45388454 biotehnologia de obtinere a tetraciclinelor

Upload: eugenia-ceban

Post on 03-Apr-2018

274 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    1/14

    5. BIOTEHNOLOGIA DE OBINERE A TETRACICLINELOR

    Tetraciclinele constituie una din grupele de antibiotice deosebit de apreciate din

    punct de vedere terapeutic. Primul antibiotic din aceast grup, clortetraciclina, a fostizolat din culturi de Streptomyces aureofaciens de Duggar n 1945 i introdus nterapeutic n anul 1948. Oxitetraciclina a fost izolat ceva mai trziu (Kane, Finlay,Sobin, 1949), din lichidele de fermentaie a unei tulpini de Streptomyces rimosus.Tetracilina descoperit n 1952 a fost obinut iniial prin hidrogenerarea selectiv aclortetraciclinei, iar mai trziu prin fermentaia n profunzime a microorganismuluiStreptomyces aureofaciens.

    n ultimul timp se studiaz intens tetraciclinele de semisintez caracterizateprintr-o aciune terapeutic superioar tetraciclinelor naturale. Dintre compuii introduin terapeutic se menioneaz minocilina, solvocilina i 6-metilenoxitetraciclina.

    Datorit spectrului larg de aciune, toxicitii sczute, lipsei generale afenomenelor secundare, tetraciclinele constituie antibioticele cu cea mai larg "utilizare"terapeutic, consumul lor reprezentnd 55 % din consumul total de antibiotice.

    Tetraciclinele acioneaz asupra germenilor gram-pozitivi (streptococi,pneumococi, stafilococi), gram-negativi (brucele, shigele), asupra virusurilor i asupraunor protozoare. Ele se prezint sub form de pulberi cristaline, galbene, indore,amorfe, insolubile n ap sub form de baze, solubile sub form de clorhidrai. n soluiiapoase se inactiveaz la pHsub 2 i peste 8, stabilitatea maxim fiind n intervalul de

    pHcuprins ntre 4 i 5.

    5.1.Structura i activitatea tetraciclinelor

    Structura chimic a tetraciclinelor s-a stabilit prin reacii de degradare n mediubazic, acid sau reductor. Ele conin un sistem ciclic de patru inele condensate liniar,corespunztor scheletului hidronaftacenului (s-a obinut naftacen, II, prin distilare cu

    pulbere de zinc).Dup stabilirea naturii i locului diferiilor substituieni n molecul, s-a atribuit

    tetraciclinelor de biosintez (I) urmtoarele structuri:

    R1 HO R2R3 N(CH3)2

    OHCONH2

    OOHOOH

    OH1

    2

    3

    4567

    89

    10 11 12

    4a5a

    11a10a 12a

    6a ABCD

    I

    II

    Clortetraciclina R 1 R2 R3Oxitetraciclina Cl CH3 HTetraciclina H CH3 OH6 - Demetiltetraciclina H H H6 Demetil 7 clortetraciclina Cl H H

    99

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    2/14

    Dup cum se vede, clortetraciclina conine un atom de clor n inelul Dpoziia 7,oxitetraciclina conine un hidroxil n nucleul Bpoziia 5, iar tetraciclina are o structurmai simpl, fr halogen n poziia 7 i fr hidroxil n 5.

    Tetraciclinele pot suferi unele modificri structurale fr pierderea activitii.

    Astfel, eliminarea grupelor funcionale din poziiile 5, 6, 7 nu afecteaz activitateafiziologic, iar nlocuirea grupei -OH de la C6 din tetraciclin ioxitetraciclin cu unatom de hidrogen, are repercusiuni nensemnate asupra activitii.

    Compusul cel mai simplu din seria tetraciclinelor, care mai pstreaz ncactivitatea antibacterian, este 6-desoxi-demetiltetraciclin, care nu mai conine nici ogrup funcional la atomii de carbon din poziiile 5, 6, 7. Activitatea antibacterian esteinfluenat de modificrile sterice i de poziia anumitor substituieni. Prin eliminareaoxidrilului din poziia 12 a" se obine 12 a"-desoxitetraciclina inactiv, iardeshidratarea grupei 2-carboxiamidic duce la tetraciclino-nitrili cu slab aciunefiziologic. Nitrilii reacioneaz cu morfolin, piperidin, pirolidin, aminoacizi (lizin)dnd produi solubili, cu activitate antibacterian i proprieti terapeutice apreciabile.

    5.2.Biosinteza tetraciclinelor

    Cunoaterea mecanismului de biosintez a antibioticelor din aceast grup esteuna din problemele cele mai interesante sub raport teoretic i practic deoarece permitegsirea posibilitilor de dirijare a procesului spre formarea n exclusivitate aantibioticului urmrit. Cu toate eforturile depuse, problema nu este complet elucidat.Pentru elucidarea mecanismului de biosintez a antibioticelor ciclice, muli cercettorise sprijin pe teoria acetic a lui Collie i Birch, conform creia moleculele aciduluiacetic se unesc ntre ele dup modelul cap-coad" i apoi se ciclizeaz prin condensarealdolic (Kleisen). Birch a descris schema ipotetic de formare a sistemelor ciclicesimple prin urmtorul mecanism:

    R COOH+ CH3 COOH + +CH3 COOH CH3 COOH- H2O

    R CO CH2 CO CH2 CO CH2 COOHH2

    R CO CH2 CH CH2 CO CH2 COOH

    OH

    OH

    COOH HO

    RCOR

    OH

    HO

    IIIIV V VI

    OH OH

    OH OH

    COR

    HO

    R

    Dac condenseaz un numr mai mare de uniti acetice se obin combinaii mai

    complexe. Pentru confirmarea ipotezei de mai sus, s-a introdus n mediul de cultur amicroorganismelor productoare de tetracicline acid acetic cu carbon marcat i apoi s-austudiat produsele de descompunere a oxitetraciclinei formate. Studiile efectuate cu acid

    100

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    3/14

    acetic marcat au dus la concluzia c acidul acetic este precursor n biosintezatetraciclinelor.

    Carbonul marcat din grupele metilice ale acidului acetic se regsete n moleculaoxitetraciclinei n poziiile 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10 a, 11a, 12a, iar carbonul din grupele

    carboxilice n celelalte poziii (1, 3, 4a, 5a, etc):

    R1 HO R2R3 N(CH3)2

    OH

    CONH2

    OOHOOH

    12

    34567

    8

    9

    10 11 12

    4a5a

    11a10a 12a

    6aABCD

    OH

    HH

    CH3 COOHStreptomycesaureofaciens

    Datorit faptului c radioactivitatea inelului A este mai mic, s-a emis ipotezac acest inel este format din acid glutamic i acid acetic, conform urmtoarei scheme:

    RO

    O

    C

    CH3 RO CH3

    CH2

    O

    C

    RO CH3

    O

    C

    RO CH

    O

    C

    NH2

    COOR

    CH2

    ORHC3

    O

    C

    ORHC3

    O

    C

    ORHC3

    O

    C

    ORHC3

    O

    C

    2 acetati + 2 acetati + 2 acetati + 1 acetat + 1 glutamat

    Rezultatele au artat c nici acidul glutamic nu explic scderea radioactivitiiinelului A. Recent s-a reuit a se separar cu mutante un produs numit demetil-

    policetidamida (VII), care supus apoi unor prelucrri ulterioare a condus la pretetramid(VIII) (nucleul de baz din tetracicline) i la protetron (IX):

    101

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    4/14

    O OO

    OH

    OHO

    O O O OO

    NH2

    S - enzim

    VII

    Ciclizare prin aldolizare siacilare intermolecular

    Calea normal ametabolismului

    OH

    OH OH OHOH

    CONH2

    VIII

    IX

    Ciclizare prin aldolizare siacilare intermolecular

    OH OHOH

    S - enzim

    NH2

    O O

    O + H2O, O2

    - enzim

    O OHOH

    NH2

    O O

    O

    O

    OH

    Protetron

    Din protetron (IX) se poate trece uor la pretetramid sau produi nrudii, prinurmtoarele reacii:

    O OHOH

    NH2

    O O

    O

    O

    OH HIr

    eflux

    HBrsaufenolZnpulbere

    OH

    OH OH OHOH

    CONH2

    VIII

    O OHOH

    CONH2OH

    O

    OH

    X

    XI

    Structura protetronei arat c gruparea carboxiamidic se formeaz ntr-unstadiu timpuriu i c policetidamida are structura propus mai sus.

    Calea de biosintez de la pretetramid la tetraciclin are un fundamentexperimental temeinic.

    Prepararea unui mare numr de derivai de pretetramid a permis testarea lorprivind posibilitile transformrii, prin procedee biochimice, n tetracicline. Rezultateleobinute au dus la concluzia c pretetramidele constituie intermediari n biosinteza

    102

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    5/14

    tetraciclinelor, iar gruparea carboxiamidic i grupa 6-metil este introdus n catennaintea ciclizrii nucleului naftacenic.

    Dovada principal c 6-metilarea precede ciclizarea, o constituie faptul cobinerea antibioticului 6-metilat depinde de prezena sau absena metilului n poziia 6,

    n derivaii de pretetramid. Prezena substituientului 7-clor n antibioticul obinut(clortetraciclin) prin transformarea unei pretetramide poate fi explicat fie prin folosireaunui derivat clorurat de pretetramid, fie prin folosirea unui mutant care are capacitatea,genetic determinat, de clorurare. Dac se pleac de la o pretetramid neclorurat i sefolosete un mutant de clorurare se obine clortetraciclin, fapt ce demonstreaz c

    procesul de clorurare are loc dup stadiul de formare a pretetramidei.Confirmarea faptului c intermediarii naftacenici sunt ntr-adevr implicai n

    biosintez normal a tetraciclinei, s-a obinut i prin descoperirea unei 4-hidroxi-6-metilpretetramide (XII), a crui structur a fost stabilit folosind reaciile de oxidare ireducere n diverse condiii (schema I).

    O OHOH

    CONH2

    O

    OH

    OH

    OH

    ClCH3

    N(CH3)2

    I

    S. aureofaciens

    OH OH OHOH

    CONH2

    OH

    OHCH3

    XII

    O O

    OH

    OCH3

    XV

    OH

    Rapid

    H2O2 + NaOH

    OH OH OHOH

    CONH2

    OH

    CH3

    XIII

    HJ,

    fenol

    Reflux

    H2O

    2 +NaO

    H

    NaOH

    +O2la

    cald

    Rapid

    H2O2

    +NaOH

    Len

    t

    O

    CH3OH

    COOH

    COOH

    XIV

    Schema I

    Prin reducere cu HI, la fierbere n fenol se obine 6-metilpretetramid (XIII) carese oxideaz rapid n soluie alcalin, la aer, ntr-o chinon (XV), iar aceasta la rndul eise oxideaz uor cu H2O2 n mediu alcalin la acid antro-dicarboxilic 10,10-disubstituit

    (XIV), 4-hidroxipretetramidele prezint interes prin faptul c sugereaz calea prin care

    103

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    6/14

    gruparea 4-dimetil-amino este introdus n ciclu. n continuare se red calea de trecerede la 4-hidroxipretetramid la tetracicline. (Schema II).

    OH OH OHOH

    CONH2

    OHOHCH3

    XII

    O2

    12a

    OH OH OO

    CONH2

    OHOCH3

    XVI

    Cl2

    OH

    XVIIVIII

    OH OH OO

    CONH2

    OH

    OCH3Cl

    OH

    NH3

    OH OH OO

    CH3Cl

    OH

    H NH2

    CH3J

    OH OH OO

    CH3Cl

    OH

    HNH

    CH3J

    CH3

    OH

    CONH2

    OH OH OO

    CH3Cl

    OH

    HN(CH3)2

    OH

    CONH2

    Schema II

    Prin hidroxilarea produs la C12a a 4-hidroxi-pretetramidei se obine 4-ceto-dedimetilamino-anhidro-tetraciclina (XVI), fapt ce confirm rolul ei n procesul de

    biosintez a tetraciclinelor. Aceast constatare stabilete n acelai timp c hidroxilareala C4 precede hidroxilarea la C12a a 6-metilpretetramidei i c clorurarea la C7 are locntr-un stadiu ulterior hidroxilrii la C12a.

    Din 4 ceto dedimetilamino - anhidrotetraciclin se poate ajunge latetraciclin sau la oxitetraciclin, prin urmtoarele faze: anhidrotetraciclin (XIX),anhidrooxitetraciclin (XX), dehidrotetraciclin (XXI), tetraciclin:

    104

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    7/14

    OH O OO

    CH3

    OH

    H N(CH3)2

    OH

    CONH2

    HO H

    OH OH OO

    CONH2

    OH

    OCH3

    XVI

    OHOH OH OO

    CH3

    OH

    H N(CH3)2

    OH

    CONH2

    NH3 Tetraciclin

    OxitetraciclinH2

    OH OH OO

    CH3

    OH

    H N(CH3)2

    OH

    CONH2

    O2

    XXI XX

    Toate aceste procese de metilare, aminare, oxidare, reducere sunt realizate

    enzimatic n procesul de biosintez.Pentru determinarea cantitativ a tetraciclinelor se pot folosi cu succes metodetitrimetrice, spectrofotometrice, colorimetrice, electrochimice, refractometrice icromatografice.

    5.3.Tehnologia de obinere a tetraciclinelor

    Tehnologia de fabricaie a tetraciclinelor const n fermentarea n profunzime aunor tulpini de Streptomyces aureofaciens folosind, pentru dezvoltareamicroorganismului i producerea antibioticelor, un mediu complex n a crui compoziie

    intr, n general, surse de hidrai de carbon, surse de azot (organic i anorganic), sruriminerale, microelemente (ioni metalici), stimulatori, inhibitori, antispumani.Procesul de fermentaie a actinomicetului Streptomyces aureofaciens parcurge

    trei etape.Prima etap, de cretere intens a miceliului, are loc ntre 20 i 80 - 90 de ore de

    la nsmnare. Aceast etap se caracterizeaz prin consum rapid de glucoz iasimilarea azotului.

    A doua etap, care are loc ntre 90 i 120 de ore de la nsmnare, secaracterizeaz printr-o cretere lent a masei microbiene i mprirea miceliului nfragmente. n aceast perioad cantitatea de tetraciclin acumulat n lichidul de cultureste maxim.

    A treia etap, se caracterizeaz prin creterea cantitii de azot solubil n mediui prin accelerarea uoar a formrii de NH3 care produce o cretere de pH. Apariiaacestei etape indic terminarea procesului de biosintez.

    Streptomyces aureofaciens este capabil s utilizeze zaharoza, amidonul, glucoza,fructoza i galactoza, ns nu poate utiliza maltoza, lactoza, manoza i sorbitolul.Asimilarea zahrului de ctre S. aureofaciens este reglat de raportul dintre cantitilede zahr i azot din mediu. Dac acest raport este sub valoarea optim procesul decretere respiraie i producere de antibiotic se desfoar cu viteze mici, iar n finalcantitatea de antibiotic biosintetizat este mult diminuat.

    Factorul intracelular rspunztor de trecerea de la faza de cretere intensiv iasimilarea tuturor elementelor din mediu, la faza de producere a antibioticului, se

    presupune a fi scderea acidului dezoxiribonucleic (ARN) din protoplasm.

    105

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    8/14

    Proprietile fiziologice ale miceliului se modific continuu i la aceastacontribuie i coninutul n fosfor al mediilor de cultur. Pe de alt parte, exist suficientedate care cofirm c trecerea de la faza de cretere a S. aureofaciens la faza de

    biosintez a antibioticului, este determinat n mare parte de concentraia fosforului n

    mediul de cultur. De asemenea, datele din literatur demonstreaz ca antibioticul estebiosintetizat numai de microorganismele ajunse la maturitate, iar ntre concentraiafosforului, viteza de cretere a biomasei i viteza de producere a antibioticului este ostrns corelaie (figura 5.1).

    Figura 5.1. Dependena vitezei specifice de cretere a masei celularei a vitezei de elaborare a tetraciclinelor funcie de concentraia de fosfor i durata fermentaiei:

    I - 16 g fosfor/ml; II - 130 g fosfor/ml; III - 270 g fosfor/ml; IV- 580 g fosfor/ml.

    Din figura 5.1 rezult c fosforul stimuleaz procesul de cretere a maseicelulare, dar acest efect se manifest numai pn la o concentraie a fosforului de (40 -50) 10-6 g/ml, dup care viteza de cretere a masei celulare rmne practic constant.Dac se urmrete influena concentraiei fosforului asupra vitezei de producere atetraciclinelor, se constat c la concentraii mici stimuleaz acest proces, iar la

    concentraii mari l inhib (figura 5.1, curba IV). Calculndu-se viteza de cretere amasei celulare cu ecuaia Monod i viteza de formare a tetraciclinelor Vcu ecuaiaMichaelis Menten, funcie de concentraia fosforului (substrat limitativ) s-ademonstrat c mrind coninutul de fosfor de la 10 10-6 g/ml la 45 10-6 g/ml viteza decretere a masei celulare crete de la 0,007 la 0,029 h -1, iar viteza de producere atetraciclinelor scade brusc la creterea sau micorarea concentraiei de fosfor comparativcu valoarea optim (concentraia optim este 30 10-6 g/ml).

    Este interesant de remarcat faptul c viteza maxim de producere atetraciclinelor se obine n culturile care au viteza de cretere a biomasei de 0,02 - 0,03h-1 (figura 5.2), ceea ce corespunde unei viteze de 3 ori mai mici fa de viteza maximde cretere a masei celulare (tabelul 5.1).

    106

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    9/14

    Figura 5.2. Dependena dintre viteza de cretere a masei celulare iviteza de elaborare a tetraciclinelor:

    a - influena concentraiei fosforului; b - corelaia dintre viteza de cretere

    a masei celulare i viteza de elaborarea produsului

    Tabelul 5.1. Vitezele specifice de cretere a biomasei i de acumulare a tetraciclinelor funcie deconcentraia de fosfor n culturile de Act. Aureofaciens

    IndiciCondiii optime

    pentru creterea biomasei pentru biosinteza tetraciclinelor

    Glucoza (mg/ml)Azot amoniacal (mg/ml)

    Fosfor (mg/ml)

    11,4; 20,20,87; 0,87

    65; 70

    11,0; 16,8; 11,0; 16,80,46; 0,46; 0,68; 0,68

    25; 28; 30; 27Viteza specific de cretere, h-1

    Viteza specific de acumulare a

    tetraciclinelor (g/mg/h)

    0,079; 0,0700,40; 0,42

    0,024; 0,023; 0,021; 0,0294,80; 4,50; 4,42; 4,22

    Prin urmare, procesul de biosintez a tetraciclinelor trebuie condus la viteze micide cretere a masei celulare, iar aceste viteze se regleaz prin meninerea concentraieide fosfor la valoarea de (25 - 30) 10-6 g/ml.

    Asupra vitezei de cretere a masei celulare i de producere a tetraciclinelorinflueneaz foarte mult i valoarea pH-ului. Pentru orice sistem de fermentaie atetraciclinelor influenapK-uluipoate fi descris prin una din ecuaiile:

    = max - 221 HSHSS

    HS

    CCKCCK

    CC

    ++

    (5.1)

    = max =S

    H

    H

    S

    S

    CK

    C

    C

    KK

    C

    +

    ++

    2

    11(5.2)

    = max =

    +++

    ++

    4

    3

    2

    1 11K

    C

    C

    KC

    K

    C

    C

    KK

    C

    H

    H

    SH

    H

    S

    S

    (5.3)

    = max =

    HOH

    OH

    HH

    H

    SS

    S

    CK

    K

    CK

    K

    CK

    C

    1+

    +

    + (5.4)

    107

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    10/14

    = max =2

    11

    2

    1 +

    +

    +

    ++ OH

    OH

    HH

    H

    SH

    H

    S

    S

    K

    K

    CK

    K

    CK

    C

    C

    KK

    C

    (5.5)

    n care:K1, K2, K3, K4, KH, KOH sunt constante.Alegerea modelului matematic, care descrie cel mai corect influena pH-ului

    asupra vitezei de cretere a biomasei i de elaborare a tetraciclinelor, se face princorelare cu datele experimentale.

    Figura 5.3. Dependena intensitii respiraiei v, l CO2/ml i pH-uluifuncie de concentraia glucozei n biosinteza tetraciclinelor :

    a - 2 mg/ml; 6 - 23 mg/ml; c - 45 mg/ml

    Figura 5.4. Variaia vitezei de cretere a biomasei i de acumulare a tetraciclinelor funcie de pH:

    a - conform ecuaiei (5.6); b - conform ecuaiei (5.7).

    Pentru cazul n care substratul limitativ este glucoza, aceast influen estedescris cel mai fidel de ecuaia (5.4).Prin determinarea concentraiei optime a substratului (figura 5.3) i a

    constantelor KH i KOH i introducerea n ecuaia (5.4) se obin expresiile de calcul avitezei de cretere a biomsei i a vitezei de formare a produsului:

    = max HH

    C

    C 1106,16

    106,16

    1064,5

    1064,5

    6

    6

    6

    6

    +

    +

    (5.6)

    108

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    11/14

    v = V

    H

    H

    C

    C 1101,6

    101,6

    106,10

    106,10

    6

    6

    6

    6

    +

    +

    (5.7)

    unde: max= 1,26 h-1 i V= 1,16 UI/mg miceliu/h.Reprezentarea ecuaiilor (5.6) i (5.7) demonstreaz c datele experimentale se

    nscriu pe curbele teoretice (figura 5.4), iar valorile optime ale pH-ulipentru cretereabiomasei i producerea antibioticului snt cuprinse ntre 6 i 6,7.

    Necesarul de azot pentru Streptomyces aureofaciens este furnizat de substaneleminerale i compuii organici cu azot; se utilizeaz sruri de amoniu, nitrai i substaneorganice bogate n aminoacizi. De asemenea, n procesul de biosintez se folosescstimulatori de biosintez, ca de exemplu rodanura de benzil, care stimuleaz procesul de

    biosintez a clortetraciclinei (aureomicinei). Rodanura de benzil mrete randamentul nclortetraciclin i tetraciclin la tulpinile de nalt productivitate cu 50%. Efectul acestui

    stimulator este remarcabil n faza I de cultivare i se caracterizeaz printr-un grad mritde utilizare a fosfatului i o intensificare a respiraiei. Efectul stimulator al rodanuriieste mai pronunat la medii cu coninut mai ridicat n fosfat, unde metabolismulzahrului progreseaz rapid i este evident numai dac se adaug la nceputul

    procesului. Prin urmare, rodanura de benzil nu afecteaz direct viteza reaciilorenzimatice n cursul ciclului de fermentaie, dar produce o anumit modificaremetabolic n cursul primelor ore de cultivare.

    De asemenea, s-a constatat c ionii de clor sunt aceia care dirijeaz i stimuleazproducerea de clortetraciclin; dac se urmrete obinerea tetraciclinei trebuie evitatprezena clorului. Pentru acesta ori se purific mediul de clor, dar metoda este foartescump, ori se folosete un mediu adecvat, ca de exemplu extract de graminee,

    obinndu-se pn la 92% tetraciclin, ori se utilizeaz mutani ce blocheaz clorurarea(inhibitori de clorurare).O metod mai comod este efectuarea fermentaiei pe medii obinuite dar

    folosind substane care inhib clorurarea biochimic, ca de exemplu bromurile, iodurilei unii compui cu sulf.

    Parametrii optimi ai procesului de fermentaie a tetraciclinelor sunt: temperatura271C, pH 6,5 - 6,8, viteza de agitare 110 - 120 rot/min, aeraie 0,6 - 0,8 l aer/lmediu/minut, presiunea n fermentator 1,2 - 1,3 ata.

    Din dinamica procesului de fermentaie, prezentat n figura 5.5, rezult cdurata procesului de biosintez este de 125 - 130 de ore i coincide cu epuizareacomponentelor mediului de cultur.

    Dup terminarea procesului de fermentaie mediul se aciduleaz cu acid sulfuricpn la pH 1,5 - 2, se filtreaz pe filtru pres, iar din lichidul obinut se separtetraciclinele.

    Pentru separarea tetraciclinelor au fost ncercate metode cromatografice,extracia lichid-lichid i extracia cu solveni organici dintr-un complex al tetraciclineicu acizi sau baze. Dintre metodele studiate, ultima este aplicabil pe scar industrial,deoarece ofer randamente bune.

    109

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    12/14

    Figura 5.5. Dinamica procesului de fermentaie a tetraciclinelor

    Pentru complexarea tetraciclinei se folosesc curent acizi organici,hexametafosfat, uree i amoniac.

    Complexul format, fiind insolubil n ap, se filtreaz pe filtru pres i seprelucreaz n vederea obinerii tetraciclinelor pure. Pentru aceasta complexul setrateaz cu acid pn lapH1,5 - 1,9, pentru solubilizare, dup care se trateaz cu o baz

    pn lapH4 - 4,2 cnd precipit tetraciclin brut. Aceasta se filtreaz, se usuc i apoise supune extraciei cu un amestec de acetat de butil-metanol (10:1). Din soluia deacetat de butil filtrat n prealabil de impuriti, tetraciclina se separ prin adugare deap desalinat n proporie de 30 - 40% fa de volumul extractului. Tetraciclinacristalizat se filtreaz, se spal pe filtru cu clorur de metilen i se usuc la 40 - 45C.Randamentul de obinere a tetraciclinei pure din complex este de 75 - 80%.

    5.4.Derivai ai tetraciclinei

    Administrarea tetraciclinelor numai pe cale oral nu a permis atingerea unorconcentraii terapeutice n timp util, iar un tratament ndelungat cu tetraciclin duce latulburri gastrice, colite, urticare, eritreme etc.

    Clorhidraii i srurile de tetraciclin au o slab toleran general i local

    deoarece sunt insolubile la pH-ul esutului, conducnd la depuneri care provoacleziuni. De aceea, se urmrete obinerea unor derivai de tetracicline solubile la pH-ulfiziologic, cu toxicitate redus i spectru asemntor tetraciclinelor i care pot fiutilizate sub form injectabil fr efecte secundare.

    O prim clas de compui o constituie complecii metalici cu Ca, Zn, Th:

    110

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    13/14

    R1 R2OH CH3 N(CH3)2

    CONH2

    O OOO

    OH

    ThTh

    OO O O

    H H H HH H H H

    XXII

    Complexul metal-tetraciclin se caracterizeaz prin solubilitate bun, aciune

    apropiat tectraciclinei i o mare stabilitate.n ultimul timp au aprut noi compui de tetraciclin, obinui, fie prin

    semisintez, fie prin substituii la gruparea 2-carboxiamidic, fie prin substituie nnucleul aromat.

    Cei mai importani derivai de tetracicline care substituie la grupareacarboxamid sunt: piridonometiltetraciclina (XXIII), denumit i reverin sau solvocilin,

    N-hidroxietil-piperazino-tetraciclin (XXIV) i l-lizinometil-tetraciclin (XXV):

    OH

    O

    N(CH3)2

    CONH

    OH

    CH2 N

    CH2

    CH2

    CH2

    CH2

    XXIII

    OH

    O

    N(CH3)2

    CO

    OH

    CH2

    N

    CH2

    CH2

    CH2

    CH2

    XXIV

    NH

    N

    CH2 CH2OH

    OH

    O

    N(CH3)2

    CO

    OH

    CH2 N

    (CH2)4

    NH

    NH2

    COONaXXV

    Toi aceti produi se obin prin reacia de amino-metilare (reacia Mannich) atetraciclinelor cu amine corespunztoare. Reacia se efectueaz de obicei n condiiicunoscute i anume: se solv tetraciclina ntr-un solvent potrivit (de preferin alcool

    alifatic inferior) i se trateaz stoechiometric cu amin secundar i cu aldehid formic:

    111

  • 7/28/2019 45388454 Biotehnologia de Obtinere a Tetraciclinelor

    14/14

    NHR1

    R2

    + Tetraciclin + CH2 O OH

    O

    N(CH3)2

    CO

    OH

    CH2

    N

    NH

    R1

    R2

    Dac n locul aldehidei formice se utilizeaz alte aldehide se obin derivai cugruparea:

    CO CHNH N

    R3

    R1

    R2

    nlocuirea grupei CH3 de la C6 cu H duce la o simplificare a moleculei cupstrarea activitii antibacteriene i la o cretere a stabilitii la acizi i baze, iarprodusul obinut este denumit 6-demetiltetraciclin:

    R1 R2OH N(CH3)2

    CONH2

    OH OOOH

    OH

    XXVI

    6-Demetiltetraciclina (XXVI) se obine prin fermentaie n profunzime ncondiii speciale, utiliznd mutani care au mecanismul de metilare blocat, sauintroducnd n mediul de cultur inhibitori de metilare cum ar fi: etionina, sulf-oxidulde metionin, metil-metionina, etc.

    Izolarea i purificarea 6-demetiltetraciclinei se face prin procedeele obinuite deseparare i purificare a tetraciclinelor.

    nlocuirea grupei OH de la C6 cu H, are ca efect simplificarea moleculei, fr o

    diminuare apreciabil a activitii antibacteriene.6-deoxitetraciclina se obine prin hidrogenarea catalitic a clorhidratului detetraciclin n mediu de dimetilformamid-ap (1:1), utiliznd drept catalizator paladiudepus pe crbune.

    Din masa de reacie se separ 6-deoxitetraciclina cu = 6% i 6-deoxi-6-demetiltetraciclina cu = 21%. 6-deoxi-6-demetil-tetraciclina este cel mai simplucompus din clasa tetraciclinelor care are activitate biologic.

    112