1

PREPARATE MICROSCOPICE Preparatele microscopice se pot efectua direct din produsul patologic sau din culturi bacteriene dezvoltate pe medii de cultur. Aceste preparate sunt: 1- preparatul nativ; 2 frotiul.

PREPARATUL NATIV Preparatul nativ este un preparat proaspt, umed, necolorat, cu microorganisme vii (este infecios). - se prepar extemporaneu (n momentul examinrii) i se examineaz direct ntre lam i lamela; - ofer informaii orientative asupra prezenei, formei, dar mai ales despre mobilitatea bacteriilor dintr-o cultur bacteriene (obinut pe un mediu de cultur solid sau lichid) sau dintr-un produs patologic (de exemplu materii fecale, exudat nazo-faringian, l.c.r., sediment urinar, exudat peritoneal, lichid pleural, exudate din ulceraii, lichid vezicular din leziuni cutanate, secreii: vaginal, de la nivelul meatului urinar, din plgi). Pentru examinarea preparatului nativ la microscopul optic se utilizeaz obiectivul uscat, puternic (40x).

Preparat nativ examinat la microscopul optic cu obiectiv uscat, puternic (40x)

Secreie vaginal: filamente miceliene, Scuam: filamente miceliene levuri, leucocite, flora microbian

2

Preparate native realizate din materiile fecale (examen coproparazitologic)

Enterobius vermicularis (Oxiur): ou Ascaris lumbricoides: ou

Schistosoma mansoni Blstocystis hominis

FROTIUL

Frotiul este un preparat colorat, etalat n strat subire i omogen, aderent de lam, cu microorganisme omorte (prin fixare) i nu este infecios. Dup scopul urmrit se pot utiliza: coloraia simpl, coloraia combinat, coloraii speciale.

COLORAIA SIMPL

Preparatul etalat, uscat i fixat se acoper cu un singur colorant, timp de 1-2 minute. Toate elementele din frotiu (bacterii, celule descuamate, celule sanguine), au aceeai culoare ca i colorantul. Astfel, n coloraia simpl cu albastru de metilen toate elementele se coloreaz n albastru. Coloraia simpl permite stabilirea unor proprieti morfologice ale bacteriilor, cum sunt: form, dimensiuni, aezare. De asemenea, n produsul patologic se constat prezena de elemente celulare: polimorfonucleare neutrofile, macrofage. Coloraia simpl este utilizat pentru diagnosticul de gonoree, meningit bacterian, etc.

3

FROTIURI Coloraie simpl cu albastru de metilen:

Neisseria gonorrhoeae: diplococi cu aspect reniform sau de boabe de cafea, Secreie lingual: filamente miceliene, leucocite, situai intracitoplasmatic flor microbian mixt bogat

Secreie vaginal: filamente miceliene, levuri Secreie vaginal: levuri

Coloraie simpl cu fuxin: chisturi de Cryptosporidium n materii fecale

4

COLORAIA COMBINAT

COLORAIA GRAM Coloraia Gram este larg utilizat i permite deosebirea bacteriilor numite Gram pozitiv (colorate n violet) de cele Gram negativ (colorate n rou), n funcie de structura i compoziia peretelui celular.

Timpii coloraiei Gram

1 - preparatul etalat i fixat la cald este acoperit cu o soluie de violet de genian, timp de 2 minute, apoi se scurge colorantul (se poate spla cu ap curent).

2 - preparatul se acoper cu soluie Lugol (Iod metaloid i iodur de potasiu, n ap distilat) pentru mordansare, timp de 2 minute, apoi se scurge soluia Lugol sau se spal cu ap curent.

3 - preparatul se decoloreaz cu alcool-aceton, timp de 20 secunde, apoi se spal cu ap curent.

Decolorare Splare cu ap curent

5

4 - preparatul se recoloreaz cu fuxin diluat sau safranin, timp de 2 minute.

Frotiul se spal, se usuc, se examineaz la microscopul optic cu imersie (obiectiv de 90x, ulei de cedru).

FROTIURI N COLORAIA GRAM

Staphylococcus aureus: coci Gram pozitiv Streptococcus pyogenes: coci Gram pozitiv aezai n grmezi sau ciorchine de strugure aezai n lanuri lungi

Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis: coci Gram pozitiv aezai diplococi Gram pozitiv, capsulai izolat i n lanuri scurte

6

Micrococcus lysodeiticus: coci Gram pozitiv Candida albicans: levuri Gram pozitiv aezai n tetrade

Escherichia coli: bacili Gram negativ Pseudomonas aeruginosa: bacili Gram negativ

Brucella spp.: cocobacili Gram negativ Haemophilus influenzae: cocobacili Gram negativ

7

Corynebacterium diphteriae: bacili Gram Bacillus cereus: bacili Gram pozitiv, mari, pozitiv cu aspect de halter, aezai n grmezi, cu sporulai, aezai n lanuri lungi (streptobacili) aspect de litere chinezeti

Clostridium tetani: bacili mari Gram pozitiv Clostridium sporogenes: bacili mari Gram sporulai (spor mare, rotund, situat terminal; pozitiv sporulai (spor mare, situat central; aspect de b de toboar) aspect de brcu)

Cryptococcus neoformans: fungi capsulai Trichomonas vaginalis - protozoar

8

Produs patologic (secreie uretral): coci Gram pozitiv aezai n grmezi, dar i izolat, polimorfonucleare neutrofile (PMNN), celule epiteliale

COLORAIA ZIEHL-NEELSEN

COLORAIA ZIEHL - NEELSEN pune n eviden microorganisme acido-alcoolo-rezistente, de exemplu, bacilii acido-alcoolo-rezisteni din genul Mycobacterium.

Timpii coloraiei Ziehl-Neelsen

1 - Lama cu preparatul etalat i fixat la cald se acoper cu fuxin fenicat Ziehl (fuxin concentrat).

Se nclzete intermitent lama cu colorantul timp de 5-10 minute, pn la emisie de vapori plimbnd flacra becului de gaz sub preparat, evitnd fierberea (care ndeprteaz preparatul de pe lam) i uscarea colorantului pe lam; dac colorantul se evapor, se mai adaug colorant pe lam. Splarea se face cu ap curent (ap de la robinet).

9

Splare cu ap curent 2 - Decolorare cu soluie de acid sulfuric 20%, timp de 30 secunde, apoi splare cu ap curent.

Decolorare Splare cu ap curent 3 - Decolorare cu alcool etilic 96%, timp de 30 secunde, apoi splare cu ap curent.

Decolorare Splare cu ap curent 4 - Se acoper preparatul cu albastru de metilen, timp de 2-3 minute, apoi se spal cu ap curent.

Recolorare Splare cu ap curent

10

Frotiu colorat Ziehl-Neelsen Se las lamele colorate s se usuce n poziie vertical n stativele pentru lame. Se examineaz la microscopul optic cu imersie (obiectivul de imersie este cel de 90x, lichidul de imersie utilizat fiind uleiul de cedru).

Frotiu colorat Ziehl-Neelsen examinat la microscopul optic cu imersie

Un frotiu colorat Ziehl-Neelsen efectuat dintr-un produs patologic, de exemplu din sput, n care se pun n eviden bacili acido-alcoolo rezisteni, este important n punerea diagnosticului de tuberculoz (n context clinic, prezena de bacili acido-alcoolo rezisteni (BAAR) nseamn infecie cu Mycobacterii). n frotiul efectuat din sput colorat Ziehl-Neelsen se constat:

- Bacili acido-alcoolo rezisteni (BAAR) colorai n rou; proprietatea de acido-alcoolo rezisten apare datorit cantitii mari de lipide, n special de acid micolic, din peretele celular, de aceea se coloreaz numai cu fuxin concentrat, la cald. BAAR sunt bacili roii, mici, subiri, drepi, uneori ncurbai, aezai n frotiu: n grmezi, izolat, sub form de litere majuscule deoarece se unesc prin capete (L, M, N, V, T, Y, W, X etc.).

- Celelalte elemente din frotiu, care nu sunt acido-alcoolo rezistente, se decoloreaz i se recoloreaz n albastru: polimorfonucleare neutrofile (PMNN), macrofage, alte forme vegetative (coci, bacili), resturi (detritusuri) celulare, reea de fibrin.

11

COLORAII SPECIALE - FROTIURI

Coloraia May Grnwald Giemsa: Trichomonas vaginalis: protozoar Plasmodium vivax (frotiu n strat subire)

12

Coloraia Giemsa: Chlamydia trachomatis: cocobacili roii nconjurai de un halou clar

Coloraia Machiavello: Chlamydia trachomatis: cocobacili roii nconjurai de un halou clar

Coloraia Gimenez: Coloraia Fontana Tribondeau: Rickettsia: sac vitellin (cocobacili roii, Leptospira: bacterie spiralat, aspect de dini de fond verde, PMNN colorate n albastru) fierstru, capete ncurbate n crlig

13

Coloraia cu verde malachit i safranin (pentru spori): Bacillus cereus - bacili mari, aezai n lanuri, roii, cu extremiti rotunjite, sporulai (spori ovalari, mici, de culoare verde; exospori i exospori)

Coloraia Burri modificat Gins: Klebsiella pneumoniae (capsul necolorat, bacili roii)

Coloraia Burri: Cryptococcus neoformans (fond negru, capsul necolorat)

14

Examen citologic Babe Papa-Nicolau: Frotiu din secreie cervical (examinare cu obiectiv de 40 x): Modificri reactive: inflamaie; NILM (negativ pentru leziuni intraepiteliale sau maligne)

Coloraia cu hematoxilin-eozin: Efect citopatic produs de virusul Coxsackie: cultur de celule cu incluzii eozinofile n citoplasm

15

Virusul rabic (corpii Babe-Negri colorai n rou situai n citoplasma neuronilor)