116116170 cap6 ing gen drojdii

Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană Note de curs şi tehnici de laborator

1

C A P. 6. T E H N I C I d e I N G I N E R I E G E N E T I C Ă l a D R O J D I I

Drojdiile prezintă numeroase avantaje care le recomandă ca model experimental în ingineria genetica şi biotehnologie. În primul rând, levurile prezintă un timp scurt de multiplicare şi apariţie a unei noi generaţii, de aproximativ 2 ore, ceea ce permite obţinerea a mii de colonii de drojdii , în numai 2 zile, prin cultivare pe plăci Petri, pe un mediu relativ simplu. În al doilea rând, genomul de S. cerevisiae are dimensiuni relativ reduse (1,4 x 107 pb) faţă de cel mamalian (3,5 x 109 pb), ceea ce simplifică analizele genetice şi moleculare. În al treilea rând, drojdiile reprezintă un material optim pentru analizele genetice deoarece pot fi menţinute atât în stadiu haploid cât şi în stadiu diploid. Astfel, mutaţiile genetice recesive pot fi relativ uşor obţinute şi exprimate în celulele haploide, iar complementaţia genetică poate fi realizată prin simpla împerechere a două mutante haploide.

Ingineria genetică la drojdii, ca de altfel şi la alte organisme, cuprinde 2 tehnologii: tehnologia ADN recombinant - inginerie genetică moleculară şi fuziunea de protoplaşti –inginerie genetică celulară.

Primele experimente de inginerie genetică moleculară (transformare genetică) cu drojdii au fost realizate de Hinnen şi Beggs (1978) care au demonstrat posibilitatea clonării şi exprimării genelor heterologe în celula de Saccharomyces cerevisiae. Până în prezent au fost construiţi numeroşi vectori atât pentru tulpinile de drojdii de laborator, având o aplicabilitate mai mult teoretică, cât şi pentru tulpinile de drojdii industriale în scopul ameliorării productivităţii acestora.

Vectori, markeri genetici si procedee de transformare genetica Vectorii utilizabili la drojdii pot fi clasificaţi în funcţie de posibilitatea de clonare şi / sau

exprimare a genelor heterologe în: vectori de clonare – care permit numai clonarea fragmentelor de ADN heterolog; vectori de exprimare – care permit exprimarea prin transcrierea ADN heterolog clonat

datorită prezenţei unor promotori foarte puternici constitutivi, inductibli sau hibrizi; vectori de secreţie – care permit secreţia produşilor genelor clonate datorită prezenţei unor

peptide semnal, reprezentate, de regulă, prin peptida semnal a precursorului factorilor de împerechere a sau α şi cea a factorului killer.

Toate aceste tipuri de vectori prezintă, în comun, ca bază de construcţie, un fragment dintr-un vector pentru celule bacteriene (pBR322, pUC118/119, pUC18/19, pBluescript SK/KS +/-). Acest fragment asigură o origine de replicare pentru amplificarea vectorului în celula bacteriană, o genă de selecţie a transformanţilor în populaţia bacteriană (gena pentru rezistenţă la ampicilină este cel mai des întâlnită) şi, în unele cazuri, origini de replicare caracteristice fagilor filamentoşi care permit obţinerea de ADN monocatenar şi casete care fac posibilă transcrierea in vitro a fragmentului clonat (pentru vectori bazaţi pe fagimidul pBluescript SK/KS +/-).

Toţi vectorii utilizabili în drojdii prezintă şi markerii genetici selectabili în celula de drojdie. Acestea sunt gene ce codifică enzime implicate în căile metabolice ale unor amionoacizi sau nucleotide (Tab.1). Primul marker genetic de acest tip a fost gena LEU 2 care codifică pentru β-izopropilmalat dehidrogenaza şi care este capabilă să complementeze mutaţia leuB de la Escherichia coli, mutaţie care se exprimă prin deficienţă în aceeaşi enzimă a celulelor bacteriene.

Tab.1 Markeri selectabili utilizaţi pentru drojdii

Gena Enzima Selectia HIS3 imidazol glicerofosfat dehidrogenaza histidina LEU2 β-izopropilmalat dehidrogenaza leucina LYS2 α-aminoadipat reductaza lizina TRP1 N -5’fosforibozil-antranilat izomeraza triptofan URA3 Orotidin-5’-fosfat decarboxilaza uracil

Principalele clase de vectori de clonare: În funcţie de stabilitate şi modul de transmitere în descendenţă în celulele de levuri, se pot

defini două clase majore de vectori de clonare (Fig.6. 1): - vectori integrativi; - vectori cu replicare autonomă.

Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetică la Drojdii

ADN de drojdie

LEU2

ADN de drojdie

ARS

ADN de drojdie

LEU2

2

CEN

ARS

LEU2

ADN de drojdie

Fragmentdin plasmida 2 μm

LEU2

pBR322

pBR322pBR322pBR322

Vector integrativ (YIp)

Vector replicativ (YRp) Vector centromeric (YCp) Vector episomal (YEp)

Fig. 6. 1. Principalele clase de vectori de clonare pentru drojdii. pBR322 - secvenţă provenită din plasmidul pBR322; conţine gene pentru rezistenţă la antibiotice (ampicilină

şi/sau tetraciclină) şi oriColE1 (pentru replicare autonomă în celula bacteriană); LEU2 - gena pentru prototrofie la leucină; ADN drojdie - secvenţă din genomul de drojdie; ARS - secvenţa ARS cromosomală sau din plasmida 2 μm (pentru replicare autonomă în drojdii); CEN -

secvenţă centromerică dintr-un cromosom de drojdie; secvenţă extinsă din plasmida 2 μm care conţine secvenţa ARS, REP1, REP2, REP3 (STB ) şi, de cele mai

multe ori, FLP. Vectori de clonare A. Vectorii integrativi (YIp = Yeast Integrating plasmids) – conţin markeri selectabili pentru drojdii, dar nu prezintă secvenţe care să permită replicarea autonomă a vectorilor în celula de drojdie. Transformarea celulei de drojdie are loc în urma unui proces de integrare al plasmidei în genomul drojdiei prin recombinare omoloagă între o secvenţă din cadrul plasmidei şi regiunea corespunzătoare de la nivelul unuia dintre cromozomii drojdiei. Eficienţa transformării cu vectorii YIp este de numai 1 – 10 transformanţiμg ADN.

În Fig. 6. 2 este reprezentat un vector din aceasta clasă - YIp 5. Vectorul prezintă: - genele de rezistenţă la ampicilină şi tetraciclină (ApR, TcR) care permit selecţia transformanţilor (ampicilină rezistenţi- tetraciclină sensibili); - originea replicării din plasmidul ColE1 (oriColE1) conferă capacitate de replicare autonomă în celula bacteriană; - tulpinile de drojdie receptor sunt auxotrofe pentru uracil (ura3). Transformarea celulelor de drojdie are loc prin integrarea vectorului la nivelul secvenţei URA3 la locusul de omologie din cromosomul de drojdie, celulele transformate revenind la starea de prototrofie pentru uracil.

ApR

oriColE1

URA3

TcR

YIp 55.5 kb

ApR

oriColE1

URA3

TcR

YIp 55.5 kb

Fig. 6. 2. Vectorul integrativ YIp 5


B. Vectorii cu replicare autonomă: - replicativi (YRp = Yeast Replicating plasmids) - centromerici (YCp = Yeast Centromeric plasmids) - episomali (YEp = Yeast Episomal plasmids) - lineari (YLp = Yeast Linear plasmids)

conţin markeri selectabili în celula de drojdie şi, spre deosebire de vectorii integrativi, pe lângă secvenţele care le permit replicarea autonomă în celula bacteriană mai prezintă şi secvenţe ce conferă capacitatea de replicare autonomă în celula de drojdie de unde şi denumirea de vectori navetă sau shuttle.

⇒ Vectorii replicativi (YRp) prezenţi în numar de 1 – 10 copii/celulă, conţin secvenţa ARS (autonomously replicating sequence) de la nivelul plasmidei 2 μm sau dintr-un cromosom de drojdie, se replică autonom faţă de ADN-ul cromosomial al drojdiilor, numai o dată pe parcursul unui ciclu celular. Acest tip de vectori prezintă un grad destul de mare de instabilitate mitotica şi meiotica astfel încât vor fi prezenţi în numai aproximativ 5% - 10% dintre descendenţi după circa 10 generaţii. Eficienţa transformării cu vectori YRp este de 103 – 104 transformanţi/μg ADN.

⇒ Vectorii centromerici (YCp) prezenţi în 1 – 2 copii/celulă, au fost obţinuţi din plasmidele YRp prin încorporarea unei secvenţe centromerice CEN dintr-un cromozom de drojdie (de exemplu: CEN IV) pentru a mări stabilitatea mitotica şi meiotica a acestora. Ca urmare, rata de pierdere a plasmidelor este de numai 1% / generaţie.

Fig. 6. 3 reprezintă schema generală de construcţie a unui vector centromeric din seria pRS 413 - 414 - 415 - 416. Vectorul este constituit dintr-o regiune care provine din fagimidul pBluescript SK +/- şi o regiune originară din drojdii. I - din fagimidul pBluescript SK +/- se păstrează:

- oriColE1 - permite replicarea autonomă în celula bacteriană (în lipsa unui fag helper pentru f1), permiţând menţinerea vectorului în forma ADN CCC;

- gena ApR - conferă rezistenţă la ampicilină celulelor bacteriene purtătoare a vectorului; - ori f1 - originea replicării fagului filamentos f1; prin co-infecţia celulei bacteriene gazdă cu un

virus helper pentru f1 se declanşează replicarea ADN de la ori f1 cu obţinerea ADN monocatenar sens sau antisens în funcţie de orientarea ori f1 (+ sau -);

- lac Z - gena care codifică pentru capătul amino-terminal al �galactozidazei; această regiune permite, prin complementaţie intraalelică, selecţia histochimică a vectorilor recombinanţi (purtători de ADN exogen la nivelul MCS). Prezenţa unui promotor inductibil upstream de gena lac Z permite obţinerea de proteine de fuziune; II - din drojdii: - gena URA3 ( HIS3/ LEU2/ TRP1) conferă prototrofie celulelor de drojdie transformante; - caseta ARS/CEN - permite replicarea autonomă şi asigură stabilitatea mitotică a vectorilor în descendenţă.

ApR

oriColE1

URA3

ori f1 (+)

ori f1 (-)

lac Z

MCS

BssHII

BssHII

T3

T7Sac I

Kpn I

ARS CEN

Fig. 6. 3. Schema generală de construcţie a vectorilor centromerici din seria pRS 413 - 414 - 415 - 416

3


O variantă a vectorilor centromerici o reprezintă vectorii de tip YAC (Yeast Artificial Chromosomes) care conţin în plus secvenţe telomerice de drojdie. Acestea le pemite YAC-urilor să se replice asemenea cromosomilor lineari. Deşi YAC-urile nu sunt folosite în acelaşi tip de experimente de clonare ca celelalte categorii de vectori pentru drojdii, capacitatea lor de a clona secvenţe de ADN de până la 400 kpb le-a adus o largă utilizare în studiile ce vizează caracterizarea genomului eucariotelor superioare. ⇒ Vectorii episomali (YEp) prezenţi în 20 – 50 copii/celulă, conţin o regiune mai extinsă din plasmida 2 μm reprezentată de secvenţa ARS şi situsurile REP1, REP2 şi STB (REP3) ceea ce le conferă capacitate de replicare autonomă şi stabilitate în descendenţă, astfel încât după 10 generaţii aceştia sunt prezenţi încă în 60 – 95 % dintre descendenţi. Cea mai mare parte a vectorilor YEp mai prezintă şi secvenţa FLP din plasmda 2 μm, secvenţă care face posibilă recombinarea între plasmidele purtătoare, rezultând o mare varietate de multimeri plasmidiali recombinanţi. Frecvenţa de transformare cu vectori YEp este mare, atingând 104 – 105 transformanţi / μg ADN.

Unul dintre vectorii episomali cu mare utilizare în ameliorarea diferitelor tulpini de drojdii, în special tulpini de laborator, este YEp 24 (Fig. 6. 4). Vectorul prezintă: - o regiune bacteriană provenită de la vectorul pBR322, reprezentată de genele pentru rezistenţă la ampicilină (ApR) şi tetraciclină (TcR) şi originea replicării oriColE1; - o regiune de la drojdii reprezentată de un fragment extins din plasmida 2 μm şi gena URA3 ceea ce permite, pe de o parte, replicarea autonomă a vectorului în celula de drojdie şi, pe de altă parte, selecţia transformanţilor prin cultivarea produşilor transformării pe mediu minimal. Dată fiind auxotrofia pentru uracil (ura3) a celulelor de drojdie receptor, pe mediul minimal vor creşte numai celulele transformate care au primit vectorul în urma procesului de transformare.

ApR

ori ColE1

fragment dinplasmida 2μm

URA 3

TcR

YEp 247.7 kb

Fig. 6. 4. Vectorul episomal YEp 24

⇒ Vectorii lineari (YLp) sunt prezenţi într-o singură copie / celulă şi prezintă la capete secvenţe repetitive bogate în guanină de tipul 5’(dG1-3dT)3’, asemănătoare secvenţelor telomerice de la drojdii sau ciliate. Aceşti vectori sunt de aproximativ 100 ori mai puţin stabili decât cromosomii obişnuiţi, după 10 generaţii fiind prezenţi în numai 20 – 40% dintre descendenţi.

Câţiva dintre cei mai utilizaţi vectori de la drojdii sunt cuprinşi în Tab. 2.

Tab. 2. Vectori utilizaţi la drojdii

Plasmida Dimensiune [kpb]

Originea replicării în E. coli

Originea replicării în drojdii

Fenotip selectabil în E. coli

Fenotip selectabil în drojdii

YIp 5 5.541 oriColE1 - Apr, Tcr URA YRp 7 5.816 oriColE1 ARS1 Apr, Tcr TRP YRp 17 7.002 oriColE1 ARS1 Apr, Tcr URA, TRP YEp 13 10.7 oriColE1 2 μm Apr, Tcr LEU YEp 24 7.769 oriColE1 2 μm Apr, Tcr URA YCp 19 10.1 oriColE1 ARS1 Apr URA, TRP YCp 50 7.95 oriColE1 ARS1 Apr, Tcr URA YLp 21 55 - ARS1 - TRP, HIS pYAC 3 11.4 oriColE1 ARS1 Apr, Tcr TRP, URA, HIS 2 μm 6.318 - 2 μm - -

4


Vectori de exprimare Vectorii de exprimare permit transcrierea unui segment de ADN heterolog sub controlul unui

promotor aparţinând unei gene structurale. Întreaga regiune este alcatuită din: ♦ secvenţele reglatoare şi un promotor puternic (fără codonul AUG de iniţiere al traducerii); ♦ situs pentru 1 - mai multe endonucleaze de restricţie; ♦ secvenţa terminator al transcrierii.

ADN heterolog poate fi clonat prin inserţie în situsul pentru endonucleazele de restricţie, fiind astfel încadrat între secvenţele esenţiale (promotor şi terminator) ale unui proces de transcriere; în urma procesului de transformare a unor celule de drojdie receptor cu vector recombinat, pot fi uşor obţinute proteine heterologe.

Vectorii de exprimare sunt clasificaţi în funcţie de tipul de promotor utilizat în: 1. vectori de exprimare cu promotori constitutivi; 2. vectori de exprimare cu promotori inductibili; 3. vectori de exprimare cu promotori hibrizi constitutivi/inductibili. 1. Un exemplu de promotor constitutiv utilizat în obţinerea de vectori de exprimare la drojdii este cel al genei pentru gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenază, enzimă implicată în calea metabolică a glucozei (Fig. 6. 5). Bitter şi colab. (1984) au inserat acest promotor într-un vector de tip YEp şi l-au utilizat pentru clonarea şi exprimarea genei pentru � 1-antitripsină, proteină heterologă reprezentând, în final, până la 5% din totalul proteinelor celulare. Gena a fost inserată la nivelul unui situs multiplu de clonare restictat cu endonucleaza de restricţie BamHI. Ca secvenţă semnal pentru terminarea transcrierii şi pentru poliadenilare a fost folosit segmentul de la capătul 3' al genei pentru fosfoglicerat kinază (Fig. 6. 6).

G lucoza

G lucozo 6 - fosfat

Fructozo 6 - fosfat

Fructozo 1 ,6 - b ifosfa t

D ihidrox iacetona G licera ldeh id 3 - fosfa t

P iruvat

A ceta ldeh ida

Etanol

glicera ldehid 3 - fosfat dehidrogenaza

alcooldehidrogenaza

Fig. 6. 5. Călea metabolizării fermentative a glucozei până la etanol în celula de drojdie

2. Exprimarea genelor clonate în vectorii de drojdii ce prezintă inseraţi promotori inductibili este dependentă de concentraţia în mediul de creştere a drojdiilor a factorului inductibil, reprezentat, spre exemplu, de ionii de cupru sau de metanol.

Utilizând regiunea promotoare 5' a genei CUP1, gena codificatoare a metalotioneinei din drojdii, a cărei activititate este indusă de prezenţa în mediu a ionilor de cupru, s-a reuşit clonarea şi exprimarea genei pentru antigenul de suprafaţă a virusului hepatitei B. Celulele de drojdii transformate cu plasmide purtătoare a acestei gene produc cantităţi mari de proteină virală ce poate reprezenta aproximativ 1-2% din totalul proteinelor celulare. Creşterea drojdiilor transformate în fermentatoare mari a facut posibilă obţinerea a 50 - 100 mg proteină virală / litru de cultură. Proteina recombinantă obţinută are un grad înalt de omologie cu cea naturală, având proprietăţi similare cu cea izolată de la pacienţi infectaţi şi este utilizată în prezent la vaccinarea contra hepatitei B.

5


Un alt promotor inductibil utilizat intens este cel pentru gena codificatoare a alcool (metanol) oxidazei, enzimă implicată în prima treaptă de degradare a metanolului în peroxizomii drojdiilor metilotrofe. Promotorul genei pentru alcool oxidază este inhibat de prezenţa în mediul de cultură a glucozei şi etanolului, este derepresat de glicerol şi indus de metanol. Prezenţa promotorului respectiv permite obţinerea unor cantităţi mari de proteină heterologă (până la 35% din totalul proteinelor celulare) de mare puritate.

ori ColE1

ApR

PGPD

capat 3' PGK

LEU 2

fragmentdin plasmida 2 μm

gena pentruα 1 - antitripsina

(include ARS)

Fig. 6. 6. Vector de exprimare cu promotor constitutiv pentru exprimarea genei care codifică α 1-antitripsina

(ApR - gena pentru rezistenţă la ampicilină; oriColE1 - originea replicarii din ColE1; LEU2 - gena pentru b-izopropilmalat dehidrogenază - conferă prototrofie la Leu celulelor de drojdie transformante; fragment din plasmida 2 μm care conţine şi secvenţa ARS pentru replicare autonomă în celule de drojdie; PGPD -promotorul genei pentru gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenază; gena pentru a 1-antitripsină (gena de interes) integrată la situsul de restricţie pentru BamHI; capătul 3' al genei pentru fosfoglicerat kinază - pentru terminarea transcrierii genei de interes)

3. În unele cazuri proteinele heterologe obţinute pot fi toxice pentru celula de drojdie determinând rate scăzute de creştere. În scopul ameliorării procesului de obţinere a compuşilor respectivi s-au construit o serie de vectori care conţin promotori hibrizi constituvi / inductibili a căror funcţionare nu este simultană. Astfel, interferonul γ este toxic pentru celula de drojdie. Cu toate acestea a fost posibilă clonarea genei pentru interferon γ în drojdii şi exprimarea ei cu ajutorul unor vectori ce prezentau un promotor hibrid format din secvenţa 5' a promotorului genei pentru gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenază în care a fost inclusă secvenţa activatoare tip enhancer (UAS - upstream regulating sequence) a genei GAL 10 ce codifica pentru galactoepimerază (UASG) (Fig.6. 7). Funcţionarea UASG este indusă de prezenţa în mediul de cultură a galactozei (nivelul de exprimare a genei creşte de aproximativ 1000 ori) şi este inhibată de prezenţa glucozei, nivelul de exprimare a genei GAL 10 fiind de 1000 - 2000 ori mai mic în aceste condiţii. Celulele de drojdie sunt crescute iniţial pe mediu cu glucoză ceea ce asigură obţinerea unei densităţi celulare mari, nivelul de exprimare a genei pentru interferon γ fiind foarte scăzut la fel ca şi eventualul efect toxic al interferonului. În etapa următoare celulele sunt trecute pe mediu cu galactoză ca sursă unică de carbon, rezultatul fiind activarea UASG şi transcrierea genei pentru interferon γ, ajungându-se, în final, la circa 2g interferon γ / litru de cultură. Un exemplu asemănător îl reprezintă cel al clonării şi exprimării genei pentru factorul de creştere epidermal necesar pentru regenerarea ţesuturilor. În acest caz, secvenţa activatoare UASG a fost înlocuită cu promotorul genei ADR2, gena structurală a alcooldehidrogenazei citoplasmatice ADH II. Promotorul genei ADR2 este inactivat de concentraţiile mari de glucoză din mediul de cultură şi este indus de scăderea concentraţiei acesteia. După creşterea celulelor de drojdie pe mediu bogat în glucoză şi atingerea densităţii celulare optime, odată cu consumarea glucozei din mediu, are loc activarea promotorului ADR2 sub influenţa căruia are loc exprimarea genei pentru factorul de creştere epidermal. Produsul obţinut prezintă o structură identică cu cea a hormonului izolat din celulele umane.

6


ApR

ori ColE1

PGPD

capat 3' PGK

LEU 2

fragmentdin plasmida 2 μm

(include ARS)

UASG

gena pentruinterferon γ

Fig. 6. 7. Vector de exprimare cu promotor hibrid inductibil/constitutiv

pentru exprimarea genei pentru interferon g (are aceeaşi structură ca vectorul de exprimare cu promotor constitutiv, dar, în plus,

prezintă secvenţa UASG - secvenţă tip enhancer a genei GAL 10 pentru galactoepimerază)

Vectori de secreţie

Drojdiile pot fi manipulate genetic pentru producerea de proteine care sunt secretate în mediu utilizând vectori de secreţie. Polipeptidele secretate de celulele eucariote sunt sintetizate sub forma unui precursor cu un capăt amino-terminal extins, precursor care suferă mai multe modificări ce includ procese de clivare proteolitică, formarea unor punţi disulfurice şi, eventual, O- sau N-glicozilări, în final rezultând forma matură a proteinei.

La drojdii s-au folosit diverse secvenţe semnal pentru direcţionarea secreţiei în mediu a proteinelor heterologe. Dintre acestea amintim secvenţa semnal a factorului killer, cea a genei pentru protează alcalină extracelulară (XPR2) în cazul drojdiilor capabile să degradeze n-alcanii, şi secvenţa semnal (pre-prosegmentul precursorului) a factorului de împerechere. Aceasta din urmă este reprezentată de regiunea amino-terminală de 85 de aminoacizi a produsului genei MFa1 şi se termină cu un situs dibazic Lys-Arg recunoscut de endoproteaza numită kexină care clivează la acest nivel produsul primar de traducere în cursul procesării spre forma matură.

Proteinele heterologe secretate de celulele de drojdie manipulate genetic sunt proteine de fuziune care încep cu pre-prosecvenţa MFα1 şi continuă cu proteina propriu-zisă. În cele mai multe cazuri polipeptida ce urmează a fi secretată flanchează situsul dibazic de clivare, astfel încât în urma acţiunii kexinei se eliberează proteina de interes.

I. Experiment de construire a vectorilor shuttle la Saccharomyces cerevisiae.

Experimentul constă în construirea unui vector de clonare replicativ din seria pRS, denumit pBY, pornind de la vectorii YEp 24 şi pBluescript SK +/-.

Principalele etape ale acestui experiment sunt : (1) izolarea ADN plasmidial reprezentat de vectorii parentali; (2) restricţia vectorilor cu endonucleaze de restricţie (Hind III) şi tratamentul cu fosfatază alcalină (pentru a evita recircularizarea vectorilor parentali); (3) ligarea fragmentelor de restricţie cu obţinerea vectorului pBY ; (4) transformarea celulelor de drojdie cu vectorul pBY. I.1. Izolarea ADN plasmidial reprezentat de vectorii parentali.

ADN plasmidial de YEp24 şi pBluescript SK +/- se izolează din tulpina bacteriană Escherichia coli K-12 DH5α, conform protocolului de lucru prezentat în Cap. 2. 3. (metoda lizei alcaline). Se verifică electroforetic şi spectrofotometric puritatea şi integritatea ADN izolat şi se calculează concentraţia ADN exprimându-se în μg ADN/μl. I.2. Digestia vectorilor cu Hind III si tratamentul cu fosfatază alcalină

În desfăşurarea protocolului de lucru se va ţine cont de indicaţiile din Cap. 3. 2, cu următoarele observaţii: se realizează 4 amestecuri de restricţie, notate A, B, C şi D; pentru digestia ADN plasmidial de YEp24 se realizează două variante de lucru - cu şi fără fosfatază alcalină - pentru observarea acţiunii fosfatazei alcaline; ca marker de migrare se foloseşte ADN de fag �restrictat cu HindIII (rezultă 8 fragmente de restricţie).

7


ApR

ori f1

lacZ'

PCS

ori Col EI

ori

TcR

URA3

ARS2μm

p lacZ'

ApRARS2μm

URA3

ApR

pBluescriptSK+2,96 kbp.

YEp247,769 kbp

ApR

ori f1

lacZ'

ori Col EI

URA3

ARS2μm

lacZ'ori f1

ori

p lacZ'

pBY6293 bpHindIII

HindIII

HindIII

Hind IIIdigestion ligation

Fig. 6. 8. Structura noului vector pBY (secvenţa ARS – pentru replicare autonomă în celula de drojdie ; URA3 – permite selecţia celulelor de drojdie transformate ; ori- ColE1 – pentru replicare în celula bacteriană ; ori f1 – permite replicarea după modelul fagilor filamentoşi; ApR – marker pentru selecţia în celula bacteriană; LacZ’ – selecţia transformanţilor prin complementaţie inter-alelică; situs MCS – incluzând situsul de restricţie BamH I pentru inserarea ADN heterolog).

Amestecurile de restricţie se realizează în tuburi Eppendorf sterile:

Componenta reacţiei A B C D Apă distilată sterilă 26 μl 26 μl 23 μl 23 μl Tampon pentru Hind III [10 X]

4 μl 4 μl 4 μl 4 μl

ADN plasmidial YEp24 [1,5 μg ADN/μl]

6 μl 6 μl - -

ADN plasmidial pBluescript SK+/- [2 μg ADN/μl]

- - 10 μl -

ADN fag λ (dilutie 1:5) - - - 10 μl Hind III [10U/μl] 2 μl 2 μl 3 μl 3 μl Fosfatază alcalină [1U/μl] 2 μl - - -

Volum total: 40 μl 40 μl 40 μl 40 μl

Componentele reacţiilor de restricţie vor fi adăugate exact în ordinea menţionată, schimbându-se vârful pipetei la fiecare tub şi component al reacţiilor. Enzimele utilizate vor fi menţinute pe gheaţă. După realizarea amestecurilor, probele se incubează pe baie de apă, la 37oC, timp de 2,5 ore.

La terminarea timpului de digestie se realizează precipitarea fragmentelor de restricţie. Pentru fiecare probă se va face următorul amestec de reacţie: tot volumul probei (40 μl) + 1/5 volume soluţie EDTA 0,25M + 1/2 volume soluţie acetat de amoniu 5M + 3 volume etanol 100% rece (-20oC). Probele se incubează 15 minute la -20oC. Se centrifughează 15 minute la 14000 rpm (4oC). Sedimentul se spală de 2 ori cu etanol 70% şi se centrifughează 15 minute la 14000 rpm. ADN rezultat se reia în 25 μl soluţie TE.

Pentru verificarea eficienţei reacţiei de restricţie probele vor fi supuse în continuare unei electroforeze în gel de agaroză în sistem submers (Cap. 2. 2). Pentru electroforeză se folosesc tampon TBE 0,5X şi agaroză 1% (preparată în TBE 0,5X), iar ca marker de migrare 1 μl amestec albastru de bromfenol - sucroză. Schema de încarcare a gelului de electroforeză este : câte 5 μl din

8


probele de ADN restrictat, câte 5 μl din probe reprezentate de ADN plasmidial de YEp24 şi pBluescript SK +/- nedigerat (folosite ca markeri pentru reacţiile de restricţie), 5 μl ADN plasmidial E. coli V517 – scala de plasmide. Restul de 20 μl din probele de digestie vor fi folosiţi în etapa următoare – ligarea fragmentelor şi obţinerea noului vector pBY. Probele se lasă la migrat la un voltaj de 2.5 – 3 V/cm.

Fig. 6. 9. Gelul de verificare a reacţiei de restricţie a ADN plasmidial de YEp24 şi pBluescript SK +/-

(godeurile : 1 – ADN λ / Hind III; 2-3 - ADN plasmidial YEp24/ Hind III; 4 – ADN plasmidial YEp24/Hind III şi tratament cu fosfatază alcalină; 5 – ADN plasmidial YEp24; 6 – ADN plasmidial pBluescript SK+/ Hind III; 7 – ADN plasmidial pBluescript; 8 – ADN plasmidial E. coli V517)

I.3. Ligarea moleculelor de ADN restrictate

Moleculele de ADN restrictate sunt supuse reacţiei de ligare conform schemei din tabelul următor. În timpul pregătirii reacţiei, tuburile cu probe şi enzimele sunt menţinute pe gheaţă. Ca şi în cazul reacţiei de restricţie, componentele sunt adăugate în ordinea menţionată.

Probele sunt incubate la 14oC, peste noapte.

Componenta reacţiei L1 L2 L3 L4 apă distilată sterilă 3 μl 11 μl 2 μl 2 μl tampon de ligare (10X) 2.5 μl 2.5 μl 1 μl 1 μl Reacţia A (YEp24/Hind III + AP)

10 μl - - -

Reacţia B (YEp24/Hind III)

- 5 μl - 5 μl

Reacţia C (pBlue/Hind III)

5 μl 2 μl 5 μl -

ATP (10 mM) 2.5 μl 2.5 μl 1 μl 1 μl ADN ligază de fag T4 (diluţie 1 :2 în tamponul de ligare)

2 μl 2 μl 1 μl 1 μl

Volum total 25 μl 25 μl 10 μl 10 μl

Verificarea eficienţei reacţiilor de ligare şi identificarea fracţiei reprezentate de vectorul nou obţinut pBY, se realizează prin electroforeză în gel de agaroză în sistem submers, folosind tampon de electroforeză TBE 1X, agaroză 0.8% (preparată în TBE 1X), 3 μl ADN din fiecare probă, 1 μl marker de migrare (albastru de bromfenol-sucroză).

Fig. 6. 10. Gelul de verificare a reacţiei de ligare a fragmentelor de restricţie obţinute pentru YEp24 şi pBluescript SK +/-

(godeurile : 1 – ADN λ/ EcoR I, Hind III ; 2 – YEp24/Hind III; 3 – pBluescript SK +/-; 4 – ligare L2; 5 – ligare YEp24/Hind III (digestie parţială) + pBluescript SK +/- / Hind III; 6 – ligare L1; 7 – autoligare ADN plasmidial YEp24/Hind III şi tratament cu fosfatază alcalină ; 8 - autoligare L3; 9 - autoligare L4; 10 – ADN plasmidial pBluescript SK +/-; 11 – ADN plasmidial YEp24)

II. Transformarea genetică cu vectori shuttle Transformarea genetică reprezintă principalul procedeu de introducere în vitro de material genetic exogen în celule pro- sau eucariote. Acest proces permite realizarea unor studii fundamentale privind structura şi funcţionarea genelor pro- şi eucariote, cartarea şi screening-ul genelor şi a unor studii aplicative privind ameliorare genetica a diferitelor categorii de organisme.

9


10

La Saccharomyces cerevisiae, există mai multe modalităţi de realizare a transferului de material genetic, cu eficienţe diferite, dintre care menţionăm : - transformarea chimică; - transformarea celulelor intacte cu vectori plasmidiali, prin electroporare. A. Transformarea chimica în prezenţa LiCl

Mecanismul care stă la baza acestei metode este, în principal, formarea de pori la nivelul peretelui celular al celulelor de drojdie sub acţiunea ionilor de Li (Li+) şi, probabil, eliberarea unor receptori membranari pentru ADN exogen. Ceilalţi reactivi utilizaţi au rolul de a facilita pătrunderea ADN transformant în celula de drojdie: ADN carrier (ADN din spermă de hering – preparat în soluţie stoc 10 mg/ml în TELI) măreşte eficienţa transformării având un rol cu prepoderenţă cantitativ; PEG are rolul de a concentra ADN transformant şi ADN carrier la suprafaţa celulelor de drojdie.

Această metodă asigură o frecvenţă de transformare mai mare decât în cazul transformarii prin fuziune de protoplaşti şi, spre deosebire de electrotransformare, nu necesită aparatură specială.

Protocol de lucru Tulpina receptor folosită este S.cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2) Vector shuttle utilizat pentru transformare: YEp24

Se realizează o cultură de S. cerevisiae Ts5 în YPG lichid şi se incubează 18 ore la 28oC. 1,5 ml cultură se centrifughează 5 minute la 6500 rpm. Supernatantul se aruncă, iar sedimentul celular se resuspendă în 1 ml soluţie TELI , pH 8.0 şi se incubează 30 minute la 30oC. Din suspensia formată se repartizează câte 200 μl în 5 tuburi Eppendorf (de 1,5 ml). În fiecare dintre cele 5 tuburi se adaugă câte 20 μl ADN carrier. În 4 dintre tuburi se adaugă şi câte 40 μl extract vector (tubul nr.5 va fi notat ca Martor). Se incubează 30 min la 30oC. După agitare la vortex, în fiecare dintre cele 5 tuburi se adaugă câte 200 μl soluţie TELI-PEG. Se incubează 20 minute la 30oC, apoi 10 minute la 42oC.

Din fiecare tub se însămânţează pe câte 2 placi Petri (100 μl/placă) cu mediu YNB-leu-glucoza şi se incubează 48 ore la 28oC.

Medii şi soluţii Mediu YPG Mediu YNB-leu-glucoza : yeast nitrogen base 0.67 % ; sulfat amoniu 0.5 % ; glucoza 2.0 % ;

agar 2.0 % ; leucină 3 mg/l soluţie TELI - pH 8.0 : Tris 10 mM; EDTA 1 mM ; LiCl 50 mM soluţie TELI-PEG : 25 ml soluţie TELI + 40 % polietilenglicol 6000

B. Transformarea electrică - electrotransformarea Electrotransformarea presupune expunerea celulelor, tratate sau nu înainte cu un agent labilizator al peretelui celular, în prezenţa ADN-ului exogen, la pulsuri de câmp electric cu o anumită amplitudine şi durată. Aceste pulsuri determină dezorganizarea reversibilă a membranei plasmatice, ceea ce conduce la o creştere a permeabilităţii acesteia, inclusiv pentru macromolecule de tipul ADN. Mecanismul molecular al penetrării particulelor exogene prin membrana celulară nu este elucidat. Condiţiile optime de electropulsare (intensitatea câmpului electric, durata pulsului, compoziţia mediului de suspensie, cantitatea de ADN plasmidial, numărul de celule, etc) sunt determinate prin încercari pentru fiecare experiment în parte. În multe experimente de electrotransformare parametrii cei mai importanţi par a fi intensitatea şi durata pulsului electric aplicat deoarece acesta produce o dezorganizare temporară a membranei celulare. De asemenea, celulele supuse electrotransformarii trebuie să se găsească în fază logaritmică de creştere, iar tamponul utilizat este glicerolul în soluţie apoasă, deoarece literatura de specialitate menţionează faptul ca glicerolul şi sucroza sunt cei mai eficienţi stabilizatori osmotici. Un alt parametru important în electrotransformare este densitatea suspensiei celulare şi concentraţia ADN exogen. În literatură se menţionează că numărul de transformanţi creşte linear cu creşterea numărului de celule până la o anumită valoare, după care apar erori datorită heterogenităţii câmpului electric aplicat. Saturaţia în ADN plasmidial corespunde unui raport între numărul moleculelor de ADN exogen şi numărul de celule de aproximativ 100:1. La concentraţii mai mari de ADN plasmidial frecvenţa transformării scade. O posibilă interpretare a acestor rezultate ar fi aceea conform căreia doar o subpopulaţie de celule de drojdie este competentă pentru transformare. În experimentele noastre am utilizat o cantitate de cca 200 ng ADN plasmidial la 1.5 ml suspensie (ce conţine cca 5.1 x 108 celule / ml). Protocol de lucru Tulpina receptor utilizată este Saccharomyces cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2). ADN transformant este reprezentat de ADN vector YEp24


11

1,5 ml cultură de S. cerevisiae Ts5 în mediu YPG, în fază logaritmica de creştere (18 ore) se centrifughează 6 minute la 6000 rpm. Sedimentul se resuspendă în 1,5 ml soluţie glicerol 20%, se citeşte la spectrofotometru absorbanţa la λ = 650 nm şi se calculează densitatea celulară. Se determină concentraţia ADN de YEp 24 prin citirea A260.

Pentru electroporare se realizează 10 probe folosind camere de electroporare de 2 mm3, fiecare probă fiind formată din : 200 μl suspensie celulară şi 20 μl ADN transformant. Se realizează şi un Martor care are aceeaşi compoziţie ca probele dar nu este supus curentului electric. Cele 10 probe sunt suspuse electrotransformării la diverse intensităţi ale câmpului electric (kV/cm): 0.250; 0.500; 0.750; 0.870; 1.000; 1.125; 1.250; 1.375; 1.500; 1.625. Pentru toate probele curentul electric este reprezentat de pulsuri bipolare de câte 10 μsec, cu pauze de câte 10 μsec, durata totală a trenului fiind de 22 msec. După electroporare, din fiecare cuvă se iau 100μl şi se aduc 1000 μl cu YPG, se incubează 2 ore la 30oC. Se realizează diluţii zecimale în funcţie de densitatea celulară a suspensiei citită iniţial şi din ultimele 2 diluţii se însamânţează 0.1 ml pe plăci cu YNB suplimentat cu leucină .

După incubarea plăcilor 72 ore la 30oC, se numără coloniile de electrotransformanţi şi se calculează frecvenţele şi eficienţele de transfomare pentru cele 10 probe. Ca martor sunt însămânţate celulele ce nu au fost supuse electroporării, pe mediu complet (YPG). Eficienţa transformării este estimată prin raporarea numărului de celule transformate la numărul de celule martor. III. Fuziunea de protoplaşti

Protoplaştii reprezintă sisteme experimentale importante, cu implicaţii în elucidarea unor probleme majore ale biologieie moleculare şi celulare, biochimiei şi geneticii. Înlăturarea peretelui celular a creat posibilitatea studierii directe a proprietăţilor fizice, şi fiziologice ale plasmalei, cât şi a altor citomembrane. Protoplaştii permit, de asemenea, descifrarea mecanismelor care intervin în fuziunile membranare, precum şi înţelegerea proceselor de biosinteză a componentelor peretelui celular. Tehnologia protoplaştilor a facilitat şi separarea, în condiţii optime, a diferitelor componente celulare (mitocondrii, nuclei, peroxizomi), permiţând cunoaşterea interrelaţiilor morfo-funcţionale de la nivelul diferitelor compartimente celulare. Importanţa protoplaştiilor derivă şi din perspectivele oferite pentru experimentele de inginerie genetica celulară şi moleculară.

După ce Eddy şi Williamson (1957) au pus la punct o tehnică eficientă de preparare a protoplaştilor la drojdii, folosind enzime litice din sucul digestiv de Helix pomatia, cercetările privind izolarea şi utilizarea protoplaştilor de drojdii în experimentele genetice au luat o mare amploare.

Aceste sisteme celulare au fost utilizate cu succes în hibridarea somatică prin fuziune de protoplaşti. Astfel, tehnica fuziunii de protoplaşti a prezentat şi prezintă, înca, o importanţă deosebită în realizarea hibrizilor intra-, interspecifici şi intergenerici, pornind de la tulpini de laborator cu markeri de auxotrofie sau tulpini industriale cu markeri mitocondriali.

Protoplaştii sunt sisteme celulare fragile, astfel încât pentru menţinerea viabilităţii, integrităţii şi metabolismului lor normal, trebuiesc realizate condiţii speciale de izolare, manipulare şi cultură. Astfel, masa de protoplaşti este influenţată de vârsta şi starea fiziologică a culturii. Celulele tinere de S. cerevisiae, aflate în fază exponenţială de creştere, sunt imediat convertite în protoplaşti, pe când cele în fază staţionară sunt rezistente la liză. În timpul tranziţiei de la faza exponenţială la faza staţionară, se constată o creştere rapidă a rezistenţei la protoplastizare, datorită diferenţelor structurale ale peretelui celular.

Procedeele de preparare a protoplaştilor de drojdii pot fi clasificate în : 1. procedee de inhibare specifică a sintezei peretelui celular ; 2. procedee de digestie enzimatică a peretelui celular cu enzime din sucul digestiv de Helix

pomatia (un complex de peste 35 de enzime, dintre care amintim : endo – β(1,3) – şi endo – β(1,3) – glucanază, manază, chitinază, celulază, lipază, poligalacturonază), sau cu enzime microbiene de tipul zymolyază de Arthrobacter luteus, lyticază sau novozym 234 (Fig.6.11 - a,b).

Deoarece protoplaştii sunt sensibili la variaţiile presiunii osmotice, este necesară asigurarea unei osmolarităţi echilibrate a mediului cu stabilizatori osmotici de tipul zaharurilor nemetabolizabile şi a sărurilor anorganice (manitol, sorbitol, clorură de poatsiu, sulfat de magneziu, sulfat de amoniu).

S-a constatat ca unii aminoacizi cu sulf, cum ar fi cisteina, accelerează procesul de izolare a protoplaştilor de drojdii prin tratamentul enzimatic cu suc digestiv de Helix pomatia. Ulterior, o serie de cercetători au realizat sensibilizarea celulelor de drojdie la tratamentul enzimatic cu compuşi mercapto - : 2 - mercaptoetanolamină, 2 – mercaptoetanol, tioglicolat şi ditiotreitol. S-a presupus că aceşti compuşi acţionează asupra proteinelor din structura peretelui celular prin desfacerea legăturilor disulfurice, facilitând acţiunea litică a enzimei.

Primele cercetări referitoare la fuziunea controlată a protoplaştilor la drojdii au fost iniţiate de Ferenczy (1974) şi au fost impulsionate în urma descoperirii şi folosirii ca agent de fuziune a polietilenglicolului (PEG). Ulterior, s-a demonstrat ca fuziunea chimică cu PEG este mediată de ionii de calciu (Ca2+). Rolul PEG şi Ca2+ în procesul de fuziune a fost însă îndelung controversat. Astfel,


12

Lucy (1984) a presupus ca evenimentul central în procesul de fuziune membranară este interacţiunea şi fuziunea bistraturilor lipidice ale celor două membrane, proces în care proteinele nu intervin. PEG şi Ca2+ determină deshidratarea membranelor şi schimbarea permeabilităţii datorită dezorganizarii locale a bistraturilor lipidice. Prin reducerea repulsiei electrostatice şi a forţelor de hidratare a lipidelor apare un contact strâns între bistraturile lipidice. Lipidele celor două bistraturi se unesc, fapt ce implică pierderea temporară a configuraţiei bistratificate în punctul de fuziune. În final, cele două bistraturi fuzionează şi se produce restabilirea structurii normale a plasmalemei. Conform altor cercetatori, ionii Ca2+ intervin în fuziune prin creşterea intracelulară a concentraţiei Ca2+ şi activarea unor enzime ce determină dezorganizarea lipidelor. Astfel, s-a presupus că în cazul fuziunii mioblastelor, spre exemplu, ionii Ca2+ activează fosfodiesteraza ce determină ruperea bistraturilor lipidice (Fig. 6.11 – c,d).

Electrofuziunea reprezintă o altă tehnică de fuziune a protoplaştilor. În esenţă, metoda constă în expunerea protoplaştilor unui câmp electric pulsatoriu de intensitate înaltă şi de scurtă durată. În aceste condiţii, se realizează o rupere locală a membranelor care devin astfel permeabile. Procesul este reversibil. În timpul fuziunii se formează între membranele celor două celule punţi lipidice, astfel încât cele două membrane se refac împreună în zona de contact. Punţile formate determină apariţia unor pori cu diametrul foarte mic, fapt care are ca rezultat apariţia unei tensiuni de suprafaţă foarte înaltă. Etapa următoare constă în fuziunea celulelor într-o sferă.

În realizarea fuziunii, se porneşte, de regulă, de la tulpini de laborator ce prezintă markeri biochimici de auxotrofie, fapt ce uşurează izolarea ulterioară a produşilor de fuziune. Prin fuziunea de protoplaşti sunt depăşite barierele sexuale ce împiedică realizarea încrucişărilor între tulpinile de drojdii ce aparţin aceluiaşi tip de împerechere (α x α, a x a). Fenomenul de reversie a protoplaştilor de drojdii presupune parcurgerea a două etape: (1) formarea unui nou perete celular şi (2) realizarea mitozei şi citochinezei şi repetarea ciclului celular. S-a pus problema dacă peretele celular este sintetizat de novo sau este necesară existenţa unui model supramolecular (resturi ale peretelui celular iniţial), primer pentru sinteza noului perete. Cercetările de microscopie electronică utilizând tehnici de fluorescenţă şi criodecapaj, au adus dovezi în sprijinul ipotezei privind sintetizarea de novo a peretelui celular. Reversia la starea celulei iniţiale este un proces gradat, determinat genetic, ce presupune existenţa câtorva generaţii de revertanţi. Iniţierea reversiei este marcată de desfăşurarea primei citochineze care se realizează imediat ce peretele celular a fost complet regenerat. Regenerarea protoplaştilor la drojdiile din genul Saccharomyces se realizează pe medii solide cu gelatină, agar sau polietilenglicol (Fig. 6.11 - d).

În ceea ce priveşte produşii de fuziune, descendenţa hibrizilor selecţionaţi pentru complementaţia markerilor de auxotrofie sau pentru markeri de rezistenţă, poate fi caracterizată pentru confirmarea originii hibride prin: (1) sporulare şi segregare meiotică sau segregare mitotică, (2) stabilirea fuziunii nucleare - formarea de heterocarioni sau homocarioni, (3) stabilirea gradului de ploidie.

1. Segregarea meiotică şi mitotică. La tulpinile de drojdii ce prezintă sporulare şi meioză (S. cerevisiae MAT a/α) se poate realiza analiza tetradică şi, implicit, stabilirea constituţiei genetice a descendenţei produşilor de fuziune. În experimentele de fuziune de protoplaşti s-au utilizat însă, şi tulpini de laborator de S. cerevisiae heterotalice de acelaşi tip de împerechere (fuziuni de tipul a x a, sau α x α), sau tulpini industriale ce nu prezintă sporulare şi meioză. Urmărind capacitatea de sporulare şi împerechere a produşilor de fuziune α/α sau a/a, s-a constatat că aceştia sunt deficitari în sporulare, dar prezintă capacitate normală de împerechere (a/a x α/α), iar descendenţii, după sporulare, pot fi analizaţi genetic. În absenţa capacităţii de sporulare se poate iniţia pierderea cromozomilor în mitoză (haploidizare) cu acriflavină, radiaţii ultraviolete, nitrosoguanidină, etc. Prin această metodă a fost indusă seregarea parentalilor şi a recombinanţilor la Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis şi Hansenula polymorpha, fapt ce a permis analiza ulterioară a descendenţilor şi, implicit, caracterizarea produşilor de fuziune.

2. Formarea heterocarionilor şi a homocarionilor. În urma fuziunii de protoplaşti se pot obţine heterocarioni, heteroplasmoni sau hibrizi. Prima etapă ce urmează fuziunii protoplaştilor aparţinând la două tulpini diferite de drojdii este formarea heterocarionilor multinucleaţi. S-a stabilit ca la S. cerevisiae, în urma fuziunii de protoplaşti apar cu o frecvenţă mare celule poliploide. De asemenea, este posibil să se obţină produşi de fuziune pornind de la trei parentali haploizi diferiţi. Aceste rezultate demonstrează că produsul de fuziune conţine 2 sau mai multi nuclei. În această fază se realizează însă, intermixarea citoplasmatică şi, probabil, fuziunea unora dintre nuclei. Numărul de nuclei per produs de fuziune poate fi determinat prin colorare cu acridin orange, DAPI sau Giemsa.

3. Gradul de ploidie al produşilor de fuziune poate fi determinat prin metode diferite. La drojdiile ce sporulează, de tipul S. cerevisiae a/α, se poate aplica analiza tetradică. O altă metodă constă în stabilirea gradului de ploidie prin măsurarea cantităţii de ADN din celulă. La unele drojdii,


ploidia poate fi estimată şi prin măsurarea dimensiunii celulei. Se poate aprecia gradul de ploidie şi pe baza viabilităţii sporului, ţinând cont de faptul ca triploizii produc spori cu o viabilitate scazută.

Prin combinarea acestor metode de analiză s-a demonstrat ca produşii de fuziune de la S. cerevisiae, proveniţi de la două sau mai multe tulpini haploide sunt predominant diploizi, dar pot să apară cu frecvenţă mare şi triploizi sau tetraploizi. De asemenea, au fost identificaţi şi produşi aneuploizi. Apariţia acestora demonstrează faptul că, între nucleii heterocarionului se poate realiza transferul unor cromosomi individuali, într-o manieră similară cu cele observate în producerea de citoductanţi (Fig.6.11).

Parte experimentală Pentru fuziunea de protoplaşti se folosesc următoarele perechi de tulpini de drojdii :

A B

S.cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2) x S.cerevisiae D-585-11c (a lys)

S.cerevisiae 17/17 (α his) x S.cerevisiae 9744 (α leu2)

S.ellipsoideus NiR (Ni 7mM) x S.cerevisiae SMR4 CdR (Cd 0.8 mM)

H.polymorpha NiR (Ni 7mM) x H.anomala CdR (Cd 0.8mM)

Experimentul necesită parcurgerea mai multor etape: A. Izolarea de protoplaşti

În această etapă se urmăreşte izolarea de protoplaşti pentru fiecare dintre tulpinile de drojdii menţionate mai sus. Tulpinile se cultivă în mediu YPG, 16 ore la 30oC, cu agitare. 1.5 ml cultură se centrifughează 5 minute la 6000 rpm. Sedimentul celular se resuspendă în 500 μl Tris-HCl 0.05 M (pH 7.5). Se adaugă: 500 μl soluţie (KCl 1.2M + MgSO4 0.02M) şi 10 μl β- mercaptoetanol (β−mercaptoetanolul porează peretele celular al drojdiilor, iar soluţia de KCl + MgSO4 este stabilizator osmotic). Tuburile se agită timp de 15 min.

a b c

d e Fig. 6.11. Aspectul celulelor de drojdie în timpul protoplastizării, fuziunii si reversiei protoplaştilor

a. ultrastructura celulei de S. cerevisiae (25000 x); b. ultrastructura protoplaştilor de S. cerevisiae (24600 x) ; c. aglutinări ale protoplaştilor de S. cerevisiae induse de PEG în prezenţa Ca2+ (20500 x) ; d. diferenţierea unor punţi citoplasmatice între

protoplaşti adiacenţi la S. cerevisiae (31500 x) ; e. aspectul celulelor de S. cerevisiae după reversia protoplaştilor (17600 x).

Se centrifughează 5 minute la 6000 rpm, iar sedimentul celular se resuspendă în 750 μl soluţie KCl 1.2M + MgSO4 0.02M. Se adaugă 500 μl soluţie zymolyază (soluţie stoc 2mg/ml) pentru distrugerea peretelui celular. Se incubează 1 oră la 37oC cu agitare. La sfârşitul acestei etape se obţin protoplaşti de drojdii. Se centrifughează probele 5 minute la 6000 rpm, iar sedimentul celular se resuspendă în 1 ml soluţie KCl 1.2 M + MgSO40.02M.

B. Fuziunea protoplaştilor şi regenerarea produşilor de fuziune: 1 ml suspensie protoplaşti A (obţinuţi în etapa anterioară) se amestecă cu 1 ml suspensie

protoplaşti B. Amestecul se centrifughează 5 minute la 5000 rpm. Sedimentul se resuspendă în 1.5 ml soluţie ce conţine 1.34 ml PEG 6000 concentraţie 40% şi 0.16 ml soluţie CaCl2 0.1M. Probele se ţin 10 minute la 20oC, iar 100 μl suspensie se însamânţează pe plăci Petri cu mediu de regenerare (YPG + KCl 0.6 M, topit şi răcit la 44oC).

13

116116170 cap6 ing gen drojdii

Documents