sunt excluse de la tăieri şi produc mari cantităţi de seminţe elite a căror valoare genetică este din plin confirmată prin culturi comparative de provenienţe şi teste de descendenţe. Aceste populaţii ocupă suprafeţe limitate, totalizând cca. 10.000 ha, din care 7000 ha la răşinoase şi cca. 3000 ha pentru foioase;

- arborete surse de seminţe de categoria B (normale) reprezentate de formaţiuni forestiere ce conţin populaţii de arbori cu seminţe netestate şi ocupă aproximativ 100.000 ha, din care 75.000 ha pentru răşinoase şi cca. 25.000 ha la foioase.

Arboretele din prima categorie se pot transforma în rezervaţii de seminţe, cu condiţia ca aceste populaţii să fie izolate de surse de contaminare cu polen aparţinând unor arbori de calitate inferioară. Izolarea se poate face prin crearea unei benzi de izolare, cu o lăţime cuprinsă între 300 şi maximum 1000 m. Dacă acest lucru, din diverse motive, nu se poate înfăptui, atunci se procedează la extragerea şi îndepărtarea exemplarelor de arbori deficitari ca formă sau care produc cantităţi scăzute de seminţe şi de slabă calitate (selecţie negativă). În interior se mai pot executa şi lucrări de îngrijire sau răriri adecvate şi de refacere.

3.1.7.3. Crearea populaţiilor de producţie (plantaţii semincere, plantaje) Materialul biologic obţinut în urma aplicării programului de selecţie constituie un

material deosebit de valoros din punct de vedere genetic şi se impune multiplicarea masivă a acestuia pentru obţinerea populaţiilor de producţie de seminţe sau de butaşi. Aceste tipuri de formaţiuni forestiere sunt principalii furnizori de material biologic (seminţe, butaşi, altoaie) forestier de calitate necesar reîmpăduririi.

Principalele tipuri de livezi de seminţe din ţara noastră au fost şi sunt înfiinţate în funcţie de sistemul de reproducere utilizat, respectiv reproducere sexuată prin care seminţele determină o mărire considerabilă a frecvenţei genelor cu efect favorabil sau sistem clonal (în special butaşi) ce asigură o păstrare integrală a genotipurilor valoroase selectate. Acest ultim sistem se aplică însă la un număr limitat de specii (unele foioase cu o predilecţie intrinsecă pentru producerea de butaşi sau drajoni) şi la un număr redus de indivizi (fig. 8).

22

În figura de mai jos sunt redate schematic cele mai reprezentative tipuri de livezi de seminţe, în funcţie de sistemul de reproducere care stă la baza creării acestor populaţii forestiere.

1. Livezi de seminţe în sistem vegetativ (plantaje în sistem clonal) a) Livezile de clone (parcuri de clone) sunt plantaje formate din mai puţine exemplare

(se instalează cu densitate mică de 200 până la max. 500 arbori/ha) şi rezultă din butaşi sau grefe recoltate de la indivizi extrem de valoroşi (arbori plus), selecţionaţi în funcţie de valoarea lor fenotipică şi genotipică. Este recomandat ca la înfiinţarea unei astfel de arboret să se pornească cu material clonal provenit de la minimum 30 de surse neînrudite, în scopul menţinerii unui grad cât mai mare de heterozigoţie şi de a se evita, în acest fel, apariţia oricărui semn al presiunii de consangvinizare.

b) Livezi de clone pentru hibridare (livezi de seminţe biclonale) sunt livezi instalate pentru a se obţine hibrizi interspecifici, prin polenizări libere sau controlate, arbori cu o puternică manifestare a fenomenului de heterozis. Exemplarele donatoare de material clonal sunt selecţionate dintre cele care au dovedit, în prealabil, o deosebită capacitate de combinare şi au seminţe performante şi în ceea ce priveşte capacitatea de germinaţie.

Figura 6. Tipuri de livezi de seminţe (după Lucău, 1998)

2. Livezi de seminţe în sistem de reproducere sexuată Tipurile de livezi de seminţe din această categorie au în compoziţia lor un număr mare

şi foarte mare de indivizi, la instalarea acestora pornindu-se cu densităţi cuprinse între 2500 şi 4000 de arbori/ha.

a) Livezi de descendenţe materne (plantaje de semifraţi) sunt acele livezi în care indivizii provin din seminţe recoltate de la arbori plus şi sunt rezultatul unei polenizări libere, cunoscându-se numai genitorul de pe linie maternă. Este recomandată înfiinţarea acestui tip de livezi de seminţe pentru unele specii de arbori la care polenizarea controlată este dificil de realizat (arţari, stejari).

23

b) Livezi de familii cu repetiţii sunt plantaje ce conţin în compoziţia lor indivizi ce provin din polenizări dirijate.

c) Livezi de descendenţe biparentale (plantaje de fraţi buni) sunt plantajele cele mai performante pentru unele specii importante (molid, pin silvestru, larice, brad, mesteacăn, plopi) şi, la care, polenizarea controlată se realizează destul de uşor. Aici, arborii provin din încrucişări controlate între părinţi cunoscuţi atât pe linie maternă, cât şi pe linie paternă.

3.2. Hibridarea

În sens strict genetic, hibridarea reprezintă procesul prin care se realizează contopirea a

două informaţii ereditare diferite în urma unirii gameţilor la fecundare (Băra, 1996). Hibridarea poate fi intraspecifică, atunci când descendenţa apare prin încrucişarea unor indivizi aparţinând la rase, soiuri sau populaţii diferite ale aceleaşi specii sau interspecifică, în situaţia când descendenţa rezultă în urma încrucişării dintre indivizi aparţinând unor specii diferite. În cazuri mult mai rare, descendenţa apare în urma încrucişărilor între indivizi ce aparţin la genuri diferite şi, în acest caz, avem tipul de hibridare intergenerică. La aceste ultime două tipuri de hibridare, descendenţii rezultaţi au diferite probleme legate în special de fertilitate dar, mai ales, de viabilitate scăzută, situaţie întâlnită cel mai frecvent la hibrizii intergenerici. Acest impediment se datorează, în principal, unor cauze de ordin genetic, dintre care cele mai importante sunt:

- complex de gene care provoacă o dezvoltare anormală; - diferenţe între cromozomii proveniţi de la cei doi părinţi îndepărtaţi taxonomic şi

filogenetic; - factori citoplasmatici care compromit dezvoltarea normală şi fertilitatea hibrizilor.

3.2.1. Principii generale privind aplicarea tehnicilor de hibridare Pe baza celor prezentate mai sus şi ţinând cont de complexitatea trăsăturilor genetice

ale arborilor, în practica ameliorării silvice bazată al cărui program include şi lucrări de hibridare se va ţine cont şi se vor respecta, în mod obligatoriu, unele norme şi principii, fapt ce poate asigura succesul acestui program.

1. Evaluarea posibilităţilor de hibridare interspecifică între diferite specii de arbori este foarte necesară întrucât, din totalul hibrizilor interspecifici, doar max. 20% produc seminţe fertile. În cazul majorităţii speciilor de arbori, hibridarea interspecifică este imposibil de realizat deoarece, din cauza distanţei de ordin taxonomic, există mari diferenţe de structură ale aparatelor reproducătoare şi neconcordanţe ale perioadelor de receptivitate maximă în maturarea elementelor sexuale ale inflorescenţelor mascule şi femele. Toate acestea constituie elemente care stau la baza manifestării fenomenului incompatibilităţii la nivelul florilor sau al polenului.

2. Studiul repartiţiei naturale a speciilor de arbori este extrem de util, cu atât mai mult cu cât sunt cazuri destul de numeroase când două specii care ocupă aceiaşi staţiune nu hibridizează între ele. Acelaşi fenomen se constată şi în situaţia când două specii diferite sunt învecinate sau parţial suprapuse, susceptibilitatea la polenizare fiind foarte redusă.

3. Efectuarea unei selecţii foarte riguroase a exemplarelor parentale înaintea oricărei polenizări este foarte necesară, întrucât există pericolul ca la hibridări să participe şi polen nedorit ce ar aparţine unor exemplare cu unele caractere defavorabile.

24

4. Efectuarea testelor de pepinieră şi de teren a hibrizilor rezultaţi este imperios necesară pentru a se efectua un control timpuriu asupra rezultatelor şi de a se urmări comportarea ulterioară a hibrizilor naturali sau artificiali obţinuţi.

5. Selectarea şi multiplicarea intensivă a celor mai valoroşi hibrizi se poate face prin refacerea celor mai performante hibridări şi înmulţirea ulterioară (în sistem clonal intensiv) a descendenţei valoroase rezultate sau o combinare a celor două modalităţi.

3.2.2. Criterii şi modalităţi concrete de hibridare I. După modul în se produc: a) hibridarea naturală – reprezintă calea cea mai răspândită prin care se realizează

polenizarea şi care se produce fără intervenţia dirijată a omului. Acest tip de hibridare este specifică, în primul rând, speciilor alogame şi reprezintă fecundarea încrucişată caracteristică multor specii forestiere importante (răşinoase, fagacee).

b) hibridarea artificială – se face cu intervenţia omului în cadrul lucrărilor de ameliorare forestieră şi se practică prin efectuarea de polenizări controlate (dirijate) la specii autogame şi alogame.

II. După tipul de polenizare a exemplarelor materne a) hibridarea liberă - se efectuează la specii auto dar şi la cele alogame. La primele are

loc, în prealabil, operaţiunea de castrare (îndepărtarea mecanică a inflorescenţelor mascule la exemplarele stabilite drept componente materne). Polenul provenit de la una sau mai multe forme paterne este purtat şi depus cu ajutorul vântului sau a insectelor polenizatoare. În livezile de seminţe create şi amenajate pe spaţii mai mari, acest tip de hibridare s-a dovedit a fi cel mai eficient în obţinerea unor varietăţi sintetice.

b) hibridarea semiliberă – are loc în condiţiile izolării plantei mamă, cu flori castrate şi sub un cort special, cu polen recoltat de le exemplarul patern şi care este împrăştiat liber sub cortul de izolare.

c) hibridarea forţată - se realizează prin polenizarea forţată a inflorescenţelor femele de pe exemplarul matern, operaţiune urmată imediat de acoperirea şi izolarea cu pungi de hârtie sau plastic a inflorescenţelor polenizate.

III. După numărul şi natura genitorilor care iau parte la hibridare a) hibridarea simplă – se produce atunci când are loc polenizarea între doi indivizi

(părinţi homozigoţi). La arbori, situaţia este mult mai complexă, în sensul că, spre deosebire de speciile cultivate, indivizii genitori sunt heterozigoţi pentru majoritatea caracterelor, dar şi în acest caz, descendenţii din prima generaţie manifestă un grad deosebit de heterozis. (AXB)

b) hibridarea dublă – are loc atunci când hibridul provine din fuziunea gameţilor ce aparţin la doi hibrizi simpli, însă fenomenul de heterozis este mai puţin accentuat decât în cazul precedent. (AXB)X(CXD).

c) hibridarea repetată (backcross) – mai este cunoscută şi sub numele de încrucişare repetată şi are loc atunci când se încrucişează un hibrid din F1 cu una din formele parentale. Acest tip de hibridare s-a dovedit extrem de util şi eficient în cazul când se urmăreşte creşterea rezistenţei la atacul unor boli şi chiar dăunători dar şi în de îndepărtare a unei trăsături nedorite de la o formă valoroasă obţinută în cadrul procesului de ameliorare. AXB=AB, ABXA=(AB)A1.

d) hibridarea reciprocă – se produce între două forme parentale care pot fi, pe rând, fie forme paterne, fie forme materne. De menţionat faptul că hibrizii care rezultă nu sunt identici datorită influenţei factorilor ereditari extranucleari (citoplasmatici) de la gameţii femeli. A(F)X B(M)=AB, B(F)X A(M)=BA, AB≠BA.

25

e) hibridarea ciclică – constă în încrucişarea unei forme parentale (considerată ca analizator) cu toate celelalte forme. BXA, CXA, DXA, etc.

f) hibridarea dialelă – este o formă de hibridare utilizată şi în practica silvică, în care mai multe forme parentale, cu constituţie genetică diferită, sunt încrucişate în toate combinaţiile posibile. Acest tip de încrucişare se dovedeşte extrem de utilă în cazul când se urmăreşte ameliorarea caracterelor cantitative, deoarece se scurtează mult timpul necesar alegerii genitorilor. AXB, AXC, AXD, AXE; BXC, BXD, BXE; CXD, CXE; DXE.

g) hibridarea complexă – reprezintă încrucişarea între o formă materne cu amestec de polen aparţinând mai multor genitori paterni. A(F) X (B+C+C+D+E).

3.2.3. Particularităţi ale reproducerii sexuate la arbori 3.2.3.1. Aspecte teoretice şi practice asupra înfloririi şi fructificaţiei la

arbori Ţesutul meristematic nediferenţiat din care se va forma floarea este situat în axila

frunzelor şi dezvoltarea acestuia va depinde, în mare măsură, de influenţa unor factori externi sau interni.

În prima categorie, temperatura şi lumina joacă un rol de primă însemnătate. Primăveri şi veri mai calde sau mai răcoroase, ori o intensitate mai mare sau mai mică a luminii, vor determina creşterea sau, dimpotrivă, scăderea capacităţii de înflorire şi de fructificare la majoritatea speciilor de arbori.

În cadrul celei de-a II – a categorii, aplicarea unor tratamente externe experimentale cu fitoregulatori de creştere (auxine şi gibereline), în diferite concentraţii, la exemplare aparţinând mai multor specii de conifere (Larix, Tsuga, Picea, Pinus), a condus la obţinerea unor rezultate promiţătoare, cu condiţia ca aplicarea acestor tratamente să fie într-o strictă concordanţă cu fazele de dezvoltare ale fiecărui exemplar, cu vârsta, precum şi în funcţie de condiţiile specifice climatice în anii de studiu.

3.2.3.2. Fenomenul de incompatibilitate interspecifică în ameliorarea forestieră Factorii care limitează sau fac imposibilă polenizarea artificială între exemplare

aparţinând unor specii diferite de arbori sunt legaţi în primul rând de diferenţele de ordin morfologic la nivelul florilor. După cum se cunoaşte, la gimnosperme, ovulul este la vedere şi, în faza de receptivitate maximă (destul de scurtă, de doar 2,3 zile), polenul purtat de vânt este colectat şi poate avea loc polenizarea. Dificultăţile intervin la efectuarea polenizării artificiale la 2 specii diferite, la care nu se suprapun perioadele de receptivitate (ex. specii de pin şi larice). În acest caz, este necesar ca polenul uneia dintre cele două specii să fie colectat şi păstrat în condiţii care să asigure menţinerea viabilităţii materialului pentru perioade limitate de timp.

Mecanismul incompatibilităţii propriu-zise încă nu este elucidat pe deplin, dar cunoştinţe destul de avansate în domeniu sunt semnalate la unele specii de angiosperme. Astfel, la plop se cunosc mult mai în detaliu mecanismele intime (semnale biochimice) ale acestui fenomen, respectiv prezenţa unor molecule de pe suprafaţa polenului şi a stigmatului. Aceste molecule se constituie într-un adevărat “decodor” biochimic prin care polenul depus pe stigmat este respins sau, dimpotrivă, acceptat. În acest din urmă caz, polenul germinează şi se poate realiza fecundarea ovulului.

S-au semnalat situaţii (ex. la teste de hibridare între două specii de plop) când germinarea grăunciorilor de polen s-a oprit la jumătatea stilului. Tot de incompatibilitate

26

putem vorbi şi în situaţia avortării bruşte a embrionilor abia rezultaţi în urma unor fecundări interspecifice.

Toate aceste constatări au determinat pe specialiştii în domeniul ameliorării genetice forestiere să efectueze o serie de cercetări, iar primele rezultate încurajatoare pe linia eliminării efectelor acestui fenomen nedorit au apărut la sfârşitul deceniului 7, secolul trecut. În acest sens, cea mai notabilă realizare experimentală în domeniu s-a înregistrat la efectuarea unor teste pe diferite specii de plop, cea mai cunoscută fiind efectul Mentor. Tehnica este destul de simplă şi porneşte de la două probe iniţiale de polen, unul compatibil dar cu nuclei spermatici inactivaţi şi, cea de-a II-a, cu polen incompatibil dar cu nuclei spermatici normali. Amestecul celor două probe de polen a fost depus pe stigmatul unei flori femele, iar germinarea polenului compatibil a determinat formarea tuburilor polenice şi la nivelul materialului incompatibil. Evident, până la urmă, fecundarea s-a realizat doar din direcţia polenului incompatibil, întrucât numai acesta prezenta nuclei spermatici normali.

La gimnosperme, aplicarea acestei metode nu a dus la obţinerea unor rezultate promiţătoare ca în cazul plopului şi, de aceea, s-au încercat şi alte variante experimentale în vederea suprimării efectului de incompatibilitate ce apare frecvent la polenizările interspecifice. Una dintre cele mai utilizate tehnici a fost aceea de aplicare a unor solvenţi organici pe suprafaţa stigmatului. Rezultatele însă au fost mult mai modeste şi, în rarele cazuri de reuşită (ex. hibridări între unele specii ale genului Pinus), seminţele rezultate au fost în mare măsură sterile sau, în alte cazuri, tuburile polenice nu ajuns decât până la un punct intermediar al ţesutului femel. La molid, doar prin aplicarea efectului Mentor, s-au obţinut unele rezultate pozitive în realizarea de hibridări interspecifice.

3.2.3.3. Explicarea fenomenului de androsterilitate Asemenea multor specii de plante din flora ierboasă (spontană şi cultivată) şi la

diferite specii lemnoase apare frecvent fenomenul de androsterilitate, respectiv forme fără polen sau cu polen steril. Cauza majoră a manifestării acestui fenomen se poate explica prin defectele apărute în formarea unor elemente la nivelul organelor florale mascule (antere deformate, vide, indehiscente, producere de polen neviabil) sau prin absenţa anterelor. Aceste exemplare s-au dovedit însă extrem de utile în practica ameliorării forestiere prin faptul că aceşti indivizi, în calitate de genitori materni, pot produce descendenţi (hibrizi) cu un pronunţat fenomen de heterozis, evitându-se operaţii complicate şi stresante de castrare.

În ceea ce priveşte stabilirea originii acestui fenomen, cercetătorii în domeniu au căutat să elucideze şi să dea mai multe explicaţii, pornind de la teoria conform căreia androsterilitatea are cauze genetice şi ar depinde de gene localizate în nucleu, (recesive), în citoplasmă dar şi în urma unor interacţiuni nucleo-citoplasmatice.

Pornind de la această premiză, de-a lungul timpului s-au formulat mai multe teorii (ipoteze) cu privire la apariţia şi manifestarea fenomenului de androsterilitate.

1. Ipoteza apariţiei spontane se bazează pe explicaţia instabilităţii eredităţii extranucleare, iar plantele (inclusiv arbori) androsterile sunt menţinute în interiorul unei populaţii.

2. Ipoteza apariţiei în momentul efectuării încrucişărilor este susţinută prin apariţia unor exemplare androsterile în cadrul unor încrucişări interpecifice sau intergenerice (între grâu şi secară).

3. Ipoteza apariţiei la inducerea mutagenezei care este demonstrată prin apariţia de indivizi androsterili în urma efectuării de tratamente prealabile cu diferiţi factori mutageni (chimici/colchicină sau fizici/radiaţii) a exemplarelor selectate.

27

4. Ipoteza virală se bazează pe faptul că la o serie de plante androsterile (ex. la exemplare aparţinând genului Vicia) au fost descoperiţi corpusculi mici cu două molecule de ARN. Prin marea lor asemănare cu virusurile, aceste particule sferice au şi fost denumite pseudovirusuri, fiind depistate în număr mare în ţesuturile androsterile.

5. Ipoteza mitocondrială este, se pare, teoria cea mai avansată şi se bucură, în prezent, de o tot mai largă credibilitate în domeniu. După cum bine se cunoaşte, mitocondria joacă un rol decisiv în etapa de formare a gameţilor, prin energia ce o pune la dispoziţia întregului proces de gametogeneză. În urma efectuării unor cercetări mai aprofundate, s-a putut întocmi o listă de argumente ştiinţifice ce susţin această ipoteză.

Astfel: - există diferenţe notabile în ceea ce priveşte cantităţile unor constituenţi membranari

de la nivelul mitocondriilor între exemplarele androsterile şi cele normale; - s-a descoperit o rearanjare a secvenţelor ADN-ului mitocondrial de la plantele

androsterile, comparativ cu cel de la exemplarele normale; - în cadrul fuziunii protoplaştilor are loc un transfer al androsterilităţii prin asociere cu

un anumit segment al ADN-ului mitocondrial; - s-a demonstrat existenţa unor diferenţe între catenele polipeptidice (sintetizate in

vitro) de la plante androsterile şi cele fertile. Este evident faptul că, separat, o teorie sau alta nu poate elucida acest fenomen şi, prin

urmare, determinismul androsterilităţii este încă departe de a fi complet lămurit. Numai descifrarea tuturor mecanismelor de la nivel molecular ar putea crea o bază certă privind elaborarea unei viitoare teorii complete asupra acestui fenomen.

IV. METODE MODERNE (NECONVENŢIONALE) DE AMELIORARE FORESTIERĂ

Înainte de a fi prezentat pe larg acest capitol, trebuie precizat faptul că problematica

ameliorării forestiere în prezent dar, mai ales, în viitor este recomandabil să se raporteze şi la elemente specifice problematicii resurselor genetice forestiere. Aceste aspecte sunt în concordanţă cu ultimele reglementări naţionale şi internaţionale şi constituie, în prezent, elemente de bază în cadrul unor etape distincte ale programelor de ameliorare pentru cele mai importante specii forestiere.

Utilizarea poliploizilor naturali sau artificiali a constituit obiectul unor studii intense efectuate în Suedia (Ekebo) sau în Germania (Hamburg), în perioada 1930 – 1960 (Nanson, 2005). Experienţele privind iradierea unor plante tinere cu radiaţii ionizante puternice (β, α, γ) au condus însă la obţinerea unor rezultate extrem de nefavorabile, fapt ce a determinat abandonarea, în foarte mare măsură, a utilizării acestor tehnici experimentale în genetica forestieră. Măsura s-a dovedit pe deplin justificată, cu atât mai mult cu cât majoritatea speciilor de arbori deţin o variabilitate naturală la cote foarte înalte şi au cicluri de viaţă foarte lungi comparativ cu speciile ierboase.

Începând cu anii `90 ai mileniului trecut, cercetările în domeniul ingineriei genetice şi punerea la punct a diverselor tehnici moderne de explorare a variabilităţii au creat posibilităţi concrete de modificare a garniturii genetice şi încorporarea de transgene la unele specii de arbori (ex. specii de plop), noile forme putând fi ulterior multiplicate în sistem vegetativ. Recentele dezbateri privind necesitatea şi oportunitatea extinderii utilizării unor varietăţi transgenice (organisme modificate genetic - OMG) şi în practica silvică suscită încă multiple

28

controverse, ţinând cont de complexitatea structurii arborilor (inclusiv structura echipamentului genetic) şi de ciclurile lor lungi de viaţă. Totuşi, trebuie recunoscut interesul enorm pe care îl manifestă cercetătorii în acest nou domeniu, acesta putând oferi oportunităţi încă nebănuite în ceea ce priveşte realizarea unor forme de arbori cu caractere excepţionale pentru practica de ameliorare silvică.

4.1. Mutageneza şi implicaţiile practice în ameliorarea arborilor

În prezent, inducerea experimentală a mutagenezei este încă pe larg utilizată în practica

ameliorării speciilor cultivate şi în pomicultură. În zootehnie, procedeul este mult limitat datorită unei mult mai mari rigori privind determinismul cromozomial al sexelor şi a complexităţii structurale a organismelor animale.

4.1.1. Interesul obţinerii de varietăţi poliploide la speciile forestiere

În sens larg, poliploizii sunt indivizi posesori a mai mult de 2 seturi cromozomiale (3n – triploizi, 4n – tetraploizi, etc.) şi, la anumite specii vegetale, această “stare” legat de noua garnitură cromozomială oferă un optim fiziologic adaptiv şi productiv acestor varietăţi (ex. Triticum sp.).

La arbori, în marea majoritate a cazurilor, optimul fiziologic este conferit de starea normală de diploidie (2n) (în special la răşinoase). Totuşi, în urma cercetărilor efectuate în experimente de inducere a mutagenezei, s-a ajuns la concluzia că la unele specii de foioase (ex. plop tremurător), crearea facilă a unor forme triploide s-a dovedit a fi un real câştig pe linia ameliorării acestor specii, mai ales în privinţa acumulărilor bioproductive şi a ritmului de creştere.

Obţinerea de forme poliploide la unele specii forestiere este posibilă prin aplicarea unor metode experimentale, dintre care cele mai utilizate sunt cele chimice şi biologice. Metodele biologice presupun regenerări de ramuri sau tulpini după tăierea lor sau aplicarea unor tratamente speciale cu diferiţi paraziţi pe vârfurile de creştere. Aceste tehnici au totuşi un caracter mai restrictiv, rezultate notabile fiind înregistrate mai mult în pomicultură.

Mult mai pe larg utilizate sunt tratamentele chimice, în acest sens, cel mai intens aplicat agent chimic fiind colchicina, alcaloid extras din brânduşa de toamnă (Colchicum autumnale). Aceasta se prepară sub formă de soluţii, de diferite concentraţii (acestea nu depăşesc însă 0,5%), care se aplică pe vârfuri de creştere. O altă modalitate mult mai comodă şi eficientă este cea de imersare a seminţelor, pe diferite perioade de timp, în soluţia de colchicină.

Recunoaşterea exemplarelor poliploide rezultate se face prin înregistrarea anumitor particularităţi morfologice (după specie) dar, mai ales, după efectuarea unor teste şi observaţii citogenetice (analize microscopice).

4.1.2. Obţinerea de poliploizi la răşinoase

Ca şi în cazul utilizării altor metode moderne privind modificarea structurală şi funcţională a echipamentului genetic, răşinoasele răspund, în general, mult mai greu la aplicarea tratamentelor chimice specifice, comparativ cu multe dintre speciile de foioase.

În cadrul inducerii experimentale a mutagenezei, la tratamentele cu soluţii de colchicină aplicate seminţelor (imersare la concentraţie de 0,2%, umectare în faza de germinaţie a seminţelor la o concentraţie de 0,4%, respectiv cultură de embrioni pe medii cu colchicină) s-au obţinut, cu relativă dificultate, serii de poliploizi şi unele exemplare de

29

mixoploizi la specii ale genurilor Abies şi Pinus. Indivizii poliploizi obţinuţi au prezentat însă creşteri mult mai slabe, comparativ cu indivizii normali diploizi (un evident fenomen de nanism), noile forme având ramuri groase şi ace mai scurte. Adesea, la aceste exemplare se remarcă şi lipsa înfloririi. Puieţi colchicinizaţi s-au mai obţinut şi la molid, însă numărul acestora a fost mult mai redus.

După cum se cunoaşte, răşinoasele, comparativ cu foioasele, sunt specii lemnoase mult mai vechi, cu o mare dezvoltare în mezozoic (au o vechime de peste 300 milioane de ani) şi, în consecinţă, structura lor genetică este de foarte mult timp stabilizată. Din acest motiv, gimnospermele au optimul metabolic şi adaptiv în stare de diploidie, pe când poliploizii acestora sunt pitici, nu înfloresc şi adesea nici nu supravieţuiesc.

În concluzie, se poate afirma că inducerea poliploidiei la specii de răşinoase nu prezintă interes din punct de vedere economic al ameliorării forestiere, puţinele forme poliploide obţinute interesând doar din punct de vedere estetic şi ornamental.

4.1.3. Obţinerea de poliploizi la foioase La o serie de specii foioase de arbori, inducerea mutagenezei a atins o înaltă cotă

privind performanţele cantitative şi calitative şi, în consecinţă, în practica de ameliorare a acestor forme şi varietăţi, mutageneza dovedeşte mari disponibilităţi şi practici extrem de performante. Astfel, cazul plopului tremurător a devenit, de ceva vreme, de mare notorietate, pornind de la utilizarea formelor naturale de poliploizi sau de inducere şi obţinere artificială a triploizilor cu mare randament de creştere şi potenţial de adaptare. De exemplu, în Suedia, în cadrul unor populaţii de plopi tremurător, exemplarele de triploizi depăşesc indivizii normali (2n) cu cca. 14% la înălţime şi cu peste 50% în volum.

Producerea de plopi tremurători triploizi 1) Plecând de la triploizi naturali În cadrul unei populaţii, plopii tremurători triploizi produc gameţi n şi 2n (mai rar 3n)

şi se încrucişează cu indivizi diploizi care produc numai gameţi n, rezultând descendenţi diferiţi ca grad de ploidie (2n, 3n şi mai rar 4n) (fig. 7). Indivizii tetraploizi sunt de mică înălţime şi fără vigoare, ceea ce indică faptul că s-a depăşit optimul de 3n. Totuşi, aceşti indivizi sunt utilizaţi la încrucişarea cu exemplare normale diploide, în vederea obţinerii de noi triploizi. Aceştia sunt autotriploizi, deoarece provin din indivizi aparţinând aceleaşi specii.

Figura 7. Producerea artificială de triploizi la plopul tremurător (după Nanson, 2005)

30

2) Plecând de la triploizi artificiali Indivizii triploizi naturali sunt destul de rari şi au o fertilitate scăzută, aceste

manifestări fiind datorate probabil garniturii cromozomiale relativ instabile. Acest lucru i-a determinat pe cercetătorii din Suedia, de exemplu, să recurgă la producerea artificială şi utilizarea tetraploizilor prin tehnica colchicinizării (fig. 7). În acest sens, seminţe de plop diploid au fost aşezate în plăci Petri, pe hârtie de filtru impregnată cu soluţie de colchicină 0,2% În urma aplicării acestui tratament, a rezultat un număr redus de plantule tetraploide de plop şi un anumit procent de plante mixoploide (indivizi diploizi ce conţin în structura lor anumite ţesuturi tetraploide). Cel mai important aspect este ca, la final, ţesuturile generatoare de flori să fie tetraploide. După creştere, înflorire şi selecţie, părinţii tetraploizi se încrucişează cu exemplare diploide, rezultând triploizi în sistem regulat.

În Germania, Froelich şi Illies au obţinut triploizi, reuşind încrucişarea între exemplare 4n de Populus tremula şi indivizi 2n de Populus tremuloides (specie americană). În acest fel au fost obţinuţi alotriploizi, indivizi ce se caracterizează prin creşteri rapide, vigoare deosebită, precum şi o bună rezistenţă la boli şi dăunători. Din aceste motive, formele obţinute au fost trecute într-un sistem clonal intensiv de multiplicare, utilizându-se experimental micropropagarea (multiplicarea în masă in vitro). (fig. 8).

Extinderea metodologiei utilizării şi obţinerii de poliploizi s-a materializat prin aplicarea acestei tehnici şi la alte specii de foioase, cum ar fi, în principal, la alun şi mesteacăn.

Astfel, după Gathy, pe la mijlocul anilor ´50 ai secolului trecut, în pădurile din Suedia au fost depistate 5 exemplare de mesteacăn triploid, unul dintre ele măsurând cca. 26 m în înălţime, la o vârstă de 25 ani.

Exemplarele tetraploide, obţinute în urma încrucişării dintre indivizi 2n şi 4n (max. 1% din descendenţă), sunt mai puţin viguroase şi cu numeroase defecte de formă, comparativ cu triploizii din aceeaşi generaţie. În natură, aceşti indivizi sunt eliminaţi rapid prin acţiunea selecţiei naturale, de unde şi explicarea absenţei acestora în păduri, la vârste mai înaintate. În schimb, exemplarele triploide au dovedit cam aceeaşi vigoare şi capacitate de creştere ca şi în cazul diploizilor normali.

Figura 8. Hibrizi alotriploizi “Astria”de Populus tremuloides x Populus tremula (vitro-

plante în pepinieră) (după Nanson, 2005)

31

32

În cazul genului Alnus, s-a dovedit faptul că formele de alotriploizi, rezultate în urma încrucişării dintre Alnus rubra 2n şi Alnus glutinosa 4n, au avut o creştere excelentă. O situaţie asemănătoare s-a observat şi în cazul unor autotriploizi de Betula verrucosa.

4.1.4. Mutaţii genice şi cromozomiale la speciile forestiere Din experienţa destul de vastă acumulată în practica ameliorării speciilor cultivate sau

ierboase, mutaţiile genice şi cromozomiale (deleţii, inversii, duplicaţii sau translocaţii) sunt destul de frecvente, însă depistarea acestora la speciile forestiere este foarte dificil de realizat. În acest sens, există extrem de puţine realizări şi date atât în ceea ce priveşte depistarea unor mutante, cât şi inducere experimentală a acestor tipuri de mutaţii. De exemplu, apariţia unor exemplare cu deficienţe ale sistemului clorofilian ar fi, se pare, datorată unor mutaţii cromozomiale.

Pe de altă parte, în natură au fost identificate câteva situaţii punctuale referitor la apariţia unor mutanţi naturali, cum ar fi la brad (mutanţi cu coroană piramidală), la duglas (mutanţi cu ramuri în formă de mătură) sau la salcâm (forme mutante cu tulpini târâtoare). De asemenea, la alte specii lemnoase s-au identificat forme mutante cu frunze variegate.

În general, mutaţiile sunt mai uşor de depistat la formele haploide, naturale sau obţinute experimental prin andro şi ginogeneză, deoarece aceste forme au în structura lor ereditară doar o singură garnitură cromozomială, iar în fenotip, efectele se manifestă în prima generaţie, inclusiv în cazul mutaţiilor recesive.

În multe situaţii, exemplarele mutante şi-au dovedit din plin utilitatea în cadrul procesului de ameliorare a diferitelor specii şi varietăţi lemnoase, indivizii în cauză constituind un valoros material de plecare în cadrul unor cicluri mai ample de selecţie şi hibridare. Prin utilizarea acestor forme se scurtează foarte mult durata de timp necesară derulării acestor etape importante ale procesului de ameliorare. De asemenea, prin utilizarea unor mutanţi se pot obţine mai uşor indivizi mai rezistenţi la acţiunea nocivă a diferiţilor factori biotici şi abiotici.

AMELIORAREA ARBORILOR PRIN BIOTEHNOLOGII ŞI INGINERIE

GENETICĂ Conceptul de inginerie genetică reflectă, la modul cel mai sintetic, dezvoltarea impetuoasă a domeniului de vârf în genetica şi biologia modernă, urmare firească a marilor descoperiri efectuate în ultimele decenii în domeniul biochimiei şi geneticii moleculare. Pe de altă parte, nevoile crescânde ale societăţii umane privind sporirea şi diversificarea permanentă a gamei de produşi alimentari, precum şi necesitatea găsirii de noi şi tot mai eficiente tratamente legate de profilaxia multor maladii genetice grave, inclusiv a cancerului, constituie motivaţii extrem de puternice privind avântul spectaculos al acestui nou domeniu. La modul cel mai concret posibil, ingineria genetică poate fi definită ca un ansamblu de metode şi tehnici care poate face posibilă manipularea materialului genetic la nivel molecular, în sensul modificării structurii macromoleculei de ADN, respectiv de izolare, sinteză artificială şi transfer de gene la alte organisme, unele foarte îndepărtate din punct de vedere taxonomic şi filogenetic. În acest mod, se poate trece foarte uşor peste aceste bariere şi se poate obţine rapid un nou organism, pornind de la o singură celulă, ţesut sau fragment de organ.

Unele dintre aceste metode, datorită eficienţei şi rapidităţii extraordinare de dezvoltare, au putut fi trecute în regim industrial, acestea constituind noile ramuri ale biotehnologiilor. Ne referim aici, mai cu seamă, la tehnica micropropagării (multiplicarea in vitro a celulor şi ţesuturilor vegetale), la obţinerea de protoplaşti şi hibridarea somatică a organismelor vegetale, sau obţinerea la scară industrială de seminţe artificiale, inclusiv pentru specii forestiere.

Trebuie menţionat faptul că şi silvicultura (mai ales în domeniul ameliorării) a adoptat unele dintre metodele şi tehnicile acestui nou domeniu, în scopul îmbunătăţirii însuşirilor ereditare ale celor mai importante specii forestiere. Una dintre cele mai utilizate tehnici în domeniu o constituie cultura “in vitro” de celule şi ţesuturi vegetale.

4.2. Cultura in vitro de celule şi ţesuturi vegetale

Prin cultura in vitro de celule şi ţesuturi vegetale se înţelege detaşarea unei celule sau a unui meristem apical (explant) de pe o plantă donatoare, cultivarea acestora pe un mediu sintetic aseptic (în condiţii controlate de temperatură şi lumină) şi obţinerea de noi organisme, precum şi multiplicarea acestora.

Reuşita acestei metode se bazează pe totipotenţa celulei vegetale, în sensul că explantul (celula sau ţesutul meristematic) este o unitate vie, independentă de locul de origine, care deţine întreaga cantitate de informaţie genetică preluată de la planta mamă şi poate regenera o nouă plantă. Faptul că într-un timp relativ scurt (în mai puţin de un an) se pot obţine prin micropropagare milioane de exemplare (copii fidele ale plantei donatoare), forme care în condiţii obişnuite s-ar obţine foarte greu sau nu ar putea supravieţui, reprezintă un câştig enorm privind eficienţa şi implicaţiile practice ale acestei metode în ameliorarea multor şi importante specii forestiere. De asemenea, prelevarea şi cultura “in vitro” de meristeme asigură obţinerea şi multiplicarea unui material biologic sănătos, liber de viruşi.

4.2.1. Specificul activităţii într-un laborator de culturi in vitro Laboratorul propriu-zis este încăperea unde se prepară mediile de cultură. În acest

scop, această încăpere trebuie să fie suficient de spaţioasă şi iluminată corespunzător, cu instalaţii de apă şi canalizare curentă, reţea de electricitate şi gaz. Camera de creştere este încăperea cea mai importantă şi caracteristică oricărui laborator de culturi in vitro, în care explantele inoculate pe medii sintetice aseptice cresc şi se dezvoltă pentru multiplicare. În acest scop, camerele de creştere sunt dotate cu sistem automatizat de climatizare, asigurându-se un regim controlat de temperatură (20-25oC) şi umiditate (50-60%). Iluminatul (3200-5000 lx) este furnizat de lumina albă şi rece a tuburilor fluorescente, montate la partea superioară a etajerelor pe care sunt aşezate culturile (la cca. 40 cm deasupra) (fig. 9). Menţinerea la lumină a culturilor se face prin poziţionarea lor verticală sau uşor înclinată. Fotoperioada optimă de16 ore lumină şi 8 ore întuneric pe zi este necesară stimulării progresive adecvate a caulogenezei şi rizogenezei “in vitro” la explantele majorităţii speciilor vegetale.

Zona aseptică sau camera sterilă este încăperea în care se execută sterilizarea, prelevarea, inocularea explantului pe mediu de cultură şi multiplicarea (micropropagarea) materialului biologic obţinut. Toate aceste operaţiuni se execută la hota cu flux laminar de are steril (fig. 10). Pe cât posibil, această încăpere va fi cât mai izolată de restul camerelor laboratorului şi este indicat să fie aşezată în apropierea zonei de preparare a mediilor.

În reuşita cultivării explantelor vegetale pe medii aseptice, un rol foarte important revine mediilor de cultură, prin compoziţia lor chimică, natura elementelor chimice din substrat şi proporţia acestora, epuizarea preferenţială a unor compuşi sau concentrarea altora.

Fig. 9. Cameră de creştere (după Nanson, 2005)

34

Figura 10. Hotă cu flux laminar de aer steril (original)

Mediile de cultură conţin în compoziţia lor substanţe anorganice şi organice. Elementele chimice din componenta anorganică pot fi accesibile celulei vegetale sub forma unor anumite tipuri de compuşi sau soluţii şi sunt împărţite în macroelemente şi microelemente. Din acest punct de vedere, cel mai utilizat tip de mediu de cultură este mediul Murashige-Skoog (tab. 2).

În cadrul componentei organice a mediului de cultură se includ vitamine (inozitol, tiamină, pantotenat de calciu, ac.nicotinic, ac.ascorbic), fitoregulatori de creştere (auxine, citochinine şi gibereline), substrat de carbon (zaharoză) şi agar (când se prepară mediu solid).

Fitoregulatorii sunt din cei aparţinând celor 3 mari grupe, respectiv auxine, gibereline şi citochinine, iar agarul (un polizaharid extras din alge roşii) reprezintă agentul solidificator al mediului de cultură.

Alegerea explantelor la speciile forestiere depinde de metoda de multiplicare utilizată. De regulă, se recoltează mugurii axilari (se au în vedere meristemele apicale caulinare situate la baza frunzelor), deoarece utilizarea unor explante mai mari (noduri de 2-5 cm lungime) ar creşte considerabil riscul perpetuării contaminărilor microbiene secundare. La speciile lemnoase care sunt multianuale, o problemă practică foarte importantă este cea a reîntineririi unor organe de pe care urmează să fie prelevate meristeme apicale. Explantele sau butaşii prelevaţi de pe astfel de plante îşi pierd capacitatea de înrădăcinare. De aceea, la arbori aplicarea prealabilă culturii in vitro a unor metode de reîntinerire a materialului biologic prin butăşiri sau microbutăşiri “in vitro”, altoiri de apexuri de plante adulte pe tinere plantule (formate din seminţe), tăieri, altoire repetată sau simplă, etc.

Alegerea celei mai potrivite metode de dezinfectare a explantului trebuie să ţină seama de natura organelor, profunzimea ţesuturilor care vor deveni explante, de fineţea tegumentelor şi a epidermei. Inocularea reprezintă operaţiunea de detaşare şi aşezare a explantului (meristemul apical caulinar) pe mediul de cultură aseptic. Datorită fragilităţii şi dimensiunilor foarte mici ale explantului (un meristem are diametrul, în medie, de 0,1-0,2 mm), această operaţie este extrem de delicată şi dificilă şi se efectuează, obligatoriu, sub lupa binoculară amplasată în incinta hotei cu flux laminar de aer steril. De asemenea, tot instrumentarul se

35

sterilizează în alcool şi se flambează la becul de gaz din incinta hotei, înaintea şi după fiecare inoculare. Tabelul 2

Mediul Murashige-Skoog (MS,1962) (după Cachiţă-1987) Concentraţii Ingredient

în soluţii stoc (mg/l) în mediu (mg/)

Azotat de amoniu (M) 82.500 1.650

Azotat de potasiu 95.000 1.900

Sulfat de magneziu 18.500 370

Fosfat de potasiu 8.500 170

Acid boric (m) 620 6,2

Sulfat de mangan 2.176 22,3

Sulfat de zinc 860 8,6

Molibdat de sodiu 25 0,25

Sulfat de cupru 2,5 0,025

Clorură de cobalt 2,5 0,025

Iodură de potasiu 83 0,83

Clorură de calciu 14.500 440

Na2EDTA 2.984 37,3

Sulfat feros (m) 1.114 27,8

M – macroelemente; m – microelemente

Îndepărtarea primordiilor foliare se poate face cu minibisturie mai mari sau cu ace spatulate. Primordiile foliare se detaşează complet pentru ca meristemul să fie cât mai bine expus şi individualizat. Rapiditatea efectuării acestei operaţiuni preîntâmpină apariţia riscului deshidratării meristemului detaşat în contact prelungit cu instrumentarul flambat. Imediat, recipientele se vor acoperi cu folie de polietilenă sterilizată în alcool de 70o, după care, culturile vor fi trecute în camera de creştere pentru incubarea, pasarea şi creşterea inoculilor. Primele săptămâni de menţinere a culturilor “in vitro” în camera de creştere reprezintă perioada de incubare, care se întinde ca durată în funcţie de natura explantului, de specie sau de condiţiile climatice. În primele zile după inoculare se fac trierile, îndepărtându-se flacoanele contaminate. Pe mediile solide, mucegaiurile sau coloniile bacteriene apar, cel mai adesea, la suprafaţa mediului, mai aproape sau mai departe de explante.

Inducerea proceselor regenerative la explantele speciilor lemnoase este mai lentă decât la inoculii plantelor ierboase sau speciile cultivate, aceste procese manifestându-se după cca. 45-60 de zile. Procesul de organogeneză “in vitro” debutează cu formarea primilor lăstari şi muguraşi (caulogeneza “in vitro”), după care are loc formarea primelor rădăciniţe (rizogeneza “in vitro”). Culturile care prezintă o încetinire evidentă a creşterii explantelor, fenomen datorat epuizării mai timpurie a substanţelor nutritive din mediu, vor

36

fi pasate pe mediu de cultură proaspăt şi steril. Stadiul final al etapei de organogeneză in vitro îl constituie formarea plantulelor din cultura primară. Înmulţirea in vitro a plantelor poartă denumirea de micropropagare (micromultiplicare sau microînmulţire). Este o formă de multiplicare vegetativă şi asigură un randament net superior, în comparaţie cu alte procedee practicate, până în prezent, în horticultură şi silvicultură. Micropropagarea se face prin minibutăşire in vitro, atunci când plantulele din culturile primare sunt bine dezvoltate, cu rădăciniţe, tulpiniţe şi frunzuliţe bine individualizate şi viguroase. Minibutaşii rezultaţi sunt trecuţi, în condiţii aseptice, pe medii de cultură noi şi vor forma culturile secundare. 4.2.2. Aclimatizarea în seră şi repicajul în pepinieră Multe vreme, din păcate, mulţi şi foarte buni specialişti în activitatea de laborator au neglijat adesea aspectul privind aclimatizarea în seră a materialului biologic obţinut in vitro, respectiv trecerea la condiţiile de vegetaţie in vivo, acest fapt fiind considerat secundar ca importanţă. Multiplele eşecuri apărute au determinat o reconsiderare a acestei atitudini şi, în consecinţă, eforturile specialiştilor s-au concentrat şi în această direcţie, ceea ce a determinat luarea de măsuri adecvate asigurării condiţiilor propice de a se obţine plante adecvate şi perfect aclimatizate.

Odată obţinută aclimatizarea, plantele pot fi trecut în pepiniere, loc în care personalul calificat îl va supune operaţiei de repicaj normal asemenea şi celorlalte tipuri de plante. Plantele obţinute în laborator sunt denumite în limbajul de specialitate ca vitro-plante (fig. 11).

Figura 11. Seră amenajată pentru aclimatizarea vitro-plantelor de Prunus avium (după Nanson, 2005)

4.2.3. Rezultate obţinute la specii forestiere

La specii ale unor importante genuri de foioase (Prunus avium, Populus sp., Betula, Quercus robur, Q. petraea, Eucalyptus, etc) s-au înregistrat rezultate pozitive sub aspect tehnic, însă din punct de vedere al eficienţei economice, realizări notabile au fost obţinute doar la cireşul sălbatic. De altfel, în Franţa au fost iniţiate şi dezvoltate programe complexe privind cultura şi multiplicarea in vitro la Prunus avium.

37

Referitor la specii de răşinoase, s-au obţinut unele rezultate sub aspect tehnic doar la câteva specii cum ar fi Picea abies, Pseudotsuga menziesii sau Larix eurolepis. De asemenea, unele experimente privind cultura in vitro, parţial reuşite, au fost efectuate la Sequoia sempervirens, în Statele Unite, sau Pinus radiata, în Noua Zeelandă.

La speciile agricole cultivate, unde variabilitatea genetică este mult îngustată, micropropagarea constituie şi un mijloc de a genera variaţii somaclonale, opţiune care la speciile forestiere nu s-a urmărit în mod deosebit datorită existenţei unei variabilităţi genetice naturale în limite încă largi.

4.3. Inducerea şi obţinerea de haploizi

Acest proces interesează şi practica silvică în domeniul ameliorării genetice, mai ales în perspectiva obţinerii de indivizi homozigoţi pentru toate genele, respectiv linii pure prin dublarea ulterioară a garniturii cromozomiale haploide.

La unele specii forestiere, obţinerea de exemplare haploide interesează în cel mai înalt grad specialiştii, datorită uşurinţei cu care se obţin aceste forme şi marii lor utilităţi în cadrul diferitelor programe de ameliorare. În acest sens putem aminti specii aparţinând genurilor Populus, Prunus, Ribes etc.

4.3.1. Obţinerea de haploizi prin androgeneză Prin conceptul de androgeneză se înţelege dezvoltarea partenogenetică a unui embrion, respectiv a unei plante haploide, pornind de la un nucleu haploid al microsporului sau grăunciorului de polen (Raicu, 1980). Primele experimente şi rezultate concrete au fost menţionate în 1964, când Guha şi Maheswari au cultivat antere de Datura innoxia pe mediu artificial, obţinând embrioizi haploizi. Prin cultura in vitro, programul normal de dezvoltare a microsporului (microsporogeneza) este deviat şi, în urma unor diviziuni de tip mitotic repetate, rezultă embrioizi care ulterior se vor transforma în plante haploide. În cazul androgenezei indirecte, în urma diviziunilor se formează mai întâi un ţesut nediferenţiat de tip calus, după care, în condiţii favorabile de mediu, temperatură şi lumină, acest ţesut se va diferenţia în organe şi, în final, în plante haploide. În cazul angiospermelor, în urma primei diviziuni meiotice, rezultă tetrade de microspori uninucleaţi haploizi. Aceştia vor suferi, în continuare, diviziuni de tip mitotic prin care din fiecare microspor vor rezulta două celule diferite ca mărime şi nuclei inegali (stadiul timpuriu al grăunciorului de polen). Din nucleul mare va rezulta nucleul generativ, care va mai suferi o diviziune după polenizare şi vor rezulta doi nuclei spermatici. Aceştia vor participa la dubla fecundare, prin care unul va fecunda oosfera şi va rezulta zigotul, iar celălalt va fecunda nucleul secundar al sacului embrionar şi va rezulta endospermul (fig.12). Cultura in vitro a anterelor în condiţii controlate de mediu, temperatură şi lumină, va devia traiectul normal al microsporogenezei, în sensul că, în urma primei diviziuni de tip mitotic, se vor forma două celule egale, iar microsporul se va dezvolta pe calea embriogenă. (fig. 13). În această situaţie, celula generativă degenerează şi nu participă la formarea viitorului organism haploid.

38

Figura 12. Dezvoltarea normală a microsporilor la angiosperme (după Raicu, 1980)

În reuşita acestei operaţii concură mai mulţi factori, factori legaţi de planta donatoare (vârsta anterelor, poziţia lor pe butonul flora, sezonul de recoltare) pe de o parte, factori legaţi de aplicarea unor pretratamente cu efect pozitiv (şocuri termice la +30C sau temperaturi ridicate de până la +350C), de mediu de cultură (cu factorul de solidificare – agar sau diferite combinaţii şi concentraţii ale fitoregulatorilor de creştere), pe de altă parte. Mai este utilizată şi aplicarea unor tratamente cu diverse substanţe chimice.

Figura 13. Obţinerea de haploizi prin androgeneză directă şi via calus (după Raicu, 1980)

39

4.3.2. Obţinerea de haploizi prin ginogeneză

Dacă devierea prin cultura in vitro a anterelor a devenit deja o operaţie facilă şi de rutină, în cazul culturii de celule ovariene ca noi surse de obţinere a plantelor haploide condiţiile sunt mult mai dificil de realizat, fapt datorat mai ales încă necunoaşterii complete a efectelor diferitelor tratamente fizice sau chimice privind devierea gametofitului femel normal şi obţinerea de haploizi.

La angiosperme, în urma meiozei a I-a rezultă 4 macrospori haploizi, din care unul va suferi noi diviziuni de tip mitotic ce vor duce la formarea sacului embrionar cu 8 celule haploide (fig. 14).

În ceea ce priveşte eficacitatea acestei metode, comparativ cu androgeneza, se situează la cote mult mai scăzute, rezultând un număr redus de haploizi la 100 de ovule cultivate.

Figura 14. Macrosporogeneza şi formarea sacului embrionar la angiosperme (după Şerbănescu şi Toma, 1980)

4.3.3. Importanţa genetică a haploizilor obţinuţi prin androgeneză

Rezultatele mai mult decât încurajatoare obţinute la tot mai multe specii de plante, inclusiv specii forestiere, confirmă pe deplin justeţea teoriei totipotenţei celulei vegetale, enunţată de către Haberlandt la începutul sec. al XX-lea.

Plantele haploide sunt pure din punct de vedere genetic datorită fenomenului de hemizigoţie, existând o corespondenţă totală între genotip şi fenotip.

Plantele haploide obţinute prin androgeneză experimentală sunt şi foarte variate genotipic, datorită faptului că în meioza a I-a are loc recombinarea genetică, ceea ce constituie un mare avantaj pentru ameliorarea bazată pe selecţie.

La haploizi se pot selecta foarte uşor cei cu mutaţii recesive, acestea fiind foarte greu decelabile la diploizi.

Utilizarea haploizilor în ameliorarea plantelor conduce la o reducere semnificativă (cca. 7-8 ani) a timpului necesar obţinerii unor linii pure şi, pe de altă parte, pentru studierea diferitelor caractere în procesul de ameliorare este necesar un număr mult mai redus de indivizi. În acest din urmă caz, se reduce considerabil şi volumul de muncă, mărindu-se totodată şansele de a se selecţiona mai rapid şi mai precis homozigoţii importanţi în ameliorare.

40

4.4. Cultura de embrioni sexuaţi in vitro

În cadrul activităţii de ameliorare a diferitelor specii de arbori, la efectuarea hibridărilor interspecifice, în majoritatea cazurilor, hibrizii rezultaţi avortează sau sunt sterili. Aceste fenomene nedorite sunt, cel mai adesea, puse pe seama incompatibilităţii dintre ţesuturile embrionare şi cele ovariene dar şi a sensibilităţii deosebite a embrionilor interspecifici rezultaţi. Laboratoarele moderne din institutele de specialitate sunt dotate cu echipamente şi aparatură ce permit cultura in vitro a acestor embrioni, condiţii în care se pot dezvolta şi viitoarele plante hibride. Dublul avantaj al utilizării acestei metode biotehnologice este conferit de faptul că acestor embrioni li se poate induce o dezvoltare normală dar, mai ales, este posibilă o accelerare a vitezei de selecţie. Embrionii pot fi recoltaţi imediat după fecundare şi nu mai este necesară parcurgerea etapei de maturare a seminţelor, ceea ce pentru ameliorarea majorităţii speciilor forestiere, specii caracterizate printr-o longevitate mare şi maturare târzie, reprezintă un foarte important câştig. Reducerea acestor intervale de timp, face posibilă totodată şi introducerea mai rapidă a unui nou caracter într-o nouă varietate. De asemenea, obţinerea mult mai rapidă de linii pure, în urma efectuării anuale a mai multor cicluri de autofecundare, reprezintă un alt mare avantaj în ceea ce priveşte iniţierea şi aplicarea acestei biotehnologii.

4.5. Embriogeneza somatică şi seminţele artificiale

Pe plan european, ca urmare a unor eşecuri în ceea ce priveşte aplicarea şi extinderea culturii şi multiplicării in vitro la unele specii importante de arbori, cercetările s-au orientat către adoptarea unor noi tehnici biotehnologice, cum ar fi embriogeneza somatică şi obţinerea de seminţe artificiale. 4.5.1. Embriogeneza somatică

Tehnica embriogenezei somatice urmăreşte multiplicarea indivizilor, plecând de la embrioni imaturi sau chiar maturi (la anumite specii). Un scop asociat acestei tehnici îl constituie obţinerea de seminţe artificiale.

Embrionii imaturi sunt extraşi de la seminţele aflate încă în stadiul de formare. Materialul biologic prelevat este fragmentat şi cultivat pe mediu de cultură aseptic adecvat. În cazul reuşitei, fragmentele de material secţionat se transformă treptat în proembrioni. Aceştia trebuie separaţi cu ajutorul microtomului şi repicaţi pe un mediu de cultură în care se pot dezvolta şi atinge maturitatea, cu timpul devenind plantule înrădăcinate. În acest stadiu, materialul biologic este scos din mediul de cultură şi apoi este repicat în sere sau pepiniere, devenind embrio-plante (fig. 15 ).

Această tehnică s-a dovedit fezabilă pentru molid, nuc şi alte specii lemnoase. De exemplu, în Belgia s-a reuşit crearea mai multor embrio-plante, plecând de la embrioni imaturi recoltaţi din livezi semincere. Un caz foarte interesant a fost semnalat când s-a obţinut o embrio-plantă trizomică, ceea ce conferă o oarecare notă de risc în utilizarea acestei tehnici prin faptul că pot rezulta şi mutanţi somatici, uneori periculoşi pentru practica silvică. Pe de altă parte, costurile prohibitive legate de tehnicile in vitro pot constitui, de asemenea, un factor limitativ puternic privind utilizarea pe scară largă a acestei biotehnologii.

41

Figura 15. Seră de aclimatizarea a embrio-plantelor de Picea abies (după Nanson,

2005)

4.5.2. Tehnologia obţinerii seminţelor artificiale În ultima perioadă, ca urmare a avântului deosebit înregistrat în domeniul

biotehnologiilor, s-a trecut la o propagare în sistem intensiv (industrial) a unor varietăţi şi biotipuri extrem de valoroase cu o constelaţie de gene de mare performanţă, dar care, prin reproducerea sexuată, nu s-ar putea obţine, în timp relativ scurt, cantităţi suficiente de material biologic de valoare şi performant economic. Rezolvarea problemei a venit odată cu punerea la punct a tehnicii de obţinere a seminţelor artificiale şi trecerea acesteia în fază industrială. Condiţia de “defect zero” la seminţele naturale (care germinează 100% şi rezultă numai plante viguroase) nu poate fi niciodată atinsă, chiar dacă se fac unele intervenţii la polenizare, la fecundare sau chiar la formarea seminţelor. Afectarea membranelor în condiţii de deshidratare, apărute în timpul germinării, va conduce invariabil la producerea unor daune, în sensul că se va pierde o parte a substanţelor de rezervă (de exemplu, unele proteine absolut indispensabile unei bune germinaţii). De asemenea, pot apărea mari probleme în perioada de stocare a seminţelor diferitelor specii, datorită faptului că sunt afectate ireversibil mai multe sisteme enzimatice responsabile de rezistenţa la efectele negative ale oxigenului şi derivaţilor acestuia. În timpul manipulării stocurilor de seminţe (livrări, schimburi, etc.) este foarte probabilă apariţia de leziuni, daune sau chiar distrugeri, mai ales la speciile lemnoase ale căror seminţe dovedesc o deosebită fragilitate.

În noua tehnologie de obţinere şi producere a seminţelor artificiale, sistemul de culturi in vitro utilizează anumite tipuri de material biologic, în general ţesuturi foarte tinere (cu caracter embrionar), cele mai potrivite fiind inflorescenţe, părţi de cotiledoane, sau axe hipocotile. Tehnologia seminţelor artificiale se realizează, de fapt, prin înglobarea acestor ţesuturi în medii nutritive şi învelirea acestor ansambluri cu pelicule permeabile şi biodegradabile. Culturile pentru obţinerea seminţelor artificiale se realizează în bioreactoare de diferite capacităţi, similare celor utilizate în industria fermentativă sau cea a produşilor microbieni. La sfârşitul procesului tehnologic, embrionii sunt foarte fragili şi expuşi şi, de aceea, sunt imediat înveliţi într-o peliculă care le permite menţinerea în viaţă pentru o perioadă relativ scurtă de timp (în funcţie de cantitatea de mediu de sub înveliş).

42

Membrana protectoare va avea de îndeplinit 3 funcţii importante: - de protecţie, prin care noul embrion din interior, aflat într-o stare similară

dormanţei, va fi ferit de şocurile termice sau hidrice din exterior, putând, în aceste condiţii, să fie transportat şi păstrat o anumită perioadă de timp;

- de nutriţie, în urma căreia viitoarea plantulă are posibilitatea să se hrănească din microrezerva de mediu de cultură aflată sub membrana de protecţie;

- de apărare şi revigorare, prin aceea că embrionul are asigurată o protecţie fitosanitară minimă împotriva diferiţilor agenţi patogeni.

În ciuda costurilor relativ ridicate privind producerea la scară industrială a seminţelor artificiale, trebuie remarcat totuşi interesul tot mai mare manifestat de către specialiştii din agricultură, pomicultură şi, mai recent, în silvicultură. Acest fapt este justificat de marea problemă privind înmulţirea dificilă (uneori chiar imposibilă) pe cale naturală (prin sămânţă) a unor varietăţi hibride extrem de performante.

Tehnologia producerii seminţelor artificiale este încă la început dar se bucură, deja, de un interes crescând atât în silvicultură, cât şi în agricultură. Seminţele artificiale sunt, în mod evident, mai scumpe decât cele naturale dar ele prezintă avantaje incontestabile care fac ca producerea şi utilizarea lor să devină rentabilă. Este deja cunoscut faptul că unele varietăţi hibride performante se reproduc foarte greu, sau chiar deloc, prin sămânţă (sterilitate sau meioze neregulate). Pe de altă parte, la unele varietăţi de gimnosperme (pin, larice, molid), tehnologia producerii de seminţe artificiale constituie unica posibilitate de multiplicare şi difuzare în masă a unui material deosebit de valoros obţinut în cadrul unor etape distincte ale proceselor de ameliorare.

În S.U.A., de exemplu, la molidul comun s-au obţinut rezultate promiţătoare încă pe la mijlocul anilor 80, creându-se la scară industrială forme cu rezistenţă crescută la diverse maladii sau cu toleranţă deosebită la diferiţi produşi chimici.

4.6 Obţinerea şi cultura protoplaştilor. Hibridarea celulară (somatică)

Primele metode cu adevărat eficiente de obţinere şi izolare a protoplaştilor (celule vegetale fără peretele celular) au fost puse în aplicare în deceniul al VII-lea al secolului trecut, îndepărtarea peretelui rigid celulozo-pectic făcându-se prin perfecţionarea tehnicilor enzimatice. Primele experimente şi totodată realizarea primelor regenerări de plante întregi au fost obţinute de către francezul J. P. N i t s c h, în anul 1971. El a reuşit regenerarea unor plante de tutun, pornind de la cultura pe mediu artificial a unor celule nude, complet separate unele de altele. Ulterior s-a reuşit izolarea şi obţinerea de protoplaşti şi la alte specii vegetale (soia, morcov, petunie, mazăre, bob), inclusiv la specii lemnoase şi de arbori (plop, pin, ienupăr, măr). Suspensiile monocelulare ale protoplaştilor pot fi obţinute practic din orice tip de ţesut vegetal, aceste ansambluri permiţând efectuarea unor studii extrem de avansate şi de mare fineţe în vederea elucidării a numeroase şi complexe procese biologice la nivel celular şi molecular. În acest sens, obţinerea protoplaştilor şi, mai ales, fuzionarea acestora deschid perspective dintre cele mai largi asupra procesului de manipulare a structurii şi informaţiei genetice cantonată într-o celulă şi, în final, de elucidare a fenomenului de omnipotenţă celulară şi mecanismele de reglare adiacente.

Un aspect practic extrem de important este reprezentat de posibilitatea acestor celule vegetale nude de a-şi reface peretele celular după fuziune, de a se divide şi de a forma noi ţesuturi şi ulterior organisme autonome.

43

4.6.1. Obţinerea de protoplaşti Obţinerea şi izolarea protoplaştilor este posibilă prin prelevare de la aproape toate organele plantelor superioare, respectiv rădăcini (inclusiv nodozităţi radiculare), frunze, fructe, tuberculi, endosperm, etc. Totuşi cel mai potrivit ţesut vegetal, furnizor de protoplaşti de bună calitate (cu un grad mare de omogenitate), este parenchimul frunzelor tinere. În general, recomandabil este ca prelevarea de celule surse de protoplaşti să se facă de la ţesuturi tinere, întrucât va rezulta o bună proliferare ulterioară a ţesuturilor în cultură.

La speciile lemnoase (plop, ienupăr, măr, pin), eficienţa metodei de extragere şi izolare a protoplaştilor este foarte mare, în sensul că dintr-un gram de ţesut din frunze tinere verzi se pot obţine cca. 2 milioane de protoplaşti identici genetic.

În prezent, în laboratoarele de specialitate se practică în mod curent 2 metode principale de obţinere a celulelor vegetale nude, viitori protoplaşti:

- metoda mecanică este o metodă mai veche care constă în aplicarea tehnicii de microdisecţie a celulelor vegetale plasmolizate în vederea îndepărtării peretelui celulozo-pectic rigid. În ultima vreme, această metodă este din ce în ce mai puţin utilizată din cauza randamentului net inferior comparativ cu alte metode (număr redus de protoplaşti în timp mai scurt), precum şi datorită imposibilităţii aplicării metodei la un număr mai mare de specii;

- metoda enzimatică, în schimb, este mult mai accesibilă în urma stabilirii unor combinaţii optime de fermenţi specifici (pectinaze care disociază celulele şi celulaze care atacă peretele celular). Randamentul extrem de ridicat, precum şi accesibilitatea metodei la un număr mult mai mare de specii de plante, reprezintă avantaje de necontestat privind utilitatea acestei metode (fig.16).

Figura 16. Obţinerea de protoplaşti pe cale enzimatică şi regenerarea plantelor

(după Raicu, 1980) 4.6.2. Fuziunea protoplaştilor

44

Datorită absenţei peretelui celular, celulele vegetale nude pot fuziona între ele, proces ce reprezintă hibridarea celulară sau somatică, tehnică de înaltă performanţă ce face posibilă fuziunea între celule provenite de la organisme îndepărtate din punct de vedere taxonomic şi filogenetic.

Fuziunea poate să se desfăşoare spontan în cadrul suspensiei celulare (celule în mediu lichid) sau mediată de unele substanţe (mediatori chimici ca polietilenglicolul sau ioni de Ca++) şi pe baza încărcăturii electrice negative a protoplaştilor. Pe baza celor menţionate şi în condiţiile unui pH ridicat, protoplaştii vor intra în stare de agregare, fenomen favorabil fuziunii celulare (fig. 17).

O metodă mai perfecţionată şi mai eficientă de inducere a fuziunii celulare este cea a electrofuziunii În primă fază se aplică un câmp electric alternativ neuniform asupra suspensiei. Prin conductivitatea electrică a suspensiei se creează un efect electroforetic asupra protoplaştilor care vor migra şi se vor alinia, asemenea şiragurilor de perle, pe liniile câmpului, fenomenul purtând numele de dielectroforeză. În faza imediat următoare se aplică un puls electric de foarte mare intensitate, pe o durată extrem de scurtă de timp, fapt ce va determina ruperea membranelor celulelor aflate în contact şi va favoriza fuziunea celulară. O problemă foarte importantă în definitivarea întregului program de obţinere, în final, a plantelor hibride dorite este eficienţa selectării celulelor hibride rezultate, celule care sunt relativ puţine şi se găsesc în amestec cu celulele nefuzionate în mediul de cultură. Procedeele cele mai folosite, în acest sens, sunt cele bazate pe efectuarea de diferenţieri fenotipice şi de creştere, după care celulele fuzionate sunt selectate şi trecute în sistem de cultură în micropicătură (aşa numitele culturi doică).

Figura 17. Principalele etape ale hibridării somatice la plante (după Raicu, 1980)

45

Obţinerea, fuzionarea şi cultura celulelor hibride reprezintă operaţiuni de o foarte mare importanţă în cercetările de genetică, în general, şi pentru cele de ameliorare genetică a diferitelor specii vegetale, în special (fig. 18).

Figura 18. Diferite utilizări ale protoplaştilor (după Raicu, 1980) Marea eficienţă privind obţinerea protoplaştilor, înclusiv la specii forestiere, oferă practic posibilităţi nelimitate de înmulţire vegetativă a unor genotipuri foarte valoroase. Pe de altă parte, este posibilă obţinerea unor hibrizi celulari între organisme îndepărtate filogenetic (acestea nu se pot încrucişa sexuat) şi, nu în ultimul rând, prin hibridarea citoplasmei celor 2 celule, este valorificată din plin variabilitatea extranucleară care la reproducerea sexuată este transmisă doar uniparental. Prin fuzionarea protoplaştilor aparţinând aceleaşi specii se pot obţine exemplare cu diferite grade de ploidie, procedeu greu realizabil prin mutageneză. 4.7. Transferul de gene şi obţinerea de plante transgenice În sens strict teoretic, ingineria genetică reprezintă în esenţă introducerea unor gene sau grupe de gene străine în genomul unui anumit individ. Aceste gene, de regulă, provin de la specii îndepărtate taxonomic (chiar la regnuri diferite: microorganisme, plante, animale). Manipulările genetice s-au dezvoltat extrem de rapid în ultimele decenii, începând cu anul 1983, când s-a creat prima plantă transgenică la tutun şi crearea, în anul 1994, a primei varietăţi transgenice (cu maturitate prelungită) la tomate, varietate deja comercializată în S.U.A.

În prezent, în genomul porumbului este posibil de a se introduce fragmente de cromozom bacterian rezistente la o serie de pesticide sau insecte fitofage.

Una dintre cele mai strălucite realizări în domeniul transferurilor de gene în terapeutica umană este aceea că seturi de gene umane, izolate din celule specializate ale

46

pancreasului (insulele Langerhans), producători naturali ai insulinei, au fost introduse cu succes în genomul unor bacterii care produc apoi hormonul la scară industrială. De remarcat faptul că noul produs este extrem de eficient şi nu provoacă nici un fel de reacţii alergice, fiind foarte bine suportat de către bolnavii de diabet (fig. 19).

Foarte recent s-a dat publicităţii faptul că geneticienii au descoperit gena care provoacă metastaza, pornind de la cancerul de sân. Gena SATB1, supranumită de cercetătorii americani ca „arbitrul şef”, poate transforma rapid circa 1000 de celule, în celule canceroase. Atunci când sunt supraactivate, celulele canceroase se înmulţesc, însă când gena este neutralizată, celulele nu se mai divid şi nici nu mai migrează.

Figura 19. Schema obţinerii insulinei umane

Cercetătorii sunt de părere că SATB1 va putea constitui un punct ţintă în

dezvoltarea unor terapii eficace pentru vindecarea cancerului şi, în perspectivă, chiar apariţia pe piaţă a unor medicamente care să prevină sau să trateze metastaza în cazul cancerului de sân. În prezent este dificil să se determine cu claritate dacă celulele canceroase dintr-o tumoare pot invada ţesuturile vecine sau să circule liber prin sânge şi să formeze alte tumori în organism.

Cert este faptul că descoperirea noii gene uşurează enorm cercetările ulterioare, de acum ştiut fiind faptul că activarea unei tumori prin gena incriminată înseamnă a deschide calea spre metastază. O dificultate în plus însă în iniţierea noilor cercetări o reprezintă faptul că gena SATB1 are şi un rol pozitiv foarte important în organismul uman, respectiv acela de a activa sistemul imunitar. Cercetătorii în domeniu intenţionează să pună la punct o terapie prin care gena să fie dezactivată doar în zona tumorilor, acolo unde este hiperactivă. Cercetările făcute pe şoareci au arătat că la exemplarele în care a fost suprimată activitatea genei, numărul nodulilor metastazici era între zero şi cinci, spre deosebire de cei netrataţi, care aveau între 125 şi 160 de noduli.

Tot în S.U.A., în ultimii 20 de ani, cu precădere în domeniul agricol, s-au dezvoltat extrem de rapid aceste tehnici de mare performanţă, multe forme şi varietăţi transgenice

47

fiind deja introduse în producţia agricolă largă. În Europa, în acest domeniu, se manifestă încă o mare rezervă (chiar ostilitate din partea mişcărilor şi organizaţiilor ecologiste), inclusiv la nivel de guverne, privind acceptarea şi introducerea pe scară largă a acestor biotehnologii de vârf pentru crearea şi utilizarea de organisme modificate genetic (OMG).

4.7.1. Obţinerea pe cale biologică a ADN-ului recombinant - transferul indirect

ADN-ul recombinant (ADN hibrid) rezultă prin îmbinarea in vitro a unor fragmente de ADN ce provin de la alte specii sau sintetizate în laborator (aşa numite gene “himere”), iar noua macromoleculă de AND va avea o structură deosebită ce va conţine un mesaj genetic modificat.

I) Izolarea pasagerului Gena de interes, denumită şi pasager, este compusă din trei segmente de bază, şi

anume: - promontorul, alcătuit dintr-o secvenţă cu un număr limitat de nucleotide şi având

rolul de iniţiator dar şi în a determina expresia genei de interes; - secvenţa mediană sau codificatoare, care reprezintă parte cea mai consistentă a

pasagerului şi care trebuie mai întâi identificată, apoi izolată şi secvenţionalizată. Pentru identificarea celulelor transformate ale plantei în vederea selectării, este necesară utilizarea unor gene marquer care, pe lângă rezistenţa la antibiotice (sursă: Escherichia coli la şoarece) sau la ierbicide (surse: specii ale genului Streptomyces sau Arabidopsis thaliana), pot face posibilă şi reperarea secvenţei codificatoare

- terminatorul, compus din secvenţe (triplete de nucleotide nonsens) ce încheie lanţul structural al pasagerului.

Izolarea unei gene de interes din genomul unei specii vegetale se poate face cu ajutorul unor enzime specifice, denumite enzime de restricţie, urmând ca gena izolată să fie recunoscută şi pregătită de a fi preluată de un vector.

II) Izolarea, deschiderea şi pregătirea vectorului Sub denumirea de vector se înţelege o moleculă de ADN capabilă de autoreplicare,

de a accepta gena de interes, de a fi acceptată de nouă celulă gazdă în care să se multiplice şi să se exprime odată cu noua genă transferată.

Cel mai potrivit vector care poate îndeplini toate aceste cerinţe este un plasmid, formaţiune genetică independentă de cromozomul bacterian, capabil de autoreplicare, izolat din bacterii (Agrobacterium sp.) sau chiar din viruşi (ex. bacteriofagul λ din virusul SV-40) şi care, în majoritatea cazurilor, are formă circulară (fig. 20).

Introducerea genei de interes (pasagerul) în structura ADN-ului plasmidial se face după deschiderea prealabilă a celui din urmă într-un singur loc, cu ajutorul enzimelor de restricţie care pot fragmenta molecula în puncte de recunoaştere. Fiind vorba de acelaşi tip de enzimă de restricţie, ca în izolarea genei de interes, atunci sunt mari şanse ca să existe un mare grad de coezivitate între capetele celor două fragmente de ADN (plasmidial şi al pasagerului). Acest fenomen se datorează complementarităţii bazelor azotate ale nucleotidelor de la capete şi a punţilor de H+.

48

Figura 20. Etapele formării ADN-ului recombinant (după Popa şi Repanovici, citat de Lucău, 1998)

III) Transferul genei de interes Noua moleculă de ADN care se prefigurează îşi desăvârşeşte constituirea sub

acţiunea unei alte enzime specifice – ADN ligază ce determină formarea legăturilor covalente. Aceste legături vor asigura stabilitatea noii molecule de ADN, în acest mod, creându-se condiţii propice integrării în genomul gazdei şi manifestării expresiei genice ulterioare.

Din regiunea transformabilă şi transferabilă a plasmidului (vectorul), respectiv ADN-t, genele de interes pentru transfer (pasagerul) substituie genele proprii ale bacteriei sau virusului. Urmează procesul de eliminare a genelor de virulenţă, pornind de la fragmentul transformabil şi transferabil ADN-t. În urma acestui proces rezultă aşa numiţii vectori „dezarmaţi”, iar noua moleculă de ADN (ADN recombinat) este gata pentru a se integra în celula gazdă şi să se multiplice.

Introducerea noului material genetic se produce prin fenomenul de transformare a celulei care va căpăta aşa numita stare de „competenţă”, în urma efectuării unor tratamente cu ioni de Ca2+ şi polietilenglicol (PEG).

După transformarea celulelor receptoare, în mod obligatoriu, se fac testările prin culturi in vitro pentru a se verifica dacă transformarea a avut loc la nivelul diferitelor ţesuturi.

În general, procesele de integrare şi transformare a celulelor receptoare de echipament genetic modificat (genele modificate sunt foarte sensibile) au o eficienţă scăzută şi, de aceea, se aplică tehnica specifică de amplificare a secvenţelor de ADN (PCR- Polymerase Chain Reaction). Puterea de multiplicare este foarte mare, astfel încât, după cca. 30 cicluri de amplificare a unui segment de ADN, cuprins între 2 secvenţe considerate ca „normale” (matrice), fragmentul în cauză de ADN se poate distinge deja pe un gel

49

agarizat. Odată transgena integrată în genomul celulei gazdă, se trece la detectarea şi identificarea ARN-urilor mesager (din procesul transcripţiei) şi a proteinelor cu acţiune specifică (în cadrul procesului de translaţie).

În final, expresia genei de interes (inclusiv in situ) se realizează prin utilizarea unei gene marquer a cărei expresie se poate repera prin efectuarea unor teste complexe specifice – citoenzimologice, imunocitochimice, de fluorescenţă, etc.

Din cazuistica experimentală obţinută până în prezent, se poate concluziona că dicotiledonatele răspund mai uşor la aplicarea metodei indirecte de transfer de gene (mai ales la plop), comparativ cu monocotiledonatele sau gimnospermele care sunt mult mai recalcitrante.

4.7.2. Transferul de gene la arbori cu ajutorul plasmidelor Ti şi Ri a) Transferul de gene cu ajutorul plasmidei Ti

Poate cel mai intens utilizat vector în cadrul procesului de transfer indirect de gene la plante (inclusiv la arbori) îl reprezintă plasmida Ti (tumor inducing) de la Agrobacterium tumefaciens. Această bacterie induce tumori la plantele dicotiledonate şi numai la unele monocotiledonate, iar acest proces de infecţie are la bază de fapt un proces natural de transformare genetică, proces ce poate servi ca un model ideal în realizarea transferului de gene pe cale biologică. Responsabilitatea patogenităţii microorganismului o deţine o mică porţiune a plasmidului (aşa numitul ADN-t), constituită din numai 6 gene (cărora li se cunoaşte succesiunea dar nu şi structura exactă) şi care determină apariţia de tumori la locul unor leziuni de la nivelul coletului plantelor. Boala este specifică atacului bacterian şi este cunoscută sub numele de gală de colet (crown gall)(fig. 21). Pornind de la acest proces natural de infecţie, s-a descoperit că aceste gale pot fi cultivate şi în absenţa microorganismelor generatoare, precum şi în absenţa substanţelor de creştere. În zona ţesuturilor atacate au fost izolate şi identificate anumiţi substanţe - denumite opine - care lipsesc în celelalte ţesuturi normale ale plantei. Este cert faptul că bacteria, prin cele 6 gene specifice de la nivelul plasmidului (ADN-t), determină o deviere a metabolismul plantei gazdă, rezultând producerea în ţesutul vegetal a unei substanţe metabolizabile numai de microorganismul respectiv.

Figura 21. Gala de colet produsă de Agrobacterium tumefaciens (INRA, 1991 citat de Lucău, 1998)

50

Fragmentul din ADN-ul plasmidian, respectiv ADN-t, a fost depistat nucleul ţesuturilor tumorale ale plantei gazdă. În prezent, mecanismul transferului nu este încă pe deplin lămurit, dar este sigură posibilitatea integrării de gene străine în segmentul ADN-t al plasmidei Ti ce se vor putea transmite la celulele vegetale, concomitent cu celelalte gene din secvenţa specifică segmentului (fig. 22). b) Transferul de gene cu ajutorul plasmidei Ri Un alt vector eficient în transferul indirect de gene la plante îl constituie plasmida Ri de la bacteria Agrobacterium rhyzogenes. Având o structură similară vectorului prezentat anterior, plasmidei Ti. provoacă un proces natural de infecţie ce determină apariţia perişorilor radicelari, rezultând o proliferare excesivă a rădăcinilor la mai multe specii de dicotiledonate. Ca şi în cazul prezentat anterior, plasmidul bacteriei are o regiune ADN-t ce se poate transfera în celulele vegetale gazdă. După integrarea în genomul gazdei, segmentului ADN-t al plasmidului Ri, având încorporată şi gena de interes, se poate exprima datorită transformării genetice naturale. Ulterior, prin culturi in vitro pe celule în suspensie, se pot regenera, în final, plante transgenice ce posedă noi trăsături.

. Figura 22. Transferul de gene cu ajutorul plasmidului Ti în celula vegetală

4.7.3. Transferul direct (transfecţie)

În acest sens au fost elaborate tehnici fizice sau chimice de transfer direct al genelor pasager, din care vom menţiona doar cele mai importante.

a) Tratamentul cu polietilenglicol conduce la destabilizarea structurală a membranei celulare cu ajutorul polietilenglicolului (PEG). În urma acestei operaţii, gena de interes poate migra spre nucleu, putându-se integra în genomul gazdei. În acest mod se poate efectua transferul direct al genei pentru rezistenţă la kanamicină, genă situată pe o plasmidă de la Escherichia coli, rezultând plante rezistente la antibiotic şi care transmit

51

caracterul la descendenţii sexuaţi. Tehnica prezentată are totuşi un randament destul de scăzut, puţine gene de interes integrându-se în genomul gazdei.

b) Fuziunea protoplaştilor cu lipozomi. Lipozomii sunt microformaţiuni celulare protejate la exterior cu un strat dublu fosfolipidic, iar în interior se găseşte un mediu apos ce conţine unele molecule de interes (inclusiv ADN de transfer) pentru a fi transferate în diferite celule ţintă. Fuziunea este mediată de polietilenglicol, iar conţinutul lipozomilor se amestecă în citoplasmă. S-a reuşit regenerarea de plante transformate, însă randamentul scăzut al tehnicii nu justifică extinderea metodei la o producţie de rutină de plante transformate.

c) Electroporarea constă în aplicarea unui câmp electric, de slabă intensitate şi un timp foarte scurt, asupra unei suspensii de protoplaşti ce conţin ADN de transferat. Acţiunea câmpului se va finaliza cu producerea de pori în membrana protoplaştilor care vor primi cel puţin o copie a genei străine, integrate sau nu în genom. Exprimarea genelor pasager integrate în genomul gazdei se va realiza rapid, fapt ce oferă posibilităţi semnificative de extindere a acestei tehnici.

d) “Tunul” de particule este o tehnică ce face posibilă forţarea penetrării ADN-ului de transfer după ce, în prealabil, a fost fixat electrostatic de o particulă de tungsten sau aur. Noile particule create sunt accelerate şi, cu o foarte mare viteză, sunt proiectate în celule ţintă. În ciuda faptului că este destul de brutală, această tehnică este mult utilizată datorită randamentului crescut şi eficacităţii deosebite.

e) Microinjecţiile sunt de asemenea utilizate în transferul de ADN, însă rezultate notabile s-au înregistrat mai mult la celulele animale. În ultima perioadă s-au efectuat încercări şi la celule vegetale, cum ar fi grăunciorii de polen în curs de germinare, numai că rezultatele au fost slabe, chiar dezamăgitoare.

e) Încorporarea de organite celulare în protoplaşti. Această tehnică a atras atenţia specialiştilor, în primul rând, la transferul de cloroplaste de la o specie la alta, în scopul corectării unor sisteme fotosintetizante deficiente.

4.7.4. Strategii sens şi antisens

Prin aplicarea tehnologiilor de transfer a unor gene de interes în genomul altor specii de plante are loc integrarea genelor străine în genomul gazdă şi crearea practic a unor organisme vegetale cu structura genetică modificată, acest modalitate de transfer constituind strategia sens. De asemenea, prin tehnologia ADN-ului recombinat, se pot crea organisme deosebite, în sensul diminuării unei funcţii, respectiv o diminuare a expresiei unui caracter deja existent în genomul iniţial, ceea ce constituie strategia antisens.

Strategia antisens reprezintă, de fapt, o modulare a expresiei unei gene prin realizarea şi exprimarea unui ARN m complementar celui de bază (rezultat în urma transcripţiei iniţiale). Din punct de vedere funcţional, expresia genei iniţiale este diminuată sau chiar suprimată (genă blocată). În acest mod s-au obţinut exemplare de petunii albe (necolorate) în urma blocării genei care controlează sinteza de flavonoide cu rol în coloraţia florilor. De asemenea, printr-un procedeu asemănător, s-a reuşit reducerea cantitativă a sintezei de lignină în fibra lemnoasă , proces controlat de aşa numita genă „cad”.

Strategia sens, dimpotrivă, conduce la o supraexprimare a expresiei anumitor gene, modificate sau nu.

4.7.5. Realizări în sectorul agricol Prin intermediul bacteriei Bacillus thuringiensis din sol s-au putut produce cristale

proteice foarte toxice pentru mai multe specii de insecte fitofage, respectiv lepidoptere şi coleoptere, în stadiul larvar. Genele de transfer au fost realizate în urma modificării câtorva

52

secvenţe nucleotidice care au fost apoi amplificate şi, în consecinţă, nivelul de proteine toxice s-a mărit considerabil (cca. 100 ori). Astfel s-au obţinut varietăţi modificate genetic la specii de tutun, rapiţă, tomate, cartof şi porumb. Această nouă caracteristică, respectiv de rezistenţă crescută la insectele fitofage, are un caracter monogenic şi, în consecinţă, există un risc destul de important în ceea ce priveşte o eventuală depreciere a rezistenţei pe verticală la noile varietăţi create. Efectele nedorite ale unei astfel de situaţii sunt totuşi mult mai reduse la speciile cultivate, acestea fiind plante cu cicluri scurte de viaţă (1-2 ani) şi care permit modificarea setului genetic într-un timp relativ scurt. În schimb, la arbori, specii forestiere multianuale, posesori ai unor structuri genetice extrem de complexe şi stabile, efectele privind afectarea rezistenţei pe verticală ar fi devastatoare, întrucât este practic imposibil de a se modifica din mers setul genetic iniţial cât, mai ales, a celui modificat.

Gene modificate de origine vegetală pot acţiona, de exemplu, ca inhibitori ai sintezei unei enzime foarte importante din categoria proteazei (IP), ceea ce conduce la imposibilitatea efectuării digestiei materiilor ingerate de către insectele fitofage.

În ceea ce priveşte rezistenţa la micoze şi viroze, sunt semnalate unele rezultate notabile doar la câţiva viruşi.

Mult mai avansate şi cu rezultate mult mai importante se înregistrează cercetările privind rezistenţa la erbicide. În acest sens, sunt deja cunoscute realizările privind rezistenţa cerealelor şi a rapiţei la Round-upR şi BastaR. De notat faptul că marile firme producătoare ale acestor produse investesc masiv în realizarea de cercetări şi în acest domeniu al creării de OMG cu rezistenţe sporite.

În practica ameliorării agricole, una dintre direcţiile importante de cercetare este legată de interesul obţinerii seminţelor unor hibrizi puri (100%). În cazul speciilor dioice, acest lucru se poate realiza fără probleme deosebite, însă la speciile monoice situaţia este mai complicată. Totuşi, prin utilizarea unei gene de androsterilitate cu spectru larg, este posibilă obţinerea de hibrizi puri 100% şi la aceste forme de plante. Acest fapt s-a realizat la porumb prin utilizarea androsterilităţii (prin gena de androsterilitate) la una din liniile parentale.

Tot cu ajutorul genelor modificate s-au putut prelungi semnificativ perioadele de conservare (păstrare prelungită) a fructelor unor specii (ex. la tomate) prin inhibarea producerii de melanină. De asemenea, pe baza genelor modificate se pot modifica compoziţiile iniţiale ale unor acizi aminaţi rari şi convertirea lor în lipide speciale, sau se pot obţine compuşi cu importanţă farmaceutică, lignină sau alţi produşi de interes.

4.7.6. Realizări în silvicultură Spre deosebire de plantele cultivate, arborii sunt cu mult mai puţin „receptivi” la

aplicarea şi dezvoltarea tehnologiilor privind transferul de gene datorită complexităţii lor structural morfologice şi genetice, longevităţii şi trăsăturilor fiziologice deosebite.

După cum s-a menţionat deja, eventuala prăbuşire a rezistenţei pe verticală ca urmare a transferului şi integrarea în genomul unui arbore a unei gene modificate, cu rezistenţă crescută la o insectă fitofagă, de exemplu, ar constitui un mare handicap, cu atât mai mult cu cât o modificare a întregului set cromozomial, la nivel de populaţie, ar fi practic imposibil de realizat într-un interval de relativ scurt de timp, ca în cazul speciilor cultivate. De aceea, la speciile lemnoase orice iniţiativă privind introducerea unor astfel de tehnologii de vârf trebuie abordată cu multă chibzuinţă şi discernământ, cu mare prudenţă de la caz la caz şi numai după o temeinică documentare privind existenţa unor riscuri majore asupra destabilizării structurii ereditare de bază.

Totuşi, la unele angiosperme lemnoase (ex. la plop), cu înmulţire vegetativă facilă şi cu cicluri mai scurte de producţie (25-30 ani), s-au putut obţine, relativ uşor, varietăţi

53

modificate genetic, pornind de la câteva celule şi de la care, ulterior, prin culturi in vitro şi micropropagare, s-au edificat formaţiuni forestiere monoclonale (fig. 23).

În ceea ce priveşte obţinerea unor varietăţi cu rezistenţă crescută la unele insecticide, cercetările pe această linie nu au înregistrat deocamdată rezultate spectaculoase, dar au fost create varietăţi prin modificarea unor gene ce codifică sinteza unor toxine ale bacteriei Bacillus thuringiensis împotriva unor insecte xilofage. Principiul constă în inhibarea sintezei proteazei, enzimă foarte importantă în ceea ce priveşte digestia produşilor ingeraţi de către insectele respective.

În prezent, noi programe vizează modificarea cantitativă şi calitativă a ligninei din fibra lemnoasă, aplicând o strategie antisens care determină o subexprimare a genei codificatoare a sintezei acestui produs. În acest sens se pot utiliza tehnici directe de transfer a genelor modificate (protoplaşti sau “tunul” de particule), dar şi cele indirecte prin intermediul plasmidului de Agrobacterium sp.

Figura 23. Cultură de plopi transgenici (după Nanson, 2005) Raportul diminuat lignină/celuloză, în favoarea celui de celuloză, interesează

producătorii de hârtie. Invers, când interesul se manifestă pe linia proprietăţilor mecanice, atunci contează mai mult conţinutul în lignină. În orice caz, pentru ambele scopuri se pot obţine, de exemplu, două clone de plop, în ciuda unor inconveniente de ordin economico-financiar.

În concluzie, utilizarea transferului de gene sau combinaţii de gene modificate în vederea creării şi utilizării OMG în ecosistemele forestiere este privită, în stadiul actual al cunoştinţelor, cu rezervă şi prudenţă de către marea majoritate a specialiştilor silvicultori şi chiar cu ostilitate de către ecologişti.

4.7.7. În loc de concluzii La începutul acestui mileniu, presa a fost inundată de articole contradictorii cu

privire la utilizarea biotehnologiilor, în special cele privind transferul de gene modificate şi crearea organismelor modificate genetic – OMG, în cadrul activităţii de ameliorare a animalelor domestice şi a plantelor de cultură. Urmarea a fost declanşarea unei dispute aprinse între diverşi poli ai societăţii ce includ mişcări şi partide ecologiste, companii

54

multinaţionale, sectorul agricol şi forestier, consumatori. Pe cadrul discuţiilor sunt abordate diverse categorii de probleme ca cele legate de patrimoniul genetic, de securitate alimentară, de apărare a drepturilor consumatorilor, etc.

În domeniul culturilor agricole, marile firme (companii) multinaţionale fac uriaşe presiuni pentru a se admite pe piaţă produsele lor cele mai avansate, produse care includ şi sunt sub sigla OMG. Mai mult, firmele americane de profil nu vor ca produsele lor să fie etichetate, ceea ce îi împiedică pe consumatori (marii producători agricoli) să achiziţioneze cu aceste produse în cunoştinţă de cauză.

În contradicţie cu această poziţie, Parlamentul Europei de la Strassbourg susţine ideea ca OMG pe piaţă să nu depăşească 0,9% din totalul produselor de profil şi acestea să fie menţionate şi, prin urmare, cunoscute. Sistemul OCDE (Oficiul de Cooperare şi Dezvoltare Economică) privind certificarea materialului reproducător (inclusiv forestier) este actualmente în impas deşi este recunoscut oficial şi de către S.U.A., care însă nu renunţă la pretenţia lor. Asupra acestor ultime aspecte menţionate sunt necesare câteva clarificări.

Pentru început, trebuie menţionat faptul că marile firme (în special cele din SUA) investesc sume enorme în cercetarea procesului transferului de gene, obţinând varietăţi superperformante privind unele trăsături cu impact asupra productivităţii sau rezistenţe şi toleranţe deosebite. Prin inducerea autosterilităţii asupra seminţelor, prin tehnici specifice ingineriei genetice, aceste varietăţi nu pot fi multiplicate de către agricultorii ţărilor care le achiziţionează. Acest tip de monopol constituie un impediment serios pentru statele care utilizează acest tip de material biologic, cu atât mai mult pentru ţările în curs de dezvoltare. Legat de această problemă, firmele în cauză răspund că această autosterilitate este indusă seminţelor varietăţilor modificate genetic pentru a se evita contaminarea cu polen provenit de la populaţiile indigene (problema este cel puţin discutabilă!). Cert este faptul că, sub aspect financiar, noile varietăţi obţinute şi distribuite sunt mai degrabă în avantajul marilor firme producătoare de seminţe modificate genetic decât în avantajul consumatorului (producătorii agricoli).

În altă ordine de idei, numeroase discuţii şi chiar semne de întrebare se pot ridica asupra unor aspecte de ordin strict genetic. Astfel, genele modificate provin adesea de la unele specii total diferite de specia gazdă (prin utilizarea de intermediari aparţinând unor viruşi, bacterii sau chiar celule animale). De asemenea, căile utilizate pentru transferul de gene sunt, în unele cazuri, nesigure sau brutale (vezi tehnica utilizării “tunului” de particule). În atare situaţie nu se poate afirma cu certitudine care gene, exceptând cele ţintă, sunt aduse (importate) şi nici cum acestea se inserează în genomul gazdei. Mai mult, este foarte probabilă instalarea unui dezechilibru datorat apariţiei fenomenului de epistazie, existând în acest caz o interacţiune complexă cu genele deja existente. Acestea din urmă se pot inactiva sau, din contră, pot intra într-o stare de supraactivare.

Anumite gene (ex. la rapiţă, cele legate de rezistenţă la erbicide) pot migra foarte uşor dintr-un ecosistem agricol în altul prin hibridare în genomul unor buruieni (“ierburi rele”) care aparţin aceleaşi familii (cazul muştarului de câmp), conferindu-le şi acestora o rezistenţă sporită la erbicide. În consecinţă, este necesară aplicarea unor cantităţi mult mai mari de erbicide pentru a le controla şi pe acestea din urmă. În acest caz, este indubitabil faptul că avantajele vor de partea firmelor furnizoare de erbicide, iar dezavantajele, din păcate, vor fi de partea agricultorilor şi a mediului înconjurător. Fenomenul odată produs are efectele ireversibile datorită faptului că genele deja răspândite, cu greu mai pot fi extrase (eliminate) din populaţia respectivă.

Nu puţini susţin şi ideea că genele modificate şi, mai ales, proteinele noi care se sintetizează, în urma ingerării de către consumatori n-ar fi perfect digerate şi ar trece accidental în circuitul sanguin. În acest mod ar rezulta maladii grave, de tipul Kreutzfeld-

55

56

Iacob, ca în cazul sindromului vacii nebune, sau mai uşoare, ca alergii la noile proteine ale căror efecte de acumulare nu sunt previzibile. În domeniul forestier, cercetătorii pot crea clone cu material genetic modificat, însă cu mare dificultate şi aceste formaţiuni (de ex. la plop) au dezavantajul de a fi create în sistem monoclonal. Aceste păduri sunt extrem de fragile pentru că n-au variabilitate genetică şi, în cazul unor atacuri masive de dăunători sau boli (rugini în special), pot fi foarte uşor distruse, în proporţie de 100%. Acest fapt poate cauza adevărate catastrofe ecologice datorită controlului monogenic al rezistenţei la un anume dăunător sau parazit dar, în schimb, este complet bulversată rezistenţa verticală (pe ansamblu) a arboretului. Pe de altă parte, un program complex de ameliorare forestieră va avea în vedere ameliorarea principalelor trăsături ale arborilor, în acest sens criteriile de selecţie în silvicultură sunt cel mai adesea de ordin cantitativ (creşteri), trăsături extrinseci (forma) şi intrinseci (calitatea lemnului) sau de rezistenţă şi adaptare. Ori, după cum se cunoaşte, în majoritatea cazurilor, aceste caractere sunt supuse controlului unui număr mare de gene, iar un program de ameliorare atât de avansat, la ora actuală este practic imposibil de aplicat în silvicultură. De aceea majoritatea geneticienilor din silvicultură vor fi obligaţi să ţină cont de toate aceste aspecte şi să adopte o atitudine precaută în abordarea şi punerea în practică a diferitelor programe de ameliorare forestieră, ţinând cont de ciclurile lungi de viaţă ale arborilor şi de complexitatea structurii lor morfologice şi ereditare. În silvicultură, lipsa prudenţei în ceea ce priveşte adoptarea unor strategii raţionale şi eficiente în ameliorare poate crea un dezastru ecologic pe mari suprafeţe şi cu urmări catastrofale pentru perioade lungi de timp (zeci, chiar sute de ani). Metodele clasice utilizate în ameliorarea forestieră, precum selecţia şi hibridarea, au făcut de mult dovada eficienţei lor şi nu prezintă nici un pericol pentru integritatea unei populaţii dacă sunt practicate raţional şi eficient. În acest sens, condiţia de bază este de a se menţine permanent un grad minimum de variabilitate genetică intra şi interpopulaţională. Pe de altă parte nu trebuie, sub nici o formă, abandonate cercetările în acest domeniu de vârf al biotehnologiilor, respectiv transferul de gene modificate, crearea şi utilizarea OMG. Este necesară însă aprofundarea acestor studii şi cercetări în cadrul universităţilor şi institutelor de cercetare de renume în domeniu, studii ce vor fi axate cu precădere pe aspecte fundamentale pe termen lung legate, în primul rând, de înţelegerea mecanismelor de bază la nivel molecular. Când aceste mecanisme vor fi pe deplin elucidate şi înţelese, atunci se va putea face o evaluare corectă a raportului costuri-riscuri / beneficii, înainte ca rezultatele cercetărilor să fie implementate în ameliorarea genetică a arborilor. Deocamdată, acest raport pare a fi unul clar în defavoarea silvicultorilor.

V. PRINCIPIILE SILVICULTURII CLONALE

Multiplicarea vegetativă reprezintă indiscutabil metoda cea mai utilizată în cadrul

silviculturii clonale, fapt datorat progresului spectaculos al tehnologiilor în domeniul fiziologiei plantelor (inclusiv la speciile forestiere). Prin urmare, aceste tehnici ocupă în prezent un loc foarte important în practica ameliorării silvice, fiind practic nelipsite din multiplele programe sau etape de ameliorare la cele mai importante specii de arbori.

Înmulţirea vegetativă se bazează pe aptitudinea majorităţii speciilor de plante de a putea reconstitui un exemplar identic cu el însuşi, plecând de la un organ (tulpină, rădăcină, frunze), de la un ţesut sau chiar de la o celulă (Lucău, 1998).

5.1 Tehnici de multiplicare vegetativă

În ceea ce priveşte speciile forestiere, numai câteva se pretează la multiplicarea vegetativă de rutină (eucalipt, sequoia, molid, pin, cireş, plop, sălcie, tei). Restul speciilor de arbori dovedesc o afinitate mult mai redusă în ceea ce priveşte obţinerea facilă de butaşi, drajoni sau inoculi in vitro. Prin urmare, la acestea din urmă, costurile ridicate şi punerea cu dificultate în aplicare a acestor tehnici nu justifică efortul de iniţiere şi dezvoltare ulterioară a unor programe silviculturale în sistem clonal.

5.1.1. Altoirea

Altoirea este una din cele mai vechi metode (tehnici) horticole, succesul acesteia depinzând de specie, tipul altoaielor şi de epoca altoirii. Altoirea în cap este recomandată pentru înfiinţarea de livezi de seminţe, în vederea obţinerii unor creşteri rapide şi armonioase a plantelor, precum şi a reducerii timpului necesar de producere a seminţelor (Pinus, Picea, etc.).

În cadrul lucrărilor de ameliorare a arborilor, altoirea este intens utilizată la înfiinţarea livezilor semincere de clone.

În efectuarea lucrărilor de altoire trebuie să se ţină cont de câteva principii de bază, şi anume:

- contactul între altoi şi portaltoi trebuie să fie cât mai strâns în vederea realizării unei perfecte sudări a ţesuturilor, mai ales a cambiului ca zonă generatoare a ambelor componente;

- portaltoii trebuie să fie puieţi proveniţi din sămânţă, bine dezvoltaţi (la răşinoase, diametrul la colet să fie de 6-8 mm iar la foioase de minimum 10-12 mm), sănătoşi, să aibă creşteri active, coajă netedă şi o bună înrădăcinare;

- altoaiele se recoltează, de regulă, în perioada de repaus vegetativ (între octombrie-noiembrie şi martie-aprilie). Pentru altoirile de vară (luna august), recoltarea altoaielor se face cu maximum 2 zile înaintea lucrării. În funcţie de poziţia florilor, recoltarea altoaielor se face fie din treimea mijlocie a coroanei pentru un raport echilibrat între inflorescenţele mascule şi femele (ex. la pin) sau din oricare parte a coroanei la speciile cu flori hermafrodite (ex. la salcâm);

- confecţionarea altoaielor se face din lujeri viguroşi, în vârstă de 1-2 ani, cu o lungime de cca. 20 cm, iar după recoltare, altoaiele se leagă în mănunchiuri de câte 25-30 bucăţi cu etichetă;

- păstrarea altoaielor se va face în încăperi cu suficientă umiditate şi o temperatură care să nu le permită intrarea în vegetaţie, în situaţia de încălzire a vremii.

Altoirea în seră este mai uşoară şi mai sigură decât altoirea în aer liber, beneficiind de unele avantaje cum ar fi: adăpost faţă de condiţiile nefavorabile de mediu, un regim reglabil de intensitate luminoasă temperatură şi umiditate si poate fi practicată şi iarna. Dezavantajele constau în costurile ridicate privind investiţia, încălzirea, materialele şi, nu în ultimul rând, riscul apariţiei unor boli criptogamice. Acest tip de altoire se poate practica la răşinoase şi la unele foioase (fag).

Altoirea în aer liber, respectiv în livezile de seminţe, prezintă unele mari avantaje, în sensul că este mult mai puţin costisitoare decât altoirea în seră şi materialul biologic nu trebuie să suporte atât de multe manipulări ca în cazul precedent. Totuşi, acest tip de altoire trebuie să se execute pe timp cu suficientă umiditate atmosferică, cer înnorat, fără vânturi uscate şi calde, toate aceste condiţii la un loc fiind greu de îndeplinit pentru perioade mai lungi de timp. Anumite specii (duglas) prezintă fenomene de incompatibilitate pe o perioadă mai mare sau mai mică de timp. În acest caz, se selecţionează portaltoaie compatibile care vor produse din sămânţă sau din butaşi.

5.1.2. Marcotajul Marcotajul reprezintă metoda vegetativă prin care este provocată formarea de

rădăcini pe un ram nedetaşat (în primă fază) de arborele mamă. Dezvoltată iniţial în domenii ca horticultura, pomicultura sau horticultura, tehnica inducerii şi formării rădăcinilor pe ramuri nedetaşate iniţial s-a aplicat, treptat şi cu bune rezultate, la unele specii de arbori. Operaţii ca inelarea scoarţei şi aplicarea unor tratamente cu substanţe rizogene (mai ales cele din categoria auxinelor), precum şi crearea mediului necesar dezvoltării rădăcinilor (sub formă de muşuroaie la marcotaj în lăstar sau sub formă de manşon la marcotaj aerian), stau la baza înrădăcinării şi separarea noii plante de arborele mamă. Această tehnică este complexă şi relativ costisitoare şi, în consecinţă, se recomandă a fi aplicată drept completare sau în caz de eşec la aplicarea altor tehnici vegetative(ex. la nuc).

5.1.3. Drajonarea

Este fenomenul prin care se produc lujeri tineri pe rădăcini. Anumite specii (cireş sălbatic, tei, plopi hibrizi) au capacitatea intrinsecă de a dezvolta aceste formaţiuni specifice, rezultând adevărate buchete de drajoni, iar fiecare dintre aceştia reprezentă o clonă. Aceste formaţiuni se pot preleva fie în mănunchiuri de 50-100 bucăţi (lungime de cca. 8-10 cm) şi care se pot instala în seră, fie câte 2-3 lujeri, lungi de 20 cm şi care se pot instala în pepinieră. Important este faptul ca aceşti lujeri să fie recoltaţi de pe plante tinere, în vederea inducerii rapide şi eficiente a procesului de înrădăcinare.

5.1.4. Butăşirea

Butăşirea reprezintă probabil tehnica cea mai veche dar şi cea mai utilizată în silvicultura clonală, aceasta în scopul răspândirii materialului selecţionat şi ameliorat (molid, pin, cireş, sălcii, plopi). Butaşii de calitate se disting mai ales prin capacitatea lor deosebită de înrădăcinare, iar factorii de care depinde calitatea butaşilor sunt legaţi de vârsta arborelui mamă şi de starea fiziologică a materialului vegetal, ca factori endogeni, respectiv de condiţii de butăşire sau aplicare de tratamente – factori exogeni.

Înaintarea în vârstă conduce invariabil la o descreştere a capacităţii de înrădăcinare a butaşilor şi, implicit, la scăderea calităţii materialului. Descreşterea poate fi bruscă (ex. la nuc) sau progresivă (larice sau molid).

Poziţia lujerilor pe ramuri poate, de asemenea, influenţa direct calitatea viitorilor butaşi. Astfel, lujerii din vârful ramurilor sau cei proveniţi de la ramurile aflate la baza coroanei sunt mai tineri şi pot furniza butaşi de calitate superioară, cu un procent superior

58

de înrădăcinare. Ca anotimp, este recomandabil ca la răşinoase, recoltarea să se facă înainte de intrarea în vegetaţie, pe când la foioase chiar în plin sezon de vegetaţie, în fază activă de creştere.

Legat de factori exogeni, mediul de butăşire poate avea adesea o influenţă decisivă asupra procesului de formare şi dezvoltare a unor rădăcini de bună calitate la butaşi. Se cunoaşte faptul că la duglas, un procent mai mare de pietriş în mediul de butăşire induce formarea unor rădăcini groase, puţin ramificate şi fragile la repicaj. Dimpotrivă, utilizarea unor medii cu un conţinut mai ridicat de turbă favorizează formarea de rădăcini fine, lignificate şi ramificate, favorabile repicajului.

Există o relaţie directă între factorul termic şi umiditatea mediului de butăşire, în sensul că la o umiditate suficientă, butaşii pot înrădăcina destul de bine şi la temperaturi mai mari sau mai scăzute, însă optimul termic al mediului este cel cuprins între 21- 24oC. Între aceste limite ale temperaturii, viteza de înrădăcinare este cea mai favorizată.

În ceea ce priveşte administrarea unor substanţe active (simple sau combinaţii), pe baza cercetărilor efectuate, se poate afirma că aplicarea acestor produşi, în anumite concentraţii, combinaţii sau în anumite etape fiziologice de creştere, au o influenţă benefică pentru butaşii aparţinând majorităţii speciilor forestiere. Cele mai indicate substanţe, în acest sens, sunt cele aparţinând grupei auxinelor (AIA, ANA, AIB, etc.) ce au un efect rizogen recunoscut.

Strategii de butăşire Dezvoltarea şi aplicarea pe scară tot mai largă a acestei tehnici de înmulţire

vegetativă în pomicultură şi viticultură au creat premize favorabile stabilirii şi adoptării unor programe şi chiar strategii de butăşire şi în silvicultură.

- Multiplicarea clonală a arborilor vârstnici. Nu este indicat a se utiliza în mod direct butaşi prelevaţi de la arbori vârstnici, deoarece aceşti butaşi înrădăcinează foarte greu şi, în final, rezultă plante de calitate mediocră. În prezent, sunt puse la punct tehnici de revenire le un anumit stadiu de juvenilitate a zonei de interes la un astfel de arbore Aceste tehnici favorizează dezvoltarea mugurilor iniţiaţi de mai mulţi ani dar care au fost menţinuţi reprimaţi. În acest scop, se procedează la executarea unor tăieri severe, sau la tăierea puieţilor aproape de pământ (recepare), aceste operaţii permiţând multiplicarea vegetativă la unele specii importante de răşinoase (pin) sau foioase (stejar, nuc, frasin). De asemenea, rejuvenilizarea se mai poate realiza şi prin executarea unor altoiri repetate pe răsaduri tinere (ex. la duglas, pin, eucalipt).

În ciuda faptului că toate aceste tehnici necesită timp şi se efectuează cu costuri destul de ridicate, totuşi ele sunt dezvoltate în cadrul activităţilor specifice de înfiinţare a unor parcuri de arbori-mamă de butaşi sau chiar în anumite etape ale unor programe de ameliorare forestieră.

- Multiplicarea cu selecţie clonală în pepinieră constituie o importantă metodă pentru multiplicarea materialului juvenil şi fost aplicată, prima dată, la molidul comun, în Germania.

Este recomandabil de a se preleva un număr cât mai mare de clone (câteva mii), deoarece este greu a se depista exemplarele valoroase la vârste mai fragede. În plus, definitivarea selecţiei se realizează pe parcursul mai multor etape ale testelor clonale. Menţinerea stadiului de juvenilitate se poate realiza prin butăşire ciclică şi menţinerea clonelor sub formă de nuieliş

- Multiplicarea în vrac a provenienţelor constituie o altă variantă strategică în cadrul programelor de silvicultură clonală şi depinde de stadiul de avansare a programelor de ameliorare. Sistemul de butăşire aplicat la populaţiile semincere conduce la obţinerea rapidă de plantaţii foarte performante, permiţând totodată şi menţinerea juvenilă a parcurilor de arbori-mamă. Există posibilitatea ca, la apariţia primelor simptome de

59

maturare-îmbătrânire la butaşi, respectivele exemplare să fie înlocuite cu noi răsaduri obţinute din acelaşi lot de seminţe. Dezavantajul constă în costul ridicat al activităţii, situaţie datorită echipamentelor sofisticate necesare creşterii şi formarea plantelor, cât şi pentru realizarea butăşirii (ex. la Picea mariana) (Lucău, 1988).

5.1.5. Micropropagarea “in vitro”

Înmulţirea “in vitro” a plantelor poartă denumirea de micropropagare (micromultiplicare sau microînmulţire). Este o formă de multiplicare vegetativă şi asigură un randament net superior, în comparaţie cu alte procedee practicate, până în prezent, în horticultură şi silvicultură. Micropropagarea se face prin minibutăşire “in vitro”, atunci când plantulele din culturile primare sunt bine dezvoltate, cu rădăciniţe, tulpiniţe şi frunzuliţe bine individualizate şi viguroase. Minibutaşii rezultaţi sunt trecuţi, în condiţii aseptice, pe medii de cultură noi şi vor forma culturile secundare.

Faptul că într-un timp relativ scurt (în mai puţin de un an) se pot obţine, prin micropropagare, milioane de exemplare (copii fidele ale plantei donatoare), forme care în condiţii obişnuite s-ar obţine foarte greu sau nu ar putea supravieţui, reprezintă un câştig enorm privind eficienţa şi implicaţiile practice ale acestei metode în ameliorarea unor importante specii forestiere. De asemenea, prelevarea şi cultura “in vitro” de meristeme asigură obţinerea şi multiplicarea unui material biologic sănătos, liber de viruşi (Fărtăiş, 2002).

5.2. Utilizarea clonelor.

Sistemul de cultură a clonelor, devenit deja de rutină pentru unele specii care butăşesc uşor (ex. la plopi şi sălcii), a căpătat o nouă dimensiune prin extinderea la tot mai multe specii forestiere.

5.2.1. Modele de silvicultură clonală

Cultura clonelor la salicacee şi specii ale genului Criptomeria se practică de mai multă vreme, acestea devenind între timp modele de referinţă (modele clasice) pentru rezolvarea problemelor apar la alte specii forestiere.

Un modelul mai recent al aplicării culturii clonale, cum este cel adoptat la eucalipt, prezintă o serie de rezultate interesante şi încurajatoare prin butăşire erbacee şi a avut un succes notabil în Congo, ţară în unde s-au plantat în sistem industrial cca. 25.000 ha. Pentru reuşita acestui program, s-au adaptat pepinierele la cultura de butaşi erbacei, s-a lucrat în sistem mecanizat, iar ecartamentul plantaţiei a fost mărit de la 3m x 3m, la 4m x 4m. În acest mod, s-a înregistrat loc o creştere considerabilă a câştigului genetic în ceea ce priveşte producţia de lemn şi producţia de pastă (de 3, respectiv 5 ori).

5.2.2. Tentative noi în silvicultura clonală În unele ţări ale Europei (ex. Suedia, Franţa), molidul constituie obiectul predilect

al noilor tentative privind introducerea varietăţilor policlonale, în acest sens fiind puse la punct unele programe de multiplicare vegetativă (inclusiv in vitro). De asemenea, sunt în plină desfăşurare acţiuni vaste de instalare a unor plantaţii clonale, în sistem industrial, la Sequoia, bazat pe un program sistematizat de introducere, selecţie şi clonare, cu rotaţie la 15-18 ani. Cercetări şi experimente în acest sens s-au mai întreprins la pin, precum şi alte specii de răşinoase.

Tot acest ansamblu de tehnici şi programe circumscrise sistemului de cultură clonală permite, în final, multiplicarea în masă a descendenţilor foarte avantajoşi, evitându-se apariţia îmbătrânirii prin multiplicarea de răsaduri foarte tinere (Lucău, 1988).

60

61

Noi tentative de cultură în sistem clonal sunt aplicate şi la multe specii de foioase, la unele dintre acestea înregistrându-se succese notabile. Astfel, în ceea ce priveşte populicultura în zone hidromorfe din Franţa a fost iniţiat şi pus la punct un amplu program prin care s-au selectat exemplarele cele mai bune din cadrul populaţiilor artificiale hibride cu testare în teren. În acest fel, s-au rentabilizat şi solurile hidromorfe datorită varietăţilor adaptate la aceste condiţii, varietăţi care produc totodată şi lemn de derulaj de bună calitate. S-a adoptat, pentru mai multă siguranţă privind adaptabilitatea, sistemul culturii în parcele policlonale şi cu o densitate mai mare, respectiv de 500-600 exemplare la ha.

În ceea ce priveşte cireşul sălbatic, tot în Franţa, au fost iniţiate şi perfecţionate programe în ceea ce priveşte micropropagarea, după reîntinerire, prin drajonare. Modelul congolez privind cultura vegetativă în sistem industrial a eucaliptului a fost reluat în Franţa, unde s-au instalat cca. 25.000 de ha de parcele monoclonale, în imediata vecinătate a uzinelor de celuloză şi hârtie, cu rotaţie a culturilor de 8-10 ani şi producţie de cca. 20 t/an/ha.

5.2.3. Riscuri şi limite în silvicultura clonală

Adoptarea oricărei strategii sau program de silvicultură în sistem clonal presupune adoptarea unor măsuri prealabile necesare pentru a se evita apariţia unor riscuri majore legate mai ales de îngustarea drastică a bazei genetice în cadrul populaţiei de plecare.

Reducerea bazei genetice implică cele mai mari riscuri, deoarece populaţia în cauză îşi reduce enorm potenţialul de adaptabilitate în cadrul staţiunii respective, dovedind o tot mai mare lipsă de uniformitate în ceea ce priveşte reacţia la acţiunea diferiţilor factori nocivi biotici şi abiotici. Pe această linie, rezistenţa pe ansamblu a populaţiei diminuează vizibil, iar cele mai expuse pericolului de destabilizare a echilibrului genetic sunt parcelele monoclonale.

Pentru a se preîntâmpina apariţia acestor nedorite efecte, este necesar, ca la demararea oricărui program de ameliorare bazat pe sistem silvic clonal, să se ţină cont de unele măsuri extrem de utile în acest sens:

- alegerea celor mai bune staţiuni şi situri mecanizabile; - utilizarea numai a fazei juvenile a creşterii speciilor; - utilizarea de genotipuri cu un grad foarte mare de heterozigote, posedând gene

de la mai multe provenienţe sau specii; - asigurarea unei diversităţi genetice şi a unui număr de clone direct proporţional

cu suprafaţa plantată şi cu vârsta de exploatabilitate; - selecţia iniţială în ce priveşte rezistenţa orizontală (toleranţa poligenică la mai

multe adversităţi); - selecţia finală în ce priveşte rezistenţa verticală (la un patogen precis şi care

depinde de puţine gene); - ameliorarea genetică permanentă, prin introducerea de noi clone la fiecare

rotaţie, mai performante, mai productive şi mai rezistente; - suprafaţă totală relativ redusă (Lucău, 1998).

VI. CONSERVAREA RESURSELOR GENETICE FORESTIERE

6.1 Definiţie, generalităţi şi grupe de resurse genetice la principalele specii de arbori

Resursele genetice vegetale cuprind aproape toate formele de plante superioare (de la cele sălbatice sau primitive până la cele ameliorate), care pot aduce cea mai mare contribuţie la sporirea adaptabilităţii şi a rezistenţei la agresiunea mereu crescândă a factorilor biotici şi abiotici. Toate aceste forme de plante asigură amelioratorilor (creatori de noi soiuri, hibrizi şi varietăţi) materialul “de plecare“ necesar derulării şi realizării cu succes a unor programe complexe şi eficiente de ameliorare. Şansele realizării acestor programe cresc cu cât acest material biologic este mai diversificat, mai bine evaluat şi, cel mai important, mai bine conservat. Resursele genetice forestiere (RGF) sunt reprezentate de acele fonduri de gene (germoplasmă forestieră) care pot exprima la nivelul unei populaţii (unitate de bază în genetica populaţiilor) o diversitate genetică intraspecifică largă, însuşiri cantitative (auxologice - specifice bioacumulărilor) şi calitative deosebite şi, nu în ultimul rând, o mare capacitate de adaptare şi rezistenţă sporită la factorii abiotici şi biotici. Acest concept cuprinde asociaţii de arbori – arborete naturale şi unele artificiale, cu specii autohtone sau exotice, pe suprafeţe mai mari sau mai mici, toate reprezentând culturi forestiere de mare interes ştiinţific, economic şi practic pentru prezent, dar mai ales pentru viitor. Valoarea strategică (de perspectivă) a acestor comunităţi de arbori ce conţin fonduri de gene deosebit de valoroase nu exclude, de multe ori, valoarea practică imediată sau economică. Este cazul unor arborete din care, cu anumite limite, se recoltează periodic anumite cantităţi de seminţe.

La noi în ţară, fondul valoros de germoplasmă forestieră ocupă un loc de prim rang în ceea ce priveşte fondul strategic de perspectivă al continentului european (tab. 3).

Cele mai importante specii forestiere din ţara noastră prezintă populaţii mari de arbori, cu o structură genotipică foarte complexă, relieful carpatic armonios permiţând transformări şi readaptări continue ale tuturor populaţiilor de arbori autohtoni. Prin urmare, aceste arborete sunt deosebit de dotate sub aspectul creşterilor şi bioacumulărilor, însuşirilor calitative ale tulpinilor, coroanelor şi lemnului, capacitate ridicată de regenerare şi adaptare la diverse condiţii ecologice.

Molidul în ţara noastră aparţine varietăţii montana şi, din multe puncte de vedere, se prezintă ca o grupă destul de unitară. În mod deosebit, formele din Carpaţii Orientali se remarcă printr-o vitalitate sporită, o mare capacitate de biosinteză, lemn cu calităţi deosebite şi un mare grad de variabilitate. Capacitatea de regenerare este maximă la molidişurile din Valea Bistriţei şi Depresiunea Ciucului (Stănescu, 1998).

Tot în Carpaţii Orientali (Bucovina, Maramureş) dar şi în bazinul superior al Mureşului îşi are exclusivitatea molidul de rezonanţă, formă la care lemnul, cu inelele sale regulate şi creştere uniformă în direcţia longitudinală, posedă proprietăţi de ordin acustic excepţionale. Manifestarea acestor însuşiri ale lemnului de rezonanţă este sub control poligenic şi este puternic influenţată de anumite condiţii staţionale caracteristice acestei zone.

62

Tabelul 3 Situaţia actuală a resurselor genetice la principalele specii forestiere din ţara noastră

Denumirea ştiinţifică Denumirea populară Suprafaţă (ha) Picea abies Abies alba Fagus sylvatica Quercus petraea Quercus robur Quercus cerris Quercus frainetto Quercus pedunculiflora Tilia tomentosa Fraxinus excelsior Alnus glutinosa Populus alba Robinia pseudacacia Acer pseudoplatanus Carpinus betulus Acer campestre

molid brad fag gorun stejar cer stejar brumăriu stejar pufos tei argintiu frasin comun anin negru plop alb salcâm paltin de munte carpen jugastru

2715,9 1315,8 3268,1 1728,2 776,6 313,1 221,6 194,4 166,1 154,0 24,5 31,8 21,2 19,9

218,6 30,1

după Lalu, citat de Stănescu, V., 1998

Deşi este relativ unitar sub aspect morfologic, prezenţa anumitor obstacole ecologice a determinat totuşi şi la molidul carpatic apariţia mai multor forme şi ecotipuri de ordin climatic şi edafic, ca de exemplu molidul din zona munţilor Apuseni – rasă climatică specifică unei zone cu climă mai caldă şi umedă, molidul din zonele cu discontinuităţi de areal din Văile Jiului şi Oltului (evoluţie de natură ecologică) sau molidul cu o oarecare izolare reproductivă din depresiunile intramontane din bazinele superioare ale râurilor Mureş şi Olt, aceste regiuni fiind caracterizate de un climat rece, sărac în precipitaţii şi cu îngheţuri timpurii frecvente. De asemenea, în zona Carpaţilor de Curbură, molidul este cantonat în populaţii reprezentative aflate într-un climat bogat în precipitaţii şi cu ierni lungi.

Bradul (Abies alba Mill.) avea în zona ţării noastre un areal mult mai întins în perioada interglaciară, retrăgându-se apoi treptat, astfel că în urma ultimei glaciaţiuni să rămână cantonat în regiuni de câmpie sau cu mici şi izolate refugii carpatice (Moldova, Muntenia, Transilvania, Banat şi Oltenia)(Pop, 1932, citat de Stănescu 1998).

Din punct de vedere morfologic, comparativ cu molidul, bradul prezintă o variabilitate mult mai redusă, deosebindu-se tipuri doar sub aspectul unor caractere distincte ale conurilor, scoarţei (cu sau fără ritidom) sau ale lemnului (brad cu lemn roşu sau alb).

Sub aspectul creşterilor active, coroane bine dezvoltate şi dimensiuni excepţionale, au provenienţele de brad din Maramureş, Bucovina, acestea fiind şi cele mai reprezentative.

Ca tipuri ecoclimatice, se remarcă provenienţele de brad din Munţii Apuseni, din zona Banatului (forme relativ termofile), din bazinul superior al râului Mureş, din zona Carpaţilor de Curbură şi din vestul ţării (Stănescu 1998).

Un caz aparte în problematica identificării şi conservării surselor de germoplasmă la răşinoase îl ocupă zâmbrul (Pinus cembra), specie forestieră caracteristică limitei superioare (subalpin) a etajului forestier. Astăzi, această specie ocupă în ţara noastră zone foarte restrânse şi constituie un relict al glaciaţiunii cuaternare. Practic, îl găsim în mici grupuri (populaţii reduse şi izolate) în Munţii Călimani şi Rodnei din Carpaţii Orientali dar şi în masive din Carpaţii Meridionali (Bucegi, Retezat, Parâng, Făgăraş). Gradul destul de accentuat de

63

consangvinizare în cadrul acestor grupuri mici şi izolate de zâmbru, se caracterizează prin apariţia unui mare număr de seminţe nefertile şi o redusă putere de adaptare la introducerea în culturi în zone mai extinse. Sub acest ultim aspect, mai viguroase se prezintă numai formele de zâmbru cantonate în zona munţilor Călimani, Rodnei şi Retezat, unde specia supravieţuieşte pe arii mai extinse.

Înfiinţarea, în ultimii ani, de noi zone (arii) cu statut de rezervaţii (chiar parcuri naţionale, cum este cazul în munţii Călimani) va crea posibilitatea ca unele dintre populaţiile de zâmbru din zonă să devină surse extrem de valoroase de germoplasmă, utile şi nesesare refacerii zonei de limită superioară a pădurilor din arcul carpatic.

Fagul (Fagus sylvatica) reprezintă una dintre cele mai importante specii forestiere de la noi din ţară, ocupând unul din cele mai întinse arealuri (aproape egal cu cel al molidului). În sistem de rezervaţii de seminţe, această specie cuprinde peste 3.300 de astfel de arborete (conform datelor cartării seminologice 1976-1978) în care este prioritar sistemul de regenerare naturală (Giurgiu 1978, citat de Stănescu 1998). Acest tip de regenerare naturală “in situ” a condus la păstrarea unui fond genetic foarte puţin (chiar deloc) alterat, la acesta contribuind şi lipsa unor culturi artificiale cu surse străine de germoplasmă.

În regim de rezervaţii sunt conservate numai câteva populaţii (arborete) cu un înalt grad de reprezentativitate (cca. 5% din fondul forestier la fag) şi care trebuie exceptate de la tăieri. Dintre aceste tipuri, se detaşează în mod deosebit făgetele din zona de nord a Dobrogei, grupuri restrânse şi izolate de arbori ce trebuie să constituie obiectul unor măsuri stricte de conservare.

Stejarul pedunculat (Quercus robur) deţine la nivelul întregii ţări cca. 3800 ha arborete surse de seminţe, aceasta ca urmare a diminuării puternice a suprafeţelor arboretelor de stejar din ultimii 40-50 de ani. În aceste condiţii, arboretele rămase ar trebui încadrate de urgenţă în categoria pădurilor de protecţie (Giurgiu 1978, citat de Stănescu). Principalele rezervaţii forestiere de stejar în ţara noastră se găsesc în judeţele Mureş (Mociar), Braşov (Prejmer), Neamţ (Vânători), Buzău (Frasin), Tulcea (Letea). Masivele de stejar pedunculat încă existente în Muntenia (Comana-Piteşti-Alexandria), partea de nord a Moldovei sau în centrul Transilvaniei, impun luarea imediată a unor măsuri stricte în sensul prelungirii vârstei pentru tăieri spre limita exploatabilităţii fizice, coroborat cu instituirea unui sistem eficient de regenerare (Giurgiu 1978, citat de Stănescu 1986).

Gorunul (Quercus petraea), în momentul actual, în ţara noastră, se întâlneşte pe arii ceva mai extinse comparativ cu stejarul pedunculat, fiind catalogate peste 13.500 ha arborete surse de seminţe.

Există arborete surse de seminţe de categoria A (cu o mare precocitate), cu preponderenţă în regiunile de deal şi coline ale ţării noastre. Cele cu caracter marginal sunt reprezentate de populaţiile de gorun din zone silvostepice (Moldova de Nord) şi populaţii de altitudine (Harghita, Postăvarul, Perşani sau Munţii Dobrogei).

6.2. Importanţa studiului diversităţii biologice în perspectiva identificării,

conservării şi utilizării durabile a resurselor genetice forestiere

Fondul de gene (gene pool) reprezintă…”totalitatea genelor care există la un moment dat într-o populaţie şi care se găsesc într-un echilibru dinamic” (Dobjansky, 1951).

Genotipul este individul luat ca o unitate în care genele manifestă interacţiuni alelice şi nealelice, alelism multiplu, polialelie sau pleiotropie. Pe de altă parte, selecţia naturală, acţionând asupra fenotipurilor, tinde spre o stabilizare (homeostazie genetică), fenomen

64

cunoscut şi sub denumirea de coadaptare a genelor. Prin urmare, genele nu acţionează izolat, iar fenotipurile sunt determinate în populaţie de constelaţia de gene existentă. Homeostazia genetică nu este altceva decât o problemă de coadaptare a genelor.

Variabilitatea genetică este însă opusul homeostaziei genetice. Având ca sursă primară mutaţiile ce se acumulează de-a lungul generaţiilor şi ca sursă secundară recombinarea genetică (redistribuirea alelelor mutante într-un număr enorm de combinaţii), variabilitatea genetică se manifestă printr-un număr foarte mare de programe genetice, diferite unul de celălalt. La organismele cu reproducere asexuată, sursa unică de variabilitate genetică o reprezintă mutaţia.

Fenomenul sexualităţii şi variabilitatea genetică au o importanţă cu totul excepţională, ele reprezentând o garanţie a adaptării organismelor la condiţiile mereu schimbătoare ale mediului înconjurător.

De aceea, studiul variabilităţii genetice are o importanţă covârşitoare în situaţia când se pune problema inventarierii şi mai ales a identificării unor categorii de arborete extrem de valoroase, respectiv clase sau categorii de resurse genetice forestiere de mare valoare (cu o mare capacitate de recombinare).

Pădurile reprezintă surse regenerabile extrem de valoroase, atât ca furnizori de materii prime (lemn dar şi produse nelemnoase) cât şi pentru o serie de servicii (protecţie a mediului ambiant, conservare a biodiversităţii, odihnă şi recreere).

Din păcate, în zilele noastre, tot mai întinse suprafeţe împădurite sunt supuse unor uriaşe presiuni şi ameninţări (defrişări, poluări, calamităţi naturale, atacuri masive de boli şi dăunători). De aceea, se impune cu tot mai intensă acuitate problema luării de măsuri cât mai grabnice şi hotărâte privind protejarea şi conservarea fondului forestier existent, de plantare a noi păduri cu specii de arbori mai productive şi mai rezistente, precum şi exploatarea ecologică şi judicioasă a pădurilor.

O problemă de foarte mare importanţă pentru noul mileniu, în care abia am intrat, o constituie aceea privind stabilirea şi punerea în aplicare a unei strategii optime comune dintre economie şi ecologie, în beneficiul societăţii umane. Degradarea accentuată a mediului înconjurător la nivel planetar a constituit un subiect foarte important de dezbatere în numeroase întruniri la nivel internaţional. Fără îndoială, componenta cea mai importantă a naturii o reprezintă vegetaţia, de această componentă depinzând viaţa tuturor celorlalte vieţuitoare de pe pământ, inclusiv viaţa omului. Formele de plante sălbatice şi cele introduse în vechime în cultură, sub acţiunea permanentă a factorilor de mediu în foarte îndelungatul proces al evoluţiei, conţin în structura lor ereditară însuşiri de adaptare de mare importanţă pentru supravieţuire. Toată această biodiversitate vegetală conţine surse de gene extrem de valoroase, nu numai pentru supravieţuirea plantelor respective dar şi pentru însăşi existenţa omului. Ecosistemele forestiere trebuie să răspundă deci, la cerinţe din cele mai complexe, ele însele constituind ecosisteme foarte complexe care găzduiesc o floră şi o faună specifică. Aceste ecosisteme deţin rolul absolut majoritar în ceea ce priveşte purificarea şi păstrarea calităţii aerului, apelor şi solului. Pe baza acestor considerente, se poate lesne deduce faptul că investigarea variabilităţii genetice a speciilor forestiere şi prezervarea pe termen lung a acestei biodiversităţi reprezintă, în prezent, o problemă de mare importanţă care se ridică în faţa silviculturii mondiale.

65

6.3 Conservarea germoplasmei forestiere

Conservarea resurselor genetice forestiere constituie mijlocul cel mai eficient de a garanta disponibilitatea acestora pentru generaţiile prezente şi, mai ales, viitoare.

În această sferă este inclus un mare număr de activităţi specializate cum ar fi prospectarea, colectarea, gestiunea şi schimbul de germoplasmă. În situaţia în care nimeni nu poate prevedea necesităţile viitoare privind mediul înconjurător şi ale omului, este foarte important de a se conserva o cât mai largă variabilitate genetică în cadrul fiecărei specii. Cu cât este conservată mai multă variabilitate, cu atât există şanse mai mari de a se găsi, de către utilizatori, caracterele (trăsăturile) necesare dezvoltării unor programe eficiente de ameliorare genetică.

Resursele genetice forestiere se pot conserva în cadrul habitatului lor natural – conservare in situ – sau în afara acestuia – conservare ex situ. Ambele metode de conservare au avantaje dar şi inconveniente. De aceea, pentru o sporire a eficienţei activităţii de conservare a resurselor genetice forestiere este necesar de a se asocia metode in situ cu alte metode ex situ.

6.3.1 Conservarea “in situ” a resurselor genetice forestiere

Modalităţile de conservare in situ implică menţinerea arborilor şi plantelor, în general, în habitatul original sau în sisteme agricole tradiţionale. Conservarea in situ este metoda preferată în cazul mai multor esenţe forestiere, cu deosebire a celor din zona tropicală. Comparativ cu speciile agricole care cresc în medii destul de bine controlate, majoritatea arborilor se dezvoltă în medii “sălbatice” şi au cicluri lungi de viaţă. În consecinţă, arborii trebuie conservaţi ca parte integrantă a ecosistemului stabilit, medii în care se pot adapta şi evolua.

Cele mai importante măsuri ce pot lua pe linia unei conservări in situ sigure şi eficiente a celor mai valoroase surse de germoplasmă forestieră constau în crearea de parcuri şi rezervaţii naturale, rezervaţii semincere, interzicerea accesului total neîngrădit sau exploatare preferenţială de arbori valoroşi din punct de vedere fenotipic şi genotipic.

6.3.1.1. Crearea de parcuri şi rezervaţii naturale Această modalitate de conservare in situ reprezintă, în mod cert, acţiunea de cea mai

mare responsabilitate civică pe linia păstrării patrimoniului genetic al unor populaţii naturale deosebit de valoroase, acţiune care solicită eforturi economice şi administrative mari şi un imens volum de muncă privind documentarea, cercetarea şi evaluarea fondului de germoplasmă existent în cadrul acestor arii protejate.

La noi în ţară, Parcul Naţional Retezat, Parcul Naţional Munţii Rodnei, Parcul Naţional Călimani şi Parcul Naţional Ceahlău sunt patru dintre cele mai reprezentative arii protejate, cu caracter predominant forestier şi o anumită specificitate eco-geografică. Prin specificul şi unicitatea lor, aceste zone constituie arii deosebit de valoroase, primele două fiind incluse, încă din anul 1992, în dosarele MAB/UNESCO ca rezerve ale Biosferei (WCMC, citat de Enescu,1997).

A. Parcul Naţional Retezat, în actuala configuraţie organizatorică, are o suprafaţă de peste 38000 ha, din care suprafaţa aflată sub protecţie absolută deţine 9503 ha, restul fiind considerată zonă tampon. (fig.7).

Înfiinţat în anul 1935, în urma constituirii Comisiei pentru protecţia monumentelor naturii, sub patronajul Academiei Române şi pe baza Legii privind protecţia Naturii din România, Parcul Naţional Retezat se întindea iniţial pe o suprafaţă de 13.700 ha, extinderea

66

considerabilă fiind efectuată în ultimele două decenii prin încorporarea unei vaste zone împădurite. Aceste păduri deţin ponderea majoritară în cele trei rezervaţii ale parcului, respectiv Zlata, Piatra Iorgovanului şi Gugu – Piatra Mâţului, toate însumând peste 9000 ha.

Vegetaţia, prin distribuţia şi structurarea unităţilor taxonomice, prezintă mari variaţii în special pe orizontală, reflectând din plin marea varietate topică a zonei (rocă, expoziţie şi forme de relief). Pădurile acoperă aproape jumătate din suprafaţa parcului (48.5%), în timp ce alte formaţii sunt mai puţin reprezentative (jnepenişuri – 16,9%, pajişti alpine şi stâncării – 21,4%) (Botnariuc et al.,1984). Parcul, în general, are aspect de pădure întinsă, iar o schematizare pe verticală a zonei se poate prezenta în linii mari astfel:

- făgete pure 700 – 1250 m altitudine; - făgete de amestec cu răşinoase (brad, molid) 1250 – 1450 m altitudine; - molidişuri climax 1450 – 1650 m altitudine; - molidişuri de limită pre şi subalpine 1500 – 1780 m altitudine; - jnepenişuri 1780 – 2200 m altitudine; - vegetaţie ierboasă şi tufărişuri boreale 2150 – 2400 m altitudine. Sub limita de 700 m, în amestec cu făgetele, sunt prezente şi amestecuri de pin cu

gorun. Pădurile parcului au fost identificate ca făcând parte din următoarele formaţii vegetale:

15 făgete, 15 molidişuri, 13 amestecuri de fag cu răşinoase şi 3 păduri extrazonale (montane şi de lunci înalte), majoritatea aparţinând clasei de productivitate mijlocii (Doniţă, citat de Enescu 1997).

B. Parcul Naţional Munţii Rodnei, cu cele peste 46.000 de hectare cuprinse în suprafaţă, reprezintă una dintre cele mai mari arii protejate din ţară. Mai mult de 3.300 ha sunt declarate ca rezervaţie a biosferei, iar parcul, pe ansamblul său, adăposteşte multe specii endemice din faună şi floră, unele adevărate relicte glaciare.

Din punct de vedere teritorial-administrativ, această arie protejată se situează pe teritorii aparţinând judeţelor Maramureş, Bistriţa-Năsăud şi Suceava, în grupa de nord a Carpaţilor Orientali, din care Munţii Rodnei au cele mari cele mai mari altitudini (Vf. Pietrosul cu peste 2.300 m) şi care păstrează foarte bine urmele gheţarilor din cuaternar (circuri glaciare precum Pietrosu, Buhăescu Mare, Negoescu) (fig.24). Climatul în această zonă prezintă influenţe baltice şi, datorită marilor altitudini, este destul de aspru, temperatura medie anuală la peste 2.000 m fiind sub limita de îngheţ (-1,5oC).

În ceea ce priveşte vegetaţia forestieră, în Parcul Naţional Munţii Rodnei se pot delimita câteva formaţiuni reprezentative, ţinând cont de structura şi tectonica munţilor precum şi de evoluţia climatică specifică urmărilor glaciaţiunilor cuaternare cu platformele de eroziune ce domină relieful actual.

În partea superioară a versanţilor predomină molidişuri pure iar pe pantele inferioare sunt evidente amestecurile cu fagul, bradul, paltinul de munte, aninul alb şi mesteacănul. La limita superioară (cca. 1800 m), destul de frecvent întâlnim jnepenii (Pinus mugo) în asociaţie cu ienuperii (Juniperus communis var. nana) şi mai rar exemplare de zâmbru (Pinus cembra) ca diseminaţii dar care au atins vârste apreciabile (peste 300 ani) şi înălţimi de peste 30 m (Enescu et al.,1997).

Tufărişuri mai mult sau mai puţin compacte de jnepeni şi ienuperi au rol extrem de important în menţinerea unui echilibru natural relativ stabil în zonă, prin limitarea unor eroziuni excesive ale solului şi de atenuare a daunelor provocate de numeroasele avalanşe produse în zonă.

67

Vegetaţia, prin distribuţia şi structurarea unităţilor taxonomice, prezintă mari variaţii în special pe orizontală, reflectând din plin marea varietate topică a zonei (rocă, expoziţie şi forme de relief). Pădurile acoperă aproape jumătate din suprafaţa parcului (48.5%), în timp ce alte formaţii sunt mai puţin reprezentative (jnepenişuri – 16,9%, pajişti alpine şi stâncării – 21,4%) (Botnariuc et al.,1984).

Figura 24. Configuraţia actuală a Parcului Naţional Retezat (după MMGA,2003)

Parcul, în general, are aspect de pădure întinsă, iar o schematizare pe verticală a zonei se poate prezenta în linii mari astfel:

- făgete pure 700 – 1250 m altitudine; - făgete de amestec cu răşinoase (brad, molid) 1250 – 1450 m altitudine; - molidişuri climax 1450 – 1650 m altitudine; - molidişuri de limită pre şi subalpine 1500 – 1780 m altitudine; - jnepenişuri 1780 – 2200 m altitudine; - vegetaţie ierboasă şi tufărişuri boreale 2150 – 2400 m altitudine. Sub limita de 700 m, în amestec cu făgetele, sunt prezente şi amestecuri de pin cu

gorun. Pădurile parcului au fost identificate ca făcând parte din următoarele formaţii vegetale:

15 făgete, 15 molidişuri, 13 amestecuri de fag cu răşinoase şi 3 păduri extrazonale (montane şi de lunci înalte), majoritatea aparţinând clasei de productivitate mijlocii (Doniţă, citat de Enescu 1997).

B. Parcul Naţional Munţii Rodnei, cu cele peste 46.000 de hectare cuprinse în suprafaţă, reprezintă una dintre cele mai mari arii protejate din ţară. Mai mult de 3.300 ha sunt declarate ca rezervaţie a biosferei, iar parcul, pe ansamblul său, adăposteşte multe specii endemice din faună şi floră, unele adevărate relicte glaciare.

68

Din punct de vedere teritorial-administrativ, această arie protejată se situează pe teritorii aparţinând judeţelor Maramureş, Bistriţa-Năsăud şi Suceava, în grupa de nord a Carpaţilor Orientali, din care Munţii Rodnei au cele mari cele mai mari altitudini (Vf. Pietrosul cu peste 2.300 m) şi care păstrează foarte bine urmele gheţarilor din cuaternar (circuri glaciare precum Pietrosu, Buhăescu Mare, Negoescu) (fig. 25). Climatul în această zonă prezintă influenţe baltice şi, datorită marilor altitudini, este destul de aspru, temperatura medie anuală la peste 2.000 m fiind sub limita de îngheţ (-1,5oC).

În ceea ce priveşte vegetaţia forestieră, în Parcul Naţional Munţii Rodnei se pot delimita câteva formaţiuni reprezentative, ţinând cont de structura şi tectonica munţilor precum şi de evoluţia climatică specifică urmărilor glaciaţiunilor cuaternare cu platformele de eroziune ce domină relieful actual.

În partea superioară a versanţilor predomină molidişuri pure iar pe pantele inferioare sunt evidente amestecurile cu fagul, bradul, paltinul de munte, aninul alb şi mesteacănul. La limita superioară (cca. 1800 m), destul de frecvent întâlnim jnepenii (Pinus mugo) în asociaţie cu ienuperii (Juniperus communis var. nana) şi mai rar exemplare de zâmbru (Pinus cembra) ca diseminaţii dar care au atins vârste apreciabile (peste 300 ani) şi înălţimi de peste 30 m (Enescu et al.,1997).

Tufărişuri mai mult sau mai puţin compacte de jnepeni şi ienuperi au rol extrem de important în menţinerea unui echilibru natural relativ stabil în zonă, prin limitarea unor eroziuni excesive ale solului şi de atenuare a daunelor provocate de numeroasele avalanşe produse în zonă.

Figura 25. Configuraţia actuală a Parcului Naţional Munţii Rodnei (după MMGA,2003)

C. Parcul Naţional Călimani. Masivul Călimani, cel mai extins masiv vulcanic din

România, se situează în partea nord vestică a grupei centrale a Carpaţilor Orientali şi este

69

foarte bine conturat ca individualitate geologică prin frecvenţa deosebit de mare a rocilor eruptive şi prezenţa craterelor vechilor vulcani.

Parcul Naţional Călimani, cu cele peste 24.000 ha, ocupă aproape întreaga suprafaţă a masivului muntos Călimani, acest masiv conferindu-i şi forma actuală. (fig. 26). Din punct de vedere teritorial administrativ, această arie protejată se situează pe teritoriul a 4 judeţe, respectiv Suceava, Harghita, Mureş şi Bistriţa-Năsăud.

În cadrul zonei, cele mai reprezentative şi mai importante tipuri de pădure (arborete naturale) sunt cele de amestec de răşinoase cu fag (cu floră de mull) şi de molidişuri (cu Vaccinium myrtilis şi Oxalis acetosella).

Figura 26. Configuraţia actuală a Parcului Naţional Călimani (după MMGA,2003)

O notă aparte şi foarte caracteristică în această arie protejată o reprezintă vegetaţia lemnoasă de limită de altitudine, la peste 1700 m, constituită din arborete naturale de zâmbru (Pinus cembra) sau din amestecuri de molid, jneapăn şi zâmbru . Unele dintre aceste suprafeţe conţin ecosisteme forestiere ameninţate sau periclitate, cum ar fi complexe de rarişti cu zâmbru sau tufărişuri subalpine de jneapăn şi tufărişuri de smârdar (Rhododendron kotschyi)(Cenuşă, 2005).

70

D. Parcul Naţional Ceahlăul reprezintă una dintre cele mai importante ariile protejate ale zonei central-nordice din Carpaţii Orientali datorită bogăţiei faunei dar mai ales a vegetaţiei ierboase şi lemnoase. Frumuseţea inegalabilă a peisajelor din zona înaltă a masivului conferă o notă cu totul aparte acestei zone de o inegalabilă frumuseţe şi neasemuit pitoresc.

Situat în parte vestică a judeţului Neamţ, la poalele staţiunii Durău la nord, lacul de acumulare Izvorul Muntelui la est şi localitatea cu acelaşi nume la sud, având zona centrală stabilită ca Parc Naţional, masivul Ceahlău este format din roci sedimentare, cu gresii şi blocuri de calcar în sistem de conglomerate şi intercalaţii (MAPAM, 2003)(fig. 30).

În cadrul ecosistemelor forestiere, predomină tipurile molideto-brădet normal cu floră de mull, molideto-laricet cu Oxalis acetosella, molideto-făget cu floră de mull, brădeto-făget cu floră de mull şi amestec normal de răşinoase cu fag.

În ceea ce priveşte compoziţia pe specii lemnoase, molidul deţine 45%, fagul 28%, bradul 24%, restul de 3% fiind reprezentat de unele specii de amestec.

Figura 30. Configuraţia actuală a Parcului Naţional Ceahlău (după MMGA,2003)

Un loc cu totul aparte în cadrul vegetaţiei lemnoase din Parcul Naţional Ceahlău îl reprezintă arboretele naturale de larice – Larix decidua var. carpathica, acestea ocupând brânele (poliţe) calcaroase însorite de pe versantul sudic al masivului, la circa 1400 m altitudine. Exemplarele de zadă din aceste arborete unicat ating dimensiuni impresionante (peste 30 m înălţime şi aproape 1 m în diametru), iar formaţiunea (cca. 370 h) s-a constituit în renumitul monument al naturii Poliţa cu crini, denumirea provenind de la numele local al laricelui.

6.3.1.2. Rezervaţiile de seminţe Interesul constant manifestat de către specialiştii din silvicultură în obţinerea unor

cantităţi însemnate de seminţe ameliorate (capacitate de germinaţie de peste 60%), necesită

71

luarea unor măsuri de protejare şi conservare a arborilor remarcabili, dincolo de vârsta de exploatabilitate economică, până la vârsta de exploatabilitate fiziologică, stadiu apropiat de deperisarea fizică a arborilor. Conservarea acestor arbori deosebit de valoroşi se face în cadrul rezervaţiilor de seminţe – populaţii superioare a căror conservare în generaţia următoare se poate face prin regenerare naturală sau chiar prin crearea de plantaţii conservatoare in situ.

Rezervaţiile de seminţe sunt arborete pure sau de amestec, preponderent naturale şi care, în cadrul aceleaşi regiuni de provenienţă, se deosebesc distinct de celelalte arborete cu aceeaşi compoziţie specifică (Enescu et al, 1997). Lucrările de bază desfăşurate în aceste populaţii sunt cele de igienizare şi de curăţire, lucrări specifice selecţiei negative al criteriului valorii relative a arborilor, prin care sunt eliminaţi arborii mai slab dotaţi, cei mai buni fiind păstraţi şi îngrijiţi pentru a produce cantităţi cât mari de seminţe de calitate superioară.

Selecţia şi delimitarea principalelor arborete ca rezervaţii de seminţe la noi în ţară s-a efectuat pe baza unui sistem original de cartare seminologică de către specialişti din cadrul ICAS, în perioada 1965-1996. Desfăşurarea acestei acţiuni de mare importanţă şi de o anvergură fără precedent în ţara noastră s-a bazat pe respectarea câtorva principii clare, spre exemplu cel privind evitarea de la reproducere a arboretelor slabe ca productivitate şi cu seminţe de calitate inferioară, acordarea unei priorităţi absolute provenienţelor locale în iniţierea de experimente cu limitarea drastică a transferărilor de material biologic de reproducere şi, nu în ultimul rând, prezervarea arboretelor deosebit de valoroase până la limita longevităţii fiziologice. În urma efectuării acestei acţiuni, la noi în ţară au fost delimitate peste 2300 rezervaţii de seminţe care acoperă peste 70.000 ha (peste 32.000 ha răşinoase şi peste 37.000 ha foioase) şi care includ toate speciile principale forestiere (tabel 4).

Tabelul 4

Rezervaţiile de seminţe înscrise în catalogul naţional din 1986 Nr crt.

Specia

Suprafaţă efectivă (ha)

Suprafaţă totală (ha)

Observaţii

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.

Molid Brad

Larice Pin silvestru

Pin negru austriac Pin negru de Banat

Pin strob Zâmbru

Duglas verde Duglas brumăriu Chiparos de baltă Tuia occidentală

Fag Gorun

Cer Gârniţă

Stejar brumăriu Stejar pufos Stejar roşu american

13.849,1 8.268,6 507,3

2643,4 668,8

4,3 24,1 3,1

38,5 3,2 5,8 0,6

7980,9 13.875,4 4253,2 711,8

1395,2 673,6 19,8 25,0

16.887,9 10.830,1

966,4 3403,2 663,2 21,7 26,2 3,9

64,5 4,5 9,4 0,6

8121,2 17409,4 5194,5 880,9

1851,9 870,4 23,7 44,8

artificial şi natural artificial şi natural

artificial natural

artificial natural

artificial artificial artificial artificial natural natural natural natural natural natural

artificial artificial

72

21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29.

Stejar de baltă Tei pucios

Tei cu frunză mare Tei argintiu

Frasin Anin negru

Castan comestibil Plop alb Salcâm

27,6 383,2 148,8 708,7 820,4 74,9

155,8 21,8

594,4

54,5 396,1 171,4 841,1 887,1 78,3

197,2 32,0

598,0

natural natural natural natural natural natural natural

artificial artificial

după Enescu, 1986 şi adptat Toate aceste arborete constituie cele mai valoroase fonduri de germoplasmă forestieră

de la noi din ţară, cu bază ereditară intactă şi caracter permanent, cu cel mai mare număr de arbori plus şi care sunt excluse de la tăieri. Îndepărtarea exemplarelor de slabă calitate, prin efectuarea de răriri adecvate, conduce la realizarea unei consistenţe optime a rezervaţiei (obişnuit 0,7-0.6), consistenţă care se atinge treptat prin mai multe cicluri de selecţie. Aceste populaţii de arbori reprezintă baza populaţiilor de ameliorare, ca arbori seminceri alegându-se exemplarele din categoria arborilor “plus”, exemplare situate întotdeauna în plafonul dominant şi considerate drept adevărate „centre de gene” ale speciilor lemnoase (Stănescu, 1984).

6.3.1.3. Interzicerea accesului şi a exploatării preferenţiale a arborilor valoroşi

Aceste măsuri constituie măsuri clasice ce trebuie luate urgent şi aplicate imediat, pot avea caracter temporar sau permanent şi se aplică în vederea opririi pierderilor genetice, precum şi a evitării perturbării unor lucrări extrem de importante cum ar fi, de exemplu, răriturile sau tăierile de regenerare (Lucău, 1998).

Eficacitatea selecţiei este mult mărită prin aplicarea acestor măsuri şi, drept urmare, are loc o reinstalare progresivă a unui patrimoniu genetic valoros, perturbat iniţial prin extrageri masive, necontrolate, de arbori valoroşi. Tot pe această linie, este recomandabil a se cunoaşte, pe cât posibil, limitele eritabilităţii celor mai importante caractere (calitative şi cantitative) şi expresia câştigului genetic pe fondul lucrărilor legate de ciclurile de selecţie

Mai este de reţinut şi faptul că, spre deosebire de măsurile menţionate anterior, această metodă este mult mai uşor de aplicat, are un caracter imediat, este mult mai puţin costisitoare şi contribuie din plin la salvarea integrală a fondului de germoplasmă deţinut de rezervaţia respectivă.

6.3.2 Conservarea “ex situ” a resurselor genetice forestiere

În cadrul acestui concept sunt reunite modalităţile de conservare a fondurilor valoroase de germoplasmă forestieră în afara locului de unde provin, respectiv în afara arealului lor natural. Prin aplicarea acestei metode, de multe ori se încearcă şi se reuşeşte reproducerea la o scară redusă a unor populaţii originale ce conţin o largă variabilitate genetică intraspecifică datorată unei ample panmixii.

În cadrul acestor plantaţii grupate, producerea controlată de sămânţă este relativ uşor de realizat, aceasta facilitând producerea de puieţi în masă. Această modalitate s-a dovedit extrem de utilă la unele plantaţii de molid în afara arealului natural, exemplarele din aceste culturi dovedindu-şi din plin valoarea genetică şi adaptativă. Tot în categoria de resurse genetice forestiere valoroase conservate ex situ se includ şi unele culturi comparative de provenienţe, hibrizi sau clone cu certă semnificaţie biologică, ştiinţifică şi practică.

73

Spre deosebire de conservarea resurselor genetice forestiere in situ, conservarea ex situ preconizează abordarea mult mai multor modalităţi privind prezervarea celor mai valoroase fonduri de germoplasmă forestieră, pornind de la crearea de arboretum-uri, parcuri dendrologice, colecţii de clone sau grădini botanice şi terminând cu băncile de gene ce includ colecţii de seminţe, polen, culturi in vitro şi chiar secvenţe ADN. Majoritatea acestor activităţi constituie, în fapt, obiectul a numeroase şi complexe programe de ameliorare genetică forestieră, iar faptul că unele se bazează pe durata lungă a vieţii arborilor (arboretum-urile sau parcuri dendrologice), aceasta nu face decât să permită şi o conservare eficientă a resurselor existente, unele provenind de la populaţii naturale (aşa numitele populaţii de plecare) cu o foarte largă bază genetică.

6.3.2.1. Arboretum-urile şi parcurile dendrologice Acestea reprezintă plantaţii grupate care cuprind anumite specii, iar fiecare specie este

reprezentată de un număr limitat de indivizi. De regulă, provin dintr-o singură sursă geografică şi constituie mijlocul de bază prin care se face selecţia unor specii privind capacitatea acestora de a se adapta şi de a creşte în condiţii noi. Este foarte important ca fiecare specie să aibă la bază din cel puţin două provenienţe, cu origine cunoscută şi structură ereditară aproape intactă, iar instalarea unei reţele de subarboretum-uri mai mici, perfect adaptate ecologic în nişele respective, ar fi mult mai utilă ca în cazul creării de plantaţii mari (Bauvarel citat de Enescu, 1997). Aceste subansambluri forestiere, în care o genă rară şi valoroasă poate avea o frecvenţă mai mare decât la specie pe ansamblu, constituie, de fapt, puncte de plecare ale celei mai eficiente metode de selecţie în cadrul ameliorării arborilor, respectiv varianta selecţiei reciproce recurente. Aceasta face posibilă valorificarea efectelor combinaţiilor de gene legate de manifestarea diferitelor caractere (creşterea câştigului genetic), precum şi gruparea acestor combinaţii de gene şi asociaţii de caractere într-un genotip (individ) selecţionat.

Pe de altă parte, longevitatea vieţii exemplarelor din aceste plantaţii permite şi o conservare genetică eficientă a zestrei genetice dobândite şi totul ia alura unui proces dinamic, specific ameliorării pe termen lung, dar care, din păcate, necesită şi costuri ridicate. Cu toate acestea, arboretum-urile şi parcurile dendrologice constituie o formă extrem de eficientă şi utilă în cadrul activităţii de conservare ex situ a fondurilor valoroase de germoplasmă forestieră, iar interesul ştiinţific, didactic, cultural şi chiar estetic din partea specialiştilor şi a publicului larg, în această privinţă, se manifestă tot mai intens.

6.3.2.2. Culturile comparative de provenienţe şi hibrizi Aceste culturi au un caracter deosebit şi o semnificaţie biologică şi ştiinţifică

multilaterală şi se înfiinţează în scopul estimării influenţei geografice asupra capacităţii de creştere, asupra calităţii lemnului şi asupra rezistenţei la acţiunea nocivă a factorilor biotici şi abiotici. Pe de altă parte, aceste plantaţii permit testarea diferitelor combinaţii hibride intra şi interspecifice, comparativ cu genitorii.

Pornind de la aceste considerente, cât şi pentru faptul că sunt înfiinţate pentru un timp relativ îndelungat, aceste culturi permit conservarea unui material genetic foarte diversificat, creând totodată condiţii de conservare şi a unor provenienţe rare, pe cale de dispariţie sau chiar unicat.

6.3.2.3. Parcurile de clone Parcurile de clone sunt cultivare ce conţin genotipuri valoroase provenite din material

vegetativ, cel mai adesea butaşi (plop, salcie) sau prin altoire (răşinoase şi foioase). În cadrul acestor colecţii s-au creat numeroase varietăţi multiclonale, de mare productivitate şi cu o mare viteză de creştere.

74

Capacitatea celulei vegetale de a “reconstitui” o nouă plantă, copie fidelă din punct de vedere genetic cu planta mamă (totipotenţa celulei vegetale) a făcut posibilă includerea în cadrul acestor colecţii şi a exemplarelor multiplicate in vitro, prin micropropagare intensivă (cireş sălbatic).

Sursa principală de material biologic vegetativ o constituie arborii plus, exemplare din etajul dominant care se deosebesc de vecinii lor prin creşteri excepţionale, vigoare deosebită şi, nu în ultimul rând, prin fructificaţie abundentă şi seminţe cu capacitate de germinaţie superioară.

În ceea ce priveşte conservarea genetică, plantajele de clone deţin un fond valoros de germoplasmă prin exemplarele care le alcătuiesc şi care sunt copii vegetative, sistemul clonal păstrând intactă zestrea ereditară iniţială a populaţiei de origine.

6.3.2.4. Livezile de seminţe Livezile de seminţe (plantaţii de seminţe sau plantaje) sunt plantaţii speciale de arbori

(clone sau descendenţe selecţionate), cât mai bine izolate pentru reducerea la minimum a polenizărilor exogene nedorite, create în scopul producerii frecvente a unor cantităţi mari de seminţe de calitate superioară şi uşor de recoltat la vârste cât mai mici.

Exemplarele din aceste culturi sunt de provenienţă cunoscută, fiind identificaţi prin descendenţa lor sau prin clona de care aparţin. Chiar dacă aceşti arbori nu ating vârstele exemplarelor din cadrul arboretum-urilor sau parcurilor dendrologice, aceste formaţiuni forestiere pot îndeplini şi funcţia de conservare a unor fonduri valoroase de germoplasmă prin păstrarea unor genotipuri şi clone performante şi bine adaptate.

6.3.2.5. Băncile de gene În ultimii 25-30 ani, activitatea de identificare, colectare şi conservare a resurselor

genetice vegetale, inclusiv a celor forestiere, a cunoscut o tot mai accentuată preocupare. Din ce în ce mai multe state, organisme guvernamentale şi nonguvernamentale, instituţii şi personalităţi ştiinţifice de prestigiu, etc., se implică tot mai activ în această activitate pentru a se evita sau limita pierderile irecuperabile de material genetic extrem de valoros, pierderi catalogate de către biologul J.R. Harlan ca „genetica dezastrului”.

Crearea unei reţele de bănci de gene la nivel mondial, sub coordonarea Institutului Internaţional de Resurse Genetice Vegetale (I.P.G.R.I.) şi a Comisiei de Resurse Genetice F.A.O., constituie un uriaş succes în ceea ce priveşte asigurarea unei protecţii sigure a surselor de germoplasmă împotriva eroziunii genetice. Aceste instituţii, dotate cu echipament modern de conservare şi bază completă de date, au fost înfiinţate în scopul prospectării, colectării, evaluării şi conservării celor mai valoroase dar şi a celor mai ameninţate categorii de resurse genetice vegetale. Inaugurarea Băncii de Resurse Genetice Vegetale din Suceava, în anul 1991, se înscrie perfect pe coordonatele imperativului major de salvare şi ocrotire a ceea ce a mai rămas valoros din fondul existent de germoplasmă vegetală de la noi din ţară, prioritate de top având formele rare sau ameninţate cu dispariţia (fig. 15).

Metoda cea mai utilizată de conservare a germoplasmei vegetale într-o bancă de gene este cea de prezervare a materialului biologic sub formă de „eşantioane”, mostre de material viu, respectiv probe de seminţe cu conţinut redus de umiditate (max.6%), stocate la temperaturi scăzute (+4, -20oC).

75

Conservarea prin culturi de ţesuturi În pofida faptului că încă necesită costuri destul de ridicate, conservarea germoplasmei

forestiere, prin culturi in vitro, este o modalitate modernă de conservare, aflată în plină expansiune datorită aplicabilităţii acesteia la un număr tot mai mare de specii şi forme de arbori şi arbuşti cum ar fi unele varietăţi hibride performante dar care se reproduc foarte greu în condiţii normale, cele cu înmulţire exclusiv vegetativă sau la specii cu seminţe recalcitrante (tropicale şi temperate).

La cireşul sălbatic, spre exemplu, datorită aptitudinii sale deosebite de regenerare şi micropropagare (minibutăşire in vitro), s-au elaborat şi sunt în derulare, în Franţa, programe interesante de silvicultură clonală (Lucău, 1998).

Trebuie remarcată, în primul rând, eficienţa deosebită a acestei metode, concretizată prin faptul că dintr-un singur meristem apical caulinar (material biologic iniţial) se pot obţine, în mai puţin de 1 an, câteva milioane de copii identice din punct de vedere genetic cu planta mamă donatoare. Pe de altă parte, în lucru este introdus un ţesut aproape perfect sănătos (liber de viruşi), acest fapt oferind certe garanţii asupra calităţii materialului biologic utilizat şi multiplicat prin micropropagare.

În prezent, băncile de gene moderne, pe lângă seminţe sau fragmente de plante, conţin şi colecţii de inoculi cultivaţi in vitro.

Principiul de bază în crearea şi menţinerea unei colecţii in vitro active este acela că tot materialul biologic (plantule) rezultă dintr-un proces ciclic, ce are la bază multiplicarea culturilor, iar menţinerea întregii colecţii se face prin operarea de subculturi. Procesele vitale, în acest caz, sunt mult diminuate prin asigurarea unor condiţii de creştere lentă (temperaturi pozitive scăzute, iluminat cu intensitate redusă, reducerea la jumătate a concentraţiei componentei minerale în mediul de conservare şi adaos de inhibitori osmotici şi de creştere). Tot materialul obţinut şi conservat este testat şi controlat periodic.

Conservarea in vitro, prin menţinerea plantulelor în condiţii de creştere lentă şi operarea de subculturi la intervale cât mai lungi de timp, constituie o tehnică aplicată pe scară largă şi la unele specii de arbori şi arbuşti.

Stocarea surselor valoroase de germoplasmă prin imersarea materialului biologic (seminţe, vârfuri de creştere) în azot lichid, la –196oC, are ca rezultat stoparea completă a creşterii culturilor şi conservarea acestora pe perioade lungi şi foarte lungi de timp (zeci şi peste 100 ani) sau chiar pe termen nelimitat.

Conservarea germoplasmei forestiere prin obţinerea de embrioni somatici (proces analog embriogenezei zigotice) are la bază procesul de inducere şi diferenţiere a unei singure celule sau a unui grup restrâns de celule vegetative (axe hipocotile, cotiledoane, părţi ale inflorescenţei, ţesuturi tinere din punctele de creştere) şi formarea aşa numitelor seminţe artificiale. Astăzi este cunoscut faptul că regenerarea prin embriogeneză somatică s-a putut realiza la peste 50 de specii lemnoase, din care 20 angiosperme (ex. la stejar) şi cel puţin 30 de gimnosperme (specii ale genurilor Picea, Abies, Pinus, Larix, Pseudotsuga şi Sequoia).

Succesul acestei iniţiative în silvicultură, în ciuda costurilor ridicate, este garantat în cazul utilizării acestor metode la unele varietăţi hibride cu genotip greu de reprodus prin metode clasice, deosebit de performante şi foarte greu de obţinut pe cale naturală. Aceste genotipuri, de multe ori, se dovedesc extrem de rezistente la factorii nocivi biotici şi abiotici sau prezintă o toleranţă crescută la produşii chimici acumulaţi în sol.

Pe de altă parte, la anumite conifere (pin, molid, larice) embriogeneza somatică constituie mijlocul de bază de răspândire în masă a materialului performant rezultat din diferite programe de ameliorare genetică forestieră.

76

Conservarea polenului pe o durată limitată de timp (câteva săptămâni) nu implică luarea unor măsuri speciale de păstrare, ci important este ca să se asigure păstrarea integrităţii structurii membranare, formaţiuni care adăpostesc majoritatea sistemelor enzimatice cu rol important în declanşarea şi evoluţia ulterioară a procesului germinativ.

Păstrarea fondurilor de germoplasmă vegetală (inclusiv cea forestieră) prin stocarea ADN sau a secvenţelor de ADN (gene responsabile ale manifestării unor caractere extrem de utile în procesul de ameliorare), constituie modalitatea cea mai modernă şi, totodată, cea mai performantă în cadrul activităţii de conservare a resurselor genetice vegetale. Progresul rapid şi spectaculos înregistrat în ultimii ani, pe linia perfecţionării şi utilizării unor tehnici tot mai performante şi sofisticate ale biotehnologiei vegetale, este o realitate evidentă în prezent, dar cu un imens potenţial pentru viitor.

Tehnicile de secvenţionalizare a ADN (principalul deţinător al informaţiei genetice), bazate pe funcţionarea unor analizoare de mare fineţe şi extrem de performante precum marquerii genetici ADN (“amprente” genetice) utilizaţi în cuantificarea variabilităţii intra şi interpopulaţionale pentru conservare, reprezintă unele dintre cele mai importante tehnologii specifice celor mai moderne bănci de gene.

Caracterizarea la nivel subcelular (molecular) reprezintă o alternativă ultramodernă la evaluarea morfologică şi a caracterelor cantitative, suscitând un interes deosebit al specialiştilor prin faptul că aceşti indici, pe lângă relevanţa şi precizia privind exprimarea şi interpretarea rezultatelor investigării, sunt foarte puţin influenţaţi de factorii de mediu sau de stadiul de dezvoltare al indivizilor.

Strauss, Bousquet et all. (1992) au stabilit 2 categorii importante de marcheri moleculari: marcheri biochimici, reprezentaţi de produşii direcţi ai activităţii genelor cum sunt izoenzimele, terpenele ş.a. şi marcheri genetici moleculari ca derivaţi proprii din analiza secvenţelor polimorfice de ADN.

Marcherii biochimici Izoenzimele, definind la modul general, reprezintă acele enzime care diferă ca structură

dar catalizează aceeaşi reacţie metabolică. Aceste deosebiri de structură în cazul izoenzimelor sunt rezultatul unui polimorfism alelic. Existenţa a cel puţin două alele la nivelul locusului specific unei aloenzime, situaţie întâlnită la indivizii heterozigoţi, creează premizele apariţiei mai multor tipuri de lanţuri polipeptidice, identice însă din punct de vedere funcţional. În acest caz, aloenzimele reprezintă marcheri codominanţi.

Tehnica electroforetică în cercetarea forestieră a început să fie aplicată, pe scară largă, la sfârşitul anilor ’70, în Germania (Gőtingen), Suedia şi Statele Unite ale Americii.

Apariţia mutaţiilor la nivelul cromozomilor complică situaţia în sensul că, în cadrul sistemelor enzimatice, apar benzi duble, triple şi în cazul homozigoţilor, rezultând aşa numitele enzime hibride interloci. Prin această tehnică nu se pot evidenţia genele nule sau cele „silenţioase” din genomul multor specii forestiere, fapt ce denaturează calculul statistic privind frecvenţa genică şi proporţia exactă a heterozigoţilor într-o populaţie de arbori.

Cu toate acestea, metoda electroforetică privind studiul izoenzimelor prezintă o deosebită importanţă pentru genetica populaţională, pentru analiza structurii genotipice dar şi pentru evaluarea gradului de heterozigoţie existent intr-o populaţie naturală de arbori. De asemenea, se poate face o estimare a ratei autofecundării şi, implicit, a fluxului de gene în cadrul unei populaţii forestiere artificiale.

Terpenele. Studii privind compoziţia răşinii la conifere în monoterpene (α şi β-pinenul, mircenul, β-felandrenul,etc.), produşi cu determinism monogenic şi caracter dominant, s-au

77

efectuat în special pe specii ale genului Pinus, în Franţa şi în Statele Unite ale Americii. Pe baza studiilor privind concentraţia de monoterpene în scoarţa de Pinus elliotti, s-a putut face o diferenţiere a provenienţelor pe axa nord-sud (clinal) şi s-a elucidat modalitatea de răspândire postglaciară a speciei Pinus caribaea var. bahamensis în Florida şi introgresiunea genetică parţială cu Pinus elliotti.

Efectuarea unor astfel de analize pe diferite ecotipuri naturale de Pinus pinaster a făcut posibilă reconstituirea principalelor căi de recolonizare postglaciară a acestei specii în sud-estul Europei. Tot pe baza studiului monoterpenelor, s-a putut estima gradul de contaminare alopolenică în unele livezi de seminţe şi, de aici, posibilitatea evaluării consecinţelor acestui fenomen asupra câştigului genetic.

Marcheri genetici moleculari După 1990, la concurenţă cu analizele electroforetice ale marcherilor biochimici, s-au

dezvoltat impetuos tehnicile de utilizare a marcherilor genetici moleculari ce pătrund în intimitatea structurii macromoleculei de ADN, secvenţele fiind legate de un locus anume al materialului genetic (locus marcher).

Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR - Polymerase Chain Reaction) reprezintă tehnica de multiplicare enzimatică in vitro a unei secvenţe din macromolecula de ADN alcătuită din câteva perechi de nucleotide (oligonucleotide specifice – primeri – cu max. 20 de perechi de baze azotate). Enzima specifică acestei reacţii este ADN-polimeraza, enzimă termostabilă (+95oC) şi denumită Taq polimerază.

Reacţia implică parcurgerea câtorva etape importante: denaturarea ADN-ului, fixarea iniţiatorului (de la nivelul enzimei) şi elongaţia catenelor. Cele 2 fragmente sunt apoi replicate de foarte multe ori (milioane de copii), pe parcursul mai multor cicluri, fiecare de câte 20-50 de ori. De fiecare dată se dublează numărul copiilor de fragmente, analiza acestora urmând să fie făcută electroforetic.

Această metodă (reacţie) stă la baza tuturor celorlalte tehnici mai performante privind marcherii genetici moleculari.

Polimorfismul lungimii lanţurilor de restricţie (RFLPs – Restriction Fragment Length Polymorphism) este o tehnică extrem de performantă şi de vârf în genetica moleculară, bazată pe hidroliza (digestia) ADN cu ajutorul unei enzime specifice acestei reacţii (endonuclează de restricţie). Polimorfismul este relevat după o „hibridare” a fragmentului de ADN, deja separat electroforetic, cu o „sondă” marcată cu izotopi radioactivi şi transferarea ulterioară pe membrană (tehnica Southern).

Endonucleaza de restricţie taie fragmentul din macromolecula ADN până la o secvenţă de bază de recunoaştere (4-8 perechi de baze azotate). Sunt deja identificate câteva sute de endonucleaze, fiecare cu specificitate proprie legată de recunoaşterea secvenţei de bază. Numărul şi lungimea fragmentelor rezultate depind de numărul şi distribuţia siturilor de recunoaştere.

Comparativ cu izoenzimele, marcherii RFLP sunt cu mult mai numeroşi şi, prin aceasta, metoda deschide o arie de investigaţie mult mai largă în ceea ce priveşte analiza variabilităţii genetice în cadrul populaţiilor naturale, chiar dacă această tehnică este mai laborioasă şi mai costisitoare.

Amplificarea nedirijată de ADN polimorfic (RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA) este o tehnică ce implică utilizarea unui iniţiator (primer – oligonucleotid scurt ce include maximum 10 perechi de baze) ce poate începe amplificarea ca şi în cazul tehnicii PCR. Amplificarea fragmentelor se face la întâmplare în cadrul unui genom, în urma

78

procesului rezultând cel puţin 10 astfel de fragmente de iniţiere (aşa-numitele amprente), după care are loc separarea electroforetică pe gel de agaroză sau poliacrilamidă. În final, secvenţele rezultate în urma amplificării sunt colorate cu bromură de etidium şi pot fi analizate în câmp de radiaţii UV.

Pe baza acestei tehnici se poate estima gradul de polimorfism existent într-o populaţie, analiza populaţiei şi chiar identificarea indivizilor.

Ca şi în cazul RFLP, marcherii RAPD sunt marcheri dominanţi şi, în principiu, pot rezulta în număr nelimitat. În acest caz, însă, avantajul constă în faptul că nu se utilizează izotopi radioactivi şi nu sunt necesari iniţiatori (primeri) pentru fiecare specie. Din aceste motive, metoda utilizării marcherilor RADP este mai simplă, mai rapidă şi mai puţin costisitoare ca cea a marcherilor RFLP.

Ca dezavantaj menţionăm că această tehnică permite numai detectarea genelor dominante, nepermiţând determinarea structurii genotipice a unei populaţii, pe ansamblu (AA, Aa, aa), mai ales în ceea ce priveşte proporţia heterozigoţilor.

Microsateliţii sunt secvenţe ale macromoleculei de ADN rezultaţi în urma repetiţiei în tandem a unei secvenţe simple din întregul genom. Sunt formaţi doar din două nucleotide, sunt foarte comuni şi, totodată, polimorfici. Segmentul care încorporează microsatelitul poate fi replicat, iar lungimea acestuia se va determina electroforetic.

Microsateliţii sunt microformaţiuni de natură multialelică şi codominantă, sunt foarte numeroşi şi bine repartizaţi în genom şi au un înalt grad de polimorfism. Analiza lor poate fi uşor automatizabilă, nefiind necesară o mare cantitate de material şi nici prezenţa de izotopi radioactivi. Ca dezavantaj ar fi doar faptul că la separarea electroforetică este necesară utilizarea unui gel cu un grad mare de rezoluţie (din cauza separării unor fragmente foarte mici), ceea ce implică o mai mare atenţie în pregătirea substratului şi un cost mai ridicat al operaţiunii.

Trebuie remarcat faptul că, prin analiza microsateliţilor, s-au putut descifra genomurile şi stabili majoritatea hărţilor genetice, aceste microformaţiuni constituind marcherii predilecţi ai geneticii animale şi umane. De asemenea, pe baza analizelor microsateliţilor, s-a putut efectua studiul complet al introgresiunii genetice între 2 specii forestiere foarte importante, respectiv stejarul şi gorunul.

Principalele domenii de utilizare a marcherilor moleculari în ameliorare şi conservare genetică sunt: a) Cuantificarea diversităţii genetice Utilizarea marcherilor biochimici şi moleculari (izoenzime, produşi de metabolism sau marcheri ADN) pentru determinarea gradului de variabilitate genetică în interiorul unei populaţii sau între populaţiile de arbori constituie astăzi, în multe ţări, o prioritate în activităţile complexe de evaluare şi conservare a resurselor genetice forestiere. De menţionat, totuşi, că rezultatele acestor studii bazate pe utilizarea de marcheri genetici moleculari trebuie luate în calcul şi interpretate cu prudenţă deoarece, nu de puţine ori, s-a constatat un nivel scăzut privind corelaţia cu variabilitatea unor caractere legate de adaptabilitate, trăsături foarte importante în practica forestieră. b) Verificarea genotipurilor Marcherii moleculari sunt foarte mult utilizaţi în identificarea genotipurilor, în diferite studii taxonomice şi biologice (care includ şi tehnica „amprentelor” genetice). Este cert faptul că derularea cu succes a diferitelor programe de ameliorare şi conservare forestieră presupune existenţa unei taxonomii clare. De asemenea, prin utilizarea marcherilor biochimici (studiul terpenelor), s-au înregistrat progrese remarcabile în ceea ce priveşte studiul de dispersie a

79

80

seminţelor sau de împrăştiere a polenului, aceasta pentru dezvoltarea şi perfecţionarea metodelor de polenizare dirijată (controlată). Rezultatele diferitelor studii ce utilizează marcheri moleculari au o deosebită însemnătate practică în ceea ce priveşte reuşita unor programe de ameliorare, cu precădere în practica amenajării şi gestionării diferitelor populaţii de arbori sau livezi de seminţe (constituite din clone sau răsaduri provenite de la arbori valoroşi selecţionaţi), cultivate pentru producţii rapide şi abundente de seminţe de calitate superioară pentru reîmpăduriri. c) Hărţi genetice şi selecţia asistată de marcheri moleculari Hărţile genetice de linkage se pot folosi pentru a localiza gene răspunzătoare de manifestarea unor caractere cantitative (QTL) cu un deosebit impact economic, precum producţia de masă lemnoasă sau cantitatea de pastă. Detectarea QTL din genomul diferitelor specii forestiere presupune constituirea unor hărţi genetice bazate pe consegregarea marcherilor (zone identificate prin marcare moleculară ADN) în încrucişări controlate (în generaţia a doua prin retroîncrucişare).

Studiul de perspectivă al selecţiei asistate de marcheri moleculari la speciile forestiere presupune, în principal, construirea unei reţele de marcheri polimorfici, repartizaţi relativ uniform în cromozomi, care să se constituie în hărţi genetice.